专利名称：通过种间核移植制备胚胎细胞或干细胞样细胞系的制作方法
1.发明领域本发明涉及通过将来源于动物或人细胞的细胞核移植入不同于供体核种类的其它动物之去核卵母细胞以制备胚胎细胞或干细胞样细胞。本发明更特别地涉及通过将人细胞核移植入一种去核动物卵母细胞，优选地为一种有蹄动物卵母细胞，最优选地为一种牛去核卵母细胞以制备人类胚胎细胞或干细胞样细胞。
本发明还涉及所得胚胎细胞或干细胞样细胞，优选为人胚胎细胞或干细胞样细胞的治疗和诊断用途，以及同样用于治疗和诊断的分化细胞的制备，转基因胚胎细胞或转基因分化细胞、细胞系、组织或器官的制备。另外，根据本发明获得的胚胎细胞或干细胞样细胞本身可以作为核移植或核转移方法中的核供体。
2.发明背景从早期前移植鼠胚胎体外衍生胚胎干细胞(ES)系的方法是公知技术。(参见例如，Evans等，自然29154-156(1981)；Martin，美国国家科学院学报787634-7638(1981))。假设存在成纤维细胞饲喂层(Evans等，同前)或分化抑制源(Smith等，发育生物学1211-9(1987))，ES细胞可以未分化状态传代。
先前报导过ES细胞具有多种用途。例如，据报导ES细胞可用作体外分化模型，特别是用于参与早期发育调控基因的研究。鼠ES细胞导入前移植鼠产生种系嵌合体，从而表现它们的多能性。(Bradley等，自然309255-256(1984))。
就其向下一代转移基因组的能力而言，通过使用带有或不带有期望的遗传修饰的ES细胞，ES细胞可用于对牲畜进行种系改良。另外，对牲畜而言，例如有蹄动物，来源于如前移植牲畜胚胎的细胞核支持去核卵母细胞发育至足月(Smith等，生物繁殖401027-1035(1989)；Keefer等，生物繁殖50935-939(1994))。这与来源于超过八细胞期的鼠胚胎的细胞核据报导转移后不能支持去核卵母细胞的发育相反(Cheong等，生物繁殖48958(1993))。因此，由于来源于牲畜的ES细胞颇受欢迎，因为它们可以提供潜在的全能供体细胞核的来源，在进行遗传操纵或其它处理后以用于核转移过程。
一些研究小组已经报导分离所谓多能胚胎细胞系。例如，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.43255-260(1991)，报导由猪和绵羊胚泡建立稳定、多能细胞系，该猪和绵羊胚泡显示与从绵羊胚泡由免疫切除法分离到的内细胞群(ICM)的原代培养物细胞相似的某些形态和生长特性(同前)。Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.4151-56(1990)也公开了从猪胚泡得到的推测为多能胚胎细胞系培养物的维持和分化。另外，Gerfen等，动物生物技术，6(1)1-14(1995)公开了来自猪胚泡的胚胎细胞系的分离。这些细胞稳定地维持在鼠胚胎成纤维细胞饲喂层，无须条件培养基的使用。据报导这些细胞在培养过程中分化形成几种不同细胞类型(Gerfen等，同前)。
还有Saito等，Roux′s Arch.Dev.Biol.201134-141(1992)报导培养的牛胚胎干细胞样细胞系经三次传代仍存活，但第四次传代后死亡。同时还有，Handyside等，Roux′s Arch.Dev.Biol.，196185-190(1987)公开了免疫切除法分离的绵羊胚胎内细胞群在允许来源于鼠ICM的鼠ES细胞系得以分离的条件下的培养。Handyside等(1987)(同前)报导该条件下，绵羊ICM附着、扩散和增殖了ES细胞样细胞和内胚层样细胞，但之后延长培养仅可见内胚层样细胞。(同前)最近，Cherny等，动物生殖学，41175(1994)报导多能牛原生殖细胞来源的细胞系以长期培养方式维持。这些细胞培养约七天后，产生ES样集落，其对碱性磷酸酶(AP)染色呈阳性，表明形成胚状体的能力，并且自发分化形成至少两种不同的细胞类型。据报导这些细胞也表达转录因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，一种认为由ES细胞专门表达的同源框基因模式。
同样是最近，Campbell等，自然，38064-68(1996)报导在促进鼠中ES细胞系分离的条件下，培养的来自第九天羊胚胎的胚盘(ED)细胞进行核转移后产生活的小羊。作者断定基于他们的结果来自第九天羊胚胎的ED细胞进行核转移具有全能性，并在培养中保持全能性。
Van Stekelenburg-Hamers等，Mol.Reprod.Dev.，40444-454(1995)报导来源于牛成纤维细胞内细胞群细胞的永久细胞系的分离和表征。作者分离并在不同条件下培养了来自八天或九天牛成纤维细胞的ICM以确定哪种饲喂细胞和培养基对维持牛ICM细胞附着和生长最有效。他们断定基于他们的结果，通过使用STO(鼠成纤维细胞)饲喂细胞(代替牛子宫上皮细胞)并使用添加活性炭脱色血清(而不是正常血清)的培养基可以增强培养的ICM细胞的附着和生长。然而VanStekelenburg等报导他们的细胞系类似上皮细胞而不是多能ICM细胞。(同前)另外，Smith等，WO94/24274，1994年10月27日公开，Evans等，WO90/03432，1990年4月5日公开，和Wheeler等，WO94/26889，1994年11月24日公开的专利，报导了动物干细胞的分离、选择和增殖，该干细胞据称可以用于获得转基因动物。Evans等，WO90/03432，1990年4月5日公开，也报导了认为对生产转基因动物有用的来源于猪和牛的所谓多能胚胎干细胞的诱导。另外，Wheeler等，WO94/26884，1994年11月24日公开，披露了认为对生产嵌合有蹄动物和转基因有蹄动物有用的胚胎干细胞。因此，基于上述，很明显许多课题组试图制备ES细胞系，例如，因为它们在制备克隆胚或转基因胚以及核移植过程中的应用潜能。
有蹄动物ICM细胞在核移植中的应用也有报导。例如，Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)公开了通过将裂解的供体细胞显微注射到去核成熟卵母细胞中实现牛ICM核移植的方法。参考文献公开了体外培养胚七天产生十五个成纤维细胞，其经转移到牛受体中后，导致四次怀孕和两次分娩。同样，Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994)也公开了牛ICM细胞作为核转移过程供体细胞核的应用，以产生成纤维细胞，其经移植入牛受体后，得到几个活的后代。另外，Sims等，美国国家科学院学报，906143-6147(1993)公开了通过来自一体外短期培养的牛ICM细胞的细胞核转移到去核成熟卵母细胞生产小牛的方法。
同样报导了培养的胚盘细胞核转移后生产活的小羊的方法(Campbell等，自然，38064-68(1996))。同样也报导了牛多能胚胎细胞在核转移和生产嵌合胎牛中的用途(Stice等，生物繁殖，54100-101(1996))；Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)。
以前也曾试图制备种间核转移(NT)单元(Wolfe等，动物生殖学，33350(1990))。尤其是牛胚胎细胞与野牛卵母细胞融合产生一些可能具有内细胞群的种间NT单元。然而核转移过程中使用了胚胎细胞而不是成体细胞作为供体细胞核。普遍认为胚胎细胞比成体细胞易于重新调控。这要追溯于对蛙的早期NT研究(DiBerardino综述，分化，1717-30(1980))。该研究也涉及系统发生上非常相似的动物(牛细胞核和野牛卵母细胞)。相比较而言，以前NT过程中融合十分不同的动物(牛细胞核转移到仓鼠卵母细胞中)，不能得到内细胞群结构。而且，以前从未报导过来源于NT单元的内细胞群细胞可以用于形成可增殖的ES细胞样集落。
Collas等(同前)也指明了粒细胞(成体体细胞)在制备牛核转移胚中的应用。然而，与本发明不同，这些实验没有涉及种间核转移。并且与本发明不同，没有获得ES细胞样集落。
因此，虽然以前文献已经报导过此类研究，仍然有必要改进制备胚胎细胞或干细胞样细胞的方法。特别是有必要制备具有明显治疗和诊断作用的人胚胎细胞或干细胞样细胞。
关于这方面，已确定可以通过细胞移植治疗很多人类疾病。例如，帕金森病是由黑质中的多巴胺能神经元的退化导致。帕金森病的一般治疗方法是服用L-DOPA，它能暂时改善多巴胺的缺失，但产生严重的副作用，最终不能逆转疾病的进程。认为对治疗一些脑疾病和中枢神经系统损伤具有广阔应用前景的治疗帕金森病的另一种方法，是将胎儿或初生动物的细胞或组织移植入成人脑中。来自不同脑区的胎神经元可以被掺入成人脑。这种移植在实验室动物中显示缓解了实验诱导性行为缺陷，包括复杂的认知功能。来自人类临床实验的初步结果也令人鼓舞。然而，获自流产胎儿的人胎儿细胞或组织十分有限。而且，自流产胎儿得到细胞或组织存在很大争议。
目前没有制备来自病人的“胎样”细胞的方法。而且，不容易得到同种移植组织，并且同种异体移植组织和异种移植组织都易于产生移植排斥。另外，在一些情况下，移植前进行细胞或组织的遗传修饰是有益的。然而，一些需要进行这种修饰的细胞或组织在培养中不能良好分裂，而遗传转化的大多数细胞需要快速分裂的细胞类型。
因此，本领域的确需要提供用于移植以及细胞和基因治疗的未分化的人胚胎细胞或干细胞样细胞。
发明目的本发明目的在于提供制备胚胎细胞或干细胞样细胞的新的改进的方法。
本发明目的特别在于提供制备胚胎细胞或干细胞样细胞的新方法，包括将哺乳动物或人细胞的细胞核移植入不同种的去核卵母细胞。
本发明的另一个特别目的在于提供制备人胚胎细胞或干细胞样细胞的新方法，包括将人细胞核移植入去核动物卵母细胞，优选为有蹄去核动物卵母细胞。
本发明的又一目的在于提供制备人胚胎细胞或干细胞样细胞的新方法，包括将人细胞例如，人成体细胞的细胞核移植入人去核卵母细胞。
本发明的又一目的在于通过将动物或人细胞的细胞核移植入不同种的去核卵母细胞制备胚胎细胞或干细胞样细胞。
本发明的另一个特别目的在于通过将人细胞的细胞核移植入去核动物卵母细胞，优选为有蹄去核动物卵母细胞，制备人胚胎细胞或干细胞样细胞。
本发明的另一个目的在于使用这种胚胎细胞或干细胞样细胞用于治疗或诊断。
本发明的一个特别目的在于使用这种人胚胎细胞或干细胞样细胞治疗或诊断一些通过细胞、组织或器官移植能有效治疗或诊断的疾病。
本发明的另一个特别目的在于使用按照本发明制备的胚胎细胞或干细胞样细胞制备分化的细胞、组织或器官。
本发明的一个特别目的在于使用按照本发明制备的人胚胎细胞或干细胞样细胞制备分化的人细胞、组织或器官。
本发明的另一个特别目的在于使用按照本发明制备的胚胎细胞或干细胞样细胞制备基因工程胚胎细胞或干细胞样细胞，其中该细胞可以用于制备例如，在基因治疗中使用的基因工程的或转基因分化的人细胞、组织或器官。
本发明的另一个特别目的在于体外使用按照本发明制备的胚胎细胞或干细胞样细胞，例如，用于细胞分化研究和检测目的(例如药物研究)。
本发明的另一个目的在于提供移植治疗的改进方法，包括从按照本发明制备的胚胎细胞或干细胞样细胞产生的等基因的或同源细胞、组织或器官的使用。该治疗包括(以举例的方式)疾病和损伤的治疗，包括帕金森病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、ALS、脊髓损伤、多发性硬化、肌萎缩、糖尿病、肝病、心脏病、软骨置换、灼伤、血管疾病、泌尿道疾病、以及免疫缺陷、骨髓移植、癌症和其它疾病的治疗。
本发明的另一个目的在于使用按照本发明制备的转基因或基因工程胚胎细胞或干细胞样细胞用于基因治疗，特别用于治疗和/或防止上述疾病和损伤。
本发明的另一个目的在于使用按照本发明制备的胚胎细胞或干细胞样细胞或者按照本发明制备的转基因或基因工程胚胎细胞或干细胞样细胞作为核移植中的核供体。
对于本发明上述以及其它目的之优点和特征将在下文描述，本发明的特征通过参考下面对本发明优选实施例和所附权利要求的详细叙述而更易于理解。
附图简介
图1是通过成体人细胞转移到去核牛卵母细胞产生的核转移(NT)单元的照片。
图2-5是来源于(例如图1描述的)NT单元的胚胎干细胞样细胞的照片。
发明详述本发明提供制备胚胎细胞或干细胞样细胞的新方法，特别是通过核转移或核移植制备人胚胎细胞或干细胞样细胞。本申请中，核转移或核移植或NT可替换使用。
如上所述，通过核转移或核移植分离胚胎细胞或干细胞样细胞尚未曾报导。然而，以前报导过从受精胚胎分离ES样细胞。涉及遗传上不同种属的细胞或DNA，或者更特别的涉及一种生物成体细胞或DNA和另一种生物卵母细胞的成功的核转移也从未曾报导。基于申请人的认识，也从未曾报导过用于在组织培养中制备人胚胎细胞或干细胞样细胞的方法。然而，目前可用的有限的人胎儿细胞和组织必须通过自然流产组织和堕胎儿获得。
在本发明以前，也没有人通过种间核移植获得胚胎细胞或干细胞样细胞。
本发明人出乎意料地发现可以通过将人细胞(例如成体分化的人细胞)的细胞核移植入用于制备核转移(NT)单元的去核动物卵母细胞获得人胚胎细胞或干细胞样细胞以及细胞集落，这种细胞培养后产生了人胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞集落。这一结果非常令人惊讶，因为它首次证明了有效的种间核移植，即，自动物或人细胞(例如，成体细胞)的细胞核移植入不同种动物的去核卵，以制备核转移单元，其包含在合适培养条件下培养产生胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞集落的细胞。
优选地，用于制备ES样细胞的NT单元培养到至少2-400个细胞，优选地4-128个细胞，且最优选地至少约50个细胞的大小。
本发明中，胚胎细胞或干细胞样细胞指按照本发明制备的细胞。本发明指的这种细胞是干细胞样细胞而不是干细胞，因为其是通过种间核转移方式制备的。虽然期望这些细胞拥有同正常干细胞一样的分化能力，但由于其制备方式它们可能具有一些不明显的差异。例如，这些干细胞样细胞可能具有用于核转移的卵母细胞的线粒体。
本发明基于成体人细胞特别是获自人供体口腔的人上皮细胞的细胞核进行核移植的观察，当该细胞核转移到去核牛卵母细胞，导致核转移单元的形成，这些细胞经培养会产生人干细胞样细胞或胚胎细胞和人胚胎细胞或干细胞样细胞集落。本发明人推测牛卵母细胞和人卵母细胞必须经历熟化过程，以使它们足够相似从而允许牛卵母细胞作为人卵母细胞的有效取代或替代物行使功能。
基于人细胞核可被有效移植入牛卵母细胞的事实，可以预期人细胞可移植入其它物种例如其它有蹄动物以及其它动物的卵母细胞。其它有蹄动物的卵母细胞尤其合适，例如，猪、绵羊、马、山羊等。其它来源的卵母细胞也适用，例如，来源于其它灵长类动物、两栖动物、啮齿动物、兔类等的卵母细胞。而且，使用类似的方法，可以将人细胞或细胞核转移到人卵母细胞中。
因此，在最广泛的实施例中，本发明涉及通过注射或融合，将动物或人细胞核或是动物或人细胞移植入与供体核不同种动物的去核卵母细胞，产生包含可以用于获得胚胎细胞或干细胞样细胞和/或细胞培养物的细胞的NT单元。例如，本发明可以涉及通过注射或融合将有蹄动物细胞核或有蹄动物细胞移植入其它物种例如另一种有蹄动物或非有蹄动物的去核卵母细胞中，所述细胞和/或细胞核被混合以产生NT单元，且在适于获得多细胞NT单元，优选地含至少约2-400个细胞，更优选为4-128个细胞，最优选为至少约50个细胞的条件下培养。该NT单元的细胞经培养后可以用于制备胚胎细胞或干细胞样细胞或细胞集落。
本发明的优选实施例包括通过将供体人细胞核或人细胞移植入去核动物卵母细胞，优选为有蹄动物卵母细胞，最优选为牛去核卵母细胞中，制备人胚胎细胞或干细胞样细胞。
通常，胚胎细胞或干细胞样细胞通过以下步骤的核转移程序制备
(i)获得所需的用作核供体来源的人或动物细胞；(ii)从合适来源例如哺乳动物和最优选的有蹄动物(例如牛)获得卵母细胞；(iii)将所述卵母细胞去核；(iv)将人或动物细胞或细胞核通过例如融合或注射转移到不同于供体细胞或细胞核的其它动物的去核卵母细胞中；(v)培养所得的NT产物或NT单元以制备多细胞结构；且(vi)培养获自所述胚的细胞以制备胚胎细胞或干细胞样细胞和干细胞样细胞集落。
核转移技术或核移植技术在文献中已有描述，本发明背景引用的一些参考文献也有描述。特别参见，Campbell等，动物生殖学，43181(1995)；Collas等，Mol.Report.Dev.，38264-267(1994)；Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994)；Sims等，美国国家科学院学报，906143-6147(1993)；WO 94/26884；WO 94/24274；和WO 90/03432，此处全文引入作为参考文献。美国专利4944384和5057420也描述了牛核移植的方法。
通过公知的方法可以获得人或动物细胞。用于本发明的人和动物细胞包括(通过举例的方式)上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单细胞、单核细胞、成纤维细胞、心肌细胞和其它肌细胞等。而且，用于核转移的人细胞可以从不同器官获得，例如，皮肤、肺、胰、肝、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾、尿道和其它泌尿器官等。它们仅是合适供体细胞的例子。合适的供体细胞，即本发明中有用的细胞可以从躯体的任何细胞和器官获得。包括所有体细胞和生殖细胞。
下面的实施例中，用作核转移供体的细胞是来源于人供体口腔的上皮细胞。然而，如上所述，公开的方法适用于其它人细胞或细胞核。而且，细胞核可以从人体细胞和生殖细胞获得。
用于核转移的卵母细胞可以获自动物包括哺乳动物和两栖动物。卵母细胞的合适哺乳动物细胞源包括绵羊、牛、羊、猪、马、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、灵长类动物等。在优选实施例中，卵母细胞获自有蹄动物，最优选为牛。
分离卵母细胞的方法为本领域公知技术。该方法基本上是从哺乳动物或两栖动物(例如牛)的卵巢或生殖道分离卵母细胞。屠宰场的材料是获得牛卵母细胞方便来源。
为成功使用例如基因工程技术、核转移和克隆技术，卵母细胞在用作核转移的受体细胞和被精子细胞受精形成胚之前通常需要体外熟化。这一过程通常需要从动物卵巢例如于屠宰场获得的牛卵巢中收集非成熟(分裂前期I)卵母细胞，受精或去核之前在熟化培养基中熟化卵母细胞，直到卵母细胞到达分裂中期II期，其对于牛卵母细胞通常发生在抽出后约18-24小时。用于本发明中，这一时间称为“熟化期”。本文为计算时间使用的“抽出”指从卵巢的卵泡中抽出非成熟卵母细胞。
另外，已在体内成熟的分裂中期II期的卵母细胞也已成功地用于核转移技术。基本上，从非超排卵或超排卵母牛或开始发情35到48小时的年轻母牛或注射人绒膜促性腺激素(hCG)或类似激素后的年轻母牛分离收集成熟的分裂中期II期的卵母细胞。
曾报导去核和核转移过程中卵母细胞的成熟期是NT方法是否成功的关键(参见，例如，Prather等，分化，481-8，1991)。通常，成功的哺乳动物胚胎克隆方法使用分裂中期II期的卵母细胞作为受体卵母细胞，因为认为处于该期的卵母细胞可以被有效活化以至于能够以接受类似受精精子的方式对待导入的细胞核。家养动物尤其是牛中，卵母细胞的活化期通常约为16-52小时，优选地是抽出后约28-42小时。
例如，可以如Seshagine等，生物生殖，40，544-606，1989描述的，用HEPES缓冲的仓鼠胚培养基(HECM)冲洗非成熟卵母细胞，然后置于含10％胎牛血清并含适量促性腺激素例如黄体生成素(LH)和卵泡刺激激素(FSH)和雌二醇的50微升组织培养基(TCM)199中，上封一层轻质石蜡或硅油，39℃保温。
熟化一定时间后(该成熟期范围约10-40小时，优选地约16-18小时)卵母细胞去核。去核之前卵母细胞最好在细胞丘去除之前移至每毫升含1毫克透明质酸酶的HECM中。这可以通过极细内径吸管反复抽吸或简单地旋涡振荡实现。然后筛选分离到的卵母细胞的极性体，由存在极性体确定的分裂中期II期卵母细胞用于核转移。接着去核。
去核可以通过已知方法进行，例如美国专利No.4994384的描述，此处引入本文作为参考。例如，分裂中期II期卵母细胞既可以置于任选地每毫升含7.5毫克松胞菌素B的HECM中用于立即去核，也可以置于合适培养基，例如添加10％发情母牛血清的CR1aa中，然后去核，优选地不超过24小时后，更优选地不超过16-18小时。
去核可以通过显微手术用微吸管除去极性体和周围的胞浆实现。然后筛选卵母细胞确定其中已被成功去核的细胞。这种筛选可以通过用每毫升含1微克33342 Hoechst染料的HECM染色，然后紫外线下观察卵母细胞少于10秒来完成。已成功去核的卵母细胞可被置于合适培养基中，例如，添加10％血清的CR1aa。
本发明中，受体卵母细胞优选地在体外熟化开始后约10到约40小时之间，更优选约16到约24小时，最优选约16到约18小时去核。
然后将与去核卵母细胞异源的单动物细胞或人细胞转移到用于制备NT单元的去核卵母细胞的卵周隙。动物或人细胞和去核卵母细胞将用于按照本领域已知方法制备NT单元。例如，可以用电融合方法融合细胞。由提供足以使得细胞质膜短暂崩解的电脉冲实现电融合。因为膜迅速重新形成，细胞质膜的崩解非常短暂。实质上，如果诱导两个邻近膜崩解并重新形成互相掺和的脂质双分子层，两个细胞之间的小通道将打开。由于该小通道的热力学不稳定性，它将扩大直到两个细胞融合成一个。参见Prather等的美国专利4997384(此处全文引入作为参考)进一步讨论了该方法。可以使用很多电融合介质，包括例如，蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸盐缓冲液。也可以使用仙台病毒作为融合剂实现融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。
一些条件下(例如，用小供体核)，优选的直接将核注射到卵母细胞而不是用电穿孔融合。Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)公开了这种技术(此处全文引入作为参考)。
优选的，人或动物细胞和卵母细胞在开始熟化约24小时后在500μm的小室中使用90-120V的电脉冲约15微秒进行电融合。融合后，产生的融合NT单元置于合适培养基例如CR1aa培养基直到活化。典型的活化将在其后较短时间内完成，一般不超过24小时，优选的约为之后4-9小时。
可以用已知方法活化NT单元。该方法包括，例如，在亚生理温度培养NT单元，实际上使用冷或者低温刺激NT单元。通过室温培养NT单元可最为方便地操作，其相对于胚正常的生理温度条件而言属于低温。
另外，可以使用已知的活化剂实现活化。例如，已表明受精过程精子穿透卵母细胞可以活化预融合的卵母细胞，以在核转移后产生更大量的有效受孕和多个遗传上相同的小牛。融合后的处理例如电休克和化学休克也可以用于活化NT胚。美国专利No.5496720(Susko-Parrish等)的目的即为提供合适的卵母细胞活化方法。
另外，可以同时也可以顺次完成活化(i)增加卵母细胞中二价阳离子的水平，且(ii)降低卵母细胞中细胞蛋白质的磷酸化。
这通常由将二价阳离子(例如，镁、锶、钡或钙，例如，以离子载体的形式)导入卵母细胞细胞质完成。其它增加二价阳离子水平的方法包括使用电休克、用乙醇处理和用笼状螯合剂处理。
可以用已知方法降低磷酸化，例如，添加激酶抑制剂，例如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如，6-二甲基-氨基-嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。
另外，通过向卵母细胞导入磷酸酶例如磷酸酶2A和磷酸酶2B也可以抑制细胞蛋白质的磷酸化。
优选实施例中，融合后24小时内，优选融合后约4-9小时内将融合的NT单元短暂接触含5μM离子霉素和1mg/ml BSA的TL-HEPES培养基，随后用含30mg/ml BSA的TL-HEPES冲洗，实现NT的活化。
然后，活化的NT单元可以培养在合适的体外培养基中直到产生胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞集落。培养和熟化胚胎的合适培养基是本领域已知的。可以用于牛胚胎培养和维持的已知培养基的例子包括，Ham′sF-10+10％胎牛血清(FCS)、组织培养基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、Tyrodes-白蛋白-乳酸盐-丙酮酸盐(TALP)、Dulbecco′s磷酸缓冲盐液(PBS)、Eagle′s和Whitten′s培养基。用于收集和熟化卵母细胞的最常用的培养基之一是TCM-199，且添加1％-20％的血清，包括胎牛血清、新生儿血清、发情母牛血清、小羊血清或阉牛血清。优选的维持培养基包括含带有Earl盐、10％胎牛血清、0.2MM Ma丙酮酸盐和50μg/ml硫酸艮他霉素的TCM-199。上述的任一种也可以包括与不同细胞类型的共培养，例如粒细胞、输卵管细胞、BRL细胞和子宫细胞和STO细胞。
Rosenkrans，Jr.等的美国专利5096822(此处引入作为参考)描述了另一种维持培养基。该称为CR1的胚胎培养基包含支持胚胎所必需的营养物质。
CR1含有量为1.0mM到10mM的L-乳酸半钙，优选为1.0-5.0mM。L-乳酸半钙是半钙盐与L-乳酸盐组合形成。L-乳酸半钙是满足培养基两个重要需要的典型单组分(i)满足压紧和细胞骨架排列的钙需要(ii)满足代谢和电子运输的乳酸盐需要。L-乳酸半钙也作为胚胎存活必需培养基的重要的矿质和能量源。
CR1培养基的优点是不含血清，例如胎牛血清，不需要使用动物细胞共培养物或其它生物培养基，即，含动物细胞例如输卵管细胞的培养基。生物培养基有时也有缺点，它们也许含有可能对胚胎有害的难以检测、定性和消除的微生物或痕量因子。
CR1培养基中主要成分的例子包括L-乳酸半钙、氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠和少量无脂肪酸的牛血清白蛋白(Sigma A-6003)。另外，可以加入培养基一定量必需和非必需氨基酸。加入氨基酸的CR1简称为″CR1aa″。
CR1培养基优选的包含下述量的下述成分氯化钠 --114.7mM氯化钾 --3.1mM碳酸氢钠 --26.2mML-乳酸半钙--5mM无脂肪酸的BSA --3mg/ml优选实施例中，活化的NT胚胎单元置于含1.9mM DMAP的CR1aa培养基约4小时，随后在HECM中漂洗，然后在含BSA的CR1aa中培养。
例如，活化的NT单元可以转移到含2.0mM DMAP(Sigma)的CR1aa培养基中，培养环境条件为，例如，约38.5℃，5％CO2培养一定时间，例如，约4-5小时。
之后，优选地清洗培养的NT单元，然后置于合适培养基，例如，放置在含10％FCS和6mg/ml的CR1aa培养基，优选地含合适生长程度的饲喂层的孔板中。合适饲喂层包括(以举例的方式)，成纤维细胞和上皮细胞，例如，来源于有蹄动物的成纤维细胞和子宫上皮细胞、鸡成纤维细胞、鼠(如小鼠或大鼠)成纤维细胞、STO和SIm220饲喂细胞系和BRL细胞。
优选实施例中，饲喂细胞包括鼠胚胎成纤维细胞。合适成纤维细胞饲喂层的制备方法在下面的实施例中描述，并且它已为普通技术人员公知。
NT单元培养在饲喂层上直到其达到可以用于制备胚胎干细胞样细胞或细胞集落的合适的大小。优选地，这些NT单元培养至至少约2-400个细胞，更优选为约4-128个细胞，最优选至少约50个细胞。在合适条件下进行培养，即约38.5℃，5％CO2，为最适于生长最好约每2-5天更换一次培养基，优选地约每3天更换一次。
对于人细胞/去核牛卵母细胞形成的NT单元，在卵母细胞开始活化后约12天得到制备ES细胞集落的足够细胞，一般约为50个细胞。然而，这可能依用作细胞核供体的特定细胞、特定物种的卵母细胞和培养条件而变化。基于培养的NT单元的形态，本领域技术人员可以容易地观察确定是否已经得到所需的足够数量的细胞。
得到所需足够数量NT单元后，从该区机械性地转移细胞，用于制备胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞系。该操作优选地取含NT单元(一般含至少约50个细胞)的细胞簇，清洗这些细胞，将这些细胞在饲喂层例如，辐照过的成纤维细胞上铺板。典型地，用于制备干细胞样细胞或细胞集落的细胞从培养的NT单元(优选地至少约50个细胞)的最中间部分获得。然而，较小或较大的NT单元以及NT单元的其它部分的细胞也可用于获得ES样细胞和细胞集落。细胞在饲喂层和合适生长培养基(例如，添加10％FCS、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的αMEM)上维持生长。以最适于生长的需要更换生长培养基，例如，约每2-3天更换一次。
此培养过程导致胚胎细胞或干细胞样细胞或细胞系的形成。对于人细胞/牛卵母细胞衍生的胚胎，在αMEM培养基中培养约第二天观察到集落。然而，这一时间可依特定的核供体细胞、特定的卵母细胞和培养条件而变化。本领域技术人员可以按照适于特定胚胎细胞或干细胞样细胞生长的需要改变培养条件。
获得的胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞集落一般呈现与用作核供体细胞的物种而不是提供卵母细胞的物种的胚胎细胞或干细胞样细胞相似的外观。例如，对于由转移人供体细胞核到去核牛卵母细胞获得的胚胎细胞或干细胞样细胞，细胞表现的形态更类似鼠胚胎干细胞而不是牛ES样细胞。
更特别的是，人ES系细胞集落的单独细胞无明显界限，仅发现集落周边折光且表面光滑。而且细胞集落的倍增时间较长，约为鼠ES细胞倍增时间的两倍。另外，与来自牛和猪的ES细胞不同，该集落不具有上皮样外观。
产生的胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞系，优选为人胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞系，具有很多治疗和诊断应用。更特别的，这种胚胎细胞或干细胞样细胞可以用于细胞移植治疗。人胚胎细胞或干细胞样细胞可应用在很多病况的治疗中。
在这点上，公知鼠胚胎干(ES)细胞能够分化成几乎任一类型的细胞型，例如，造血干细胞。因此，按照本发明制备的人胚胎细胞或干细胞样细胞应该具有相似的分化能力。本发明的胚胎细胞或干细胞样细胞将按照已知方法被诱导分化以便获得希望的细胞类型。例如，在分化培养基中以及提供细胞分化的条件下培养目标人胚胎细胞或干细胞样细胞，其可以被诱导分化形成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、泌尿道细胞等。导致胚胎干细胞分化的合适的培养基和方法及合适的培养条件已为本领域公知。
例如，Palacios等，美国国家科学院学报，927530-7537(1995)讲述了使用诱导程序处理干细胞从胚胎细胞系制备造血干细胞，该诱导程序包括在不含视黄酸的悬浮培养基中培养该细胞的聚集体，随后在含视黄酸的同样培养基中培养，最后将细胞聚集体转移到能使细胞附着的基质上。
另外，Pedersen，J.Reprod.Fertil.Dev.，6543-552(1994)的综述参考了大量介绍用于胚胎干细胞体外分化以制备多种不同的细胞类型包括造血细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞等方法的文献。
Bain等，Dev.Biol.，168342-357(1995)讲述了胚胎干细胞体外分化以制备具有神经元性质的神经细胞。这些参考文献是从胚胎细胞或干细胞样细胞获得分化细胞的已报导的方法的例子。此处引入这些参考文献，特别是此处公开的其中涉及分化胚胎干细胞方法的文献作为参考。
因此，使用已知的方法和培养基，本领域的技术人员可以培养目标的胚胎细胞或干细胞样细胞以获得希望的分化细胞类型，例如，神经细胞、肌细胞、造血细胞等。
目标胚胎细胞或干细胞样细胞可以用于获得任何希望的细胞类型。该分化人细胞的治疗用途无可比拟。例如，人造血干细胞可以用于需要骨髓移植的治疗中。该方法可被用于治疗很多疾病，例如晚期癌症例如卵巢癌和白血病，以及包括免疫系统疾病例如AIDS的疾病。可通过例如，癌症或AIDS病人的成体体细胞例如上皮细胞或淋巴细胞与去核卵母细胞例如牛卵母细胞融合，以获得上述的胚胎细胞或干细胞样细胞，并在利于分化的条件下培养该细胞，直到获得造血干细胞。这种造血细胞可以用于治疗包括癌症和AIDS等疾病。
或者，神经性紊乱的病人的成体体细胞与去核动物卵母细胞例如牛卵母细胞融合，获得人胚胎细胞或干细胞样细胞，该细胞在分化条件下培养以制备神经细胞系。用所述人神经细胞移植可以治疗的特定疾病包括(以举例的方式)，帕金森病、阿尔茨海默病、ALS和大脑性麻痹等。帕金森病的特殊病例中，已经证明了移植的胎儿脑神经细胞促成与周围细胞的正确联系并产生多巴胺。这会导致帕金森病症状的长期逆转。
本发明最大的优点在于其可以基本上无限地提供适于移植的同基因的或同源的人细胞。因此，可以避免与目前移植方法有关的重大问题，即，由于宿主对移植体或移植体对宿主的排斥可能导致的移植组织的排斥问题。通常，由使用抗排斥药物例如环胞菌素以防止或减小排斥。然而，这类药物有显著的不良副作用，例如，免疫抑制、致癌作用，并且也非常昂贵。本发明可以避免或者至少大大减少对抗排斥药物的需求。
可以用同基因的细胞治疗的其它疾病和病理症状包括(以举例的方式)，脊髓损伤、多发性硬化、肌萎缩、糖尿病、肝病(即高胆固醇血症)、心脏病、软骨置换、灼伤、足溃疡、胃肠道疾病、血管疾病、肾病、泌尿道疾病以及衰老相关的疾病和症状。
按照本发明制备的人胚胎细胞或干细胞样细胞也可以用于制备基因工程或转基因人分化细胞。基本上可以这样实现，即导入希望的一种或多种基因(可以是异源的)，或者除去按照本发明制备的人胚胎细胞或干细胞样细胞中其全部或部分内源基因，使这种细胞分化成希望的细胞类型。实现这种修饰的优选方法是同源重组，因为该技术可以在干细胞样细胞基因组的一个或一些特定位点插入、缺失或修饰一种或多种基因。
这种方法可以用于替换缺陷基因，例如，缺陷免疫系统基因、囊性纤维化基因，或导入能够表达治疗有效蛋白质的基因，例如生长因子、淋巴因子、细胞因子、酶等。例如，编码脑生长因子的基因可以被导入人胚胎细胞或干细胞样细胞，该细胞分化成神经细胞，分化后的细胞移植给帕金森病病人以延迟该病过程中神经细胞的丢失。
以前曾发现用BDNF转染的细胞类型从原代细胞变为不死细胞系，无论来源于神经细胞还是非神经细胞(成肌细胞和成纤维细胞)。例如，用逆转录病毒载体以BDNF基因转染的星形细胞，且该细胞移植入帕金森疾病的大鼠模型(Yoshimoto等，脑研究，69125-36，(1995))。
在转移后32天，这种离体治疗在多达45％的大鼠中减少了帕金森样症状。酪氨酸羟化酶基因也被导入星形细胞并产生类似的结果(Lundberg等，神经发育，13939-53(1996)和其中引用的参考文献)。
然而，该离体系统还存在问题。尤其是，目前使用的逆转录病毒载体在体内被下调，转基因仅得到瞬时表达(Mulligan综述，科学，260926-932(1993))。这种研究中也使用了原代细胞，星形细胞，其生命周期有限且复制缓慢。这种性质对转染率不利，并妨碍稳定转染的细胞的筛选。而且，大量增殖用于同源重组技术中的基因靶向的原代细胞几乎是不可能的。
相反，与逆转录病毒系统有关的困难通过使用人胚胎细胞或干细胞样细胞可以消除。该项目代理人以前曾论证牛和猪胚胎细胞系可以被转染并可以用于筛选异源DNA的稳定整合体。1996年4月1日提交的申请号为U.S.No.08/626054的专利描述了该方法，全文引入作为参考。因此，使用该方法或其它已知方法，可以将所需基因导入目标人胚胎细胞或干细胞样细胞，使细胞分化成希望的细胞类型，例如，造血细胞、神经细胞、胰细胞、软骨细胞等。
可被导入目标胚胎细胞或干细胞样细胞的基因包括(以举例的方式)，表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、源于胶质的神经营养生长因子、胰岛素样生长因子(I和II)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4/5、睫状神经营养因子、AFT-1、细胞因子基因(白介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子(α和β)等)、编码治疗酶的基因等。
目标胚胎细胞或干细胞样细胞，优选地人细胞，也可以用作体外分化模型，特别是用于涉及早期发育调节的基因研究。
利用目标胚胎细胞或干细胞样细胞的分化细胞组织和器官也可用于药物研究。
另外，目标胚胎细胞或干细胞样细胞可以用作制备其它胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞集落的核供体。
提供下列实施例以更清楚地描述本发明。
实施例1材料和方法用于核转移的供体细胞用标准载玻片轻轻刮下志愿成人口腔内部的上皮细胞。用不含Ca或Mg的磷酸缓冲盐液将细胞从载玻片上冲入培养皿。用小内径吸液管抽吸细胞以便打散细胞团形成单细胞悬液。然后将细胞转移到含10％胎牛血清(FCS)的TL-HEPES培养基微滴中，表面油封用以细胞核转移到去核牛卵母细胞中。核转移程序前面曾描述过基本核转移程序。简单的说，即屠宰场的卵母细胞体外熟化后，去除卵母细胞的细胞丘，熟化后约18小时(hpm)用斜面微吸液管去核。在添加双苄亚胺(Hoechst 33342，3μg/ml；Sigma)的TL-HEPES培养基中证实去核。然后将各个供体细胞置入受体卵母细胞的卵周隙空间。牛卵母细胞细胞质和供体核(NT单元)用电融合技术融合。应用90V，15微秒的融合脉冲作用于NT单元。该操作在卵母细胞开始熟化后24小时(hpm)进行。NT单元置于CR1aa培养基直到28 hpm。
其它文章曾描述过人工活化卵母细胞的方法。NT单元的活化在28hpm。活化方法简单描述如下NT单元在添加1mg/ml BSA的TL-HEPES中与离子霉素(5μM；CalBiochem，La Jolla，CA)接触四分钟，然后，在添加30mg/ml BSA的TL-HEPES中漂洗5分钟。随后，NT单元转移到含0.2mM DMAP(Sigma)的CR1aa培养基微滴中，于38.5℃、5％CO2培养四到五小时。清洗NT单元，然后置于添加10％FCS和6mg/ml BSA的CR1aa培养基，放入含鼠胚胎成纤维细胞(如下述)生长至铺满的饲喂层的四个孔板。NT单元于38.5℃和5％CO2下再培养三天。培养基每三天更换一次直到活化后第十二天。此时将达到所需细胞数，即约50个细胞的NT单元机械性地移出该区，用于制备胚胎细胞系。如上述获得的NT单元的照片如图1所示。成纤维细胞饲喂层胚胎成纤维细胞的原代培养物来源于14-16天龄的鼠胎。无菌除去头、肝、心脏和食道后切碎鼠胚胎，在预热的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中37℃保温30分钟。成纤维细胞在组织培养瓶中接种，在添加10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青霉素(100IU/ml)和链霉素(50μl/ml)的α-MEM培养基(Bio Whittaker，Walkersville，MD)中培养。传代后三到四天，胚胎成纤维细胞置于35×10Nunc的培养皿(Baxter Scientific，McGaw Park，IL)辐照。辐照后的成纤维细胞在潮湿并含5％CO2的大气中37℃生长和维持。然后具有一致的细胞单层的培养板用于培养胚胎细胞系。胚胎细胞系的制备清洗如上述获得的NT单元细胞，直接铺在辐照过的饲喂成纤维细胞平板上。这些细胞包括NT单元的内部细胞。细胞在添加10％FCS和0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)的生长培养基αMEM中维持。生长培养基每两到三天更换一次。至培养第二天观察到初始集落。增殖该集落，其表现与以前公开的鼠胚胎干(ES)细胞相似的形态。集落中的个体细胞界限不明显，克隆的周界折光且表观光滑。细胞集落表现比鼠ES细胞慢的细胞倍增时间。与牛和猪形成的ES细胞不同，迄今为止集落没有发现上皮样外观。图2-图5是如上述获得的ES样细胞集落的照片。分化人细胞的制备获得的人胚胎细胞转移到分化培养基上培养，直到获得分化的人细胞类型。
结果表1.人细胞作为NT单元制备和扩增的供体细胞核表1
将形成超过16个细胞结构一种的NT单元在成纤维细胞饲喂层上铺板。该结构附着于饲喂层并开始增殖形成ES细胞样形态的集落(参见，例如，图2)。而且，虽然4-16细胞期的结构未曾试过制备ES细胞集落，但以前曾表明该期细胞可以制备ES或ES样细胞系(鼠Eistetter等人，生长、发育和分化，31275-282(1989)；牛Stice等人，1996)。因此，认为4-16细胞期的NT单元也可以增殖成胚胎细胞或干细胞样细胞和细胞集落。
虽然已参考各种特定材料、方法和实施例描述和说明本发明，应该理解本发明不限于该特定材料、材料的组合和实现该目的的方法。本领域技术人员可以知晓和利用这些细节的许多变化。
权利要求
1.一种制备胚胎细胞或干细胞样细胞的方法，包括下列步骤(i)在适于形成核转移(NT)单元的条件下，在去核动物卵母细胞中插入希望的人或哺乳动物细胞或细胞核，其中该卵母细胞来源于与人或哺乳动物细胞不同的动物种类；(ii)活化所得的核转移单元；(iii)培养所述活化的核转移单元直到超过2细胞发育期；且(iv)培养获自所述培养的NT单元的细胞，以获得胚胎细胞或干细胞样细胞。
2.权利要求1的方法，其中插入去核动物卵母细胞的细胞是人细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述人细胞是成体细胞。
4.权利要求2的方法，其中所述人细胞是上皮细胞或淋巴细胞。
5.权利要求2的方法，其中卵母细胞获自哺乳动物。
6.权利要求5的方法，其中该动物卵母细胞来自有蹄动物。
7.权利要求6的方法，其中所述有蹄动物选自牛、羊、猪、马、capine和水牛。
8.权利要求1的方法，其中去核卵母细胞在去核前被熟化。
9.权利要求1的方法，其中融合的核转移单元通过接触离子霉素和DMAP而活化。
10.权利要求1的方法，其中活化的核转移单元在饲喂层培养物上培养。
11.权利要求10的方法，其中饲喂层包括成纤维细胞。
12.权利要求1的方法，其中第IV步中来自具有16细胞或更多细胞的NT单元的细胞在饲喂细胞层上培养。
13.权利要求12的方法，其中所述饲喂细胞层包括成纤维细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述成纤维细胞包括鼠胚胎成纤维细胞。
15.权利要求1的方法，其中所得的胚胎细胞或干细胞样细胞被诱导分化。
16.权利要求2的方法，其中所得的胚胎细胞或干细胞样细胞被诱导分化。
17.权利要求1的方法，其中融合通过电融合实现。
18.按照权利要求1的方法获得的胚胎细胞或干细胞样细胞。
19.按照权利要求2的方法获得的人胚胎细胞或干细胞样细胞。
20.按照权利要求3的方法获得的人胚胎细胞或干细胞样细胞。
21.按照权利要求4的方法获得的人胚胎细胞或干细胞样细胞。
22.按照权利要求6的方法获得的人胚胎细胞或干细胞样细胞。
23.按照权利要求7的方法获得的人胚胎细胞或干细胞样细胞。
24.按照权利要求16的方法获得的分化的人细胞。
25.权利要求24的分化的人细胞，其选自神经细胞、造血细胞、胰细胞、肌细胞、软骨细胞、泌尿道细胞、肝细胞、脾细胞、生殖细胞、皮肤细胞、肠细胞和胃细胞。
26.一种治疗方法，包括对需要细胞移植治疗的病人施用按照权利要求24的等基因的分化的人细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述细胞移植治疗对治疗下述疾病或病理状况有效帕金森病、亨廷顿舞蹈病、阿尔海默病、ALS、脊髓缺陷或损伤、多发性硬化、肌萎缩、囊性纤维化、肝病、糖尿病、心脏病、软骨缺陷或损伤、灼伤、足溃疡、血管疾病、泌尿道疾病、AIDS和癌症。
28.权利要求26的方法，其中分化的人细胞是造血细胞或神经细胞。
29.权利要求26的方法，其中治疗是治疗帕金森病，分化的细胞是神经细胞。
30.权利要求26的方法，其中治疗是治疗癌症，分化的细胞是造血细胞。
31.权利要求24的分化的人细胞，其包含并表达一种插入的基因。
32.权利要求1的方法，其中在所述胚胎细胞或干细胞样细胞中一种希望的基因被插入、除去或修饰。
33.权利要求32的方法，其中希望的基因编码治疗酶、生长因子或细胞因子。
34.权利要求32的方法，其中所述胚胎细胞或干细胞样细胞是人胚胎细胞或干细胞样细胞。
35.权利要求32的方法，其中通过同源重组除去、修饰或删除希望的基因。
全文摘要
本发明提供了一种将供体细胞核移植入不同于供体细胞物种的去核卵母细胞的核转移的改进方法。产生的细胞核转移单元用于制备等基因的胚胎干细胞,特别是人类等基因的胚胎或干细胞。这些胚胎或干细胞样细胞可用于制备希望的分化细胞和导入、去除或修饰希望的基因,例如在这些细胞基因组的特定位点通过同源重组。这些可能含有异源基因的细胞在细胞移植治疗和体外细胞分化研究中尤其有用。
文档编号A61K35/12GK1230989SQ97198083
公开日1999年10月6日 申请日期1997年7月28日 优先权日1996年8月19日
发明者J·罗伯, J·希贝利, S·L·斯提思 申请人:马萨诸塞大学