RNA- 9。图1为miRNA-9在S种细胞中的相对表达量，可见miRNA-9在化pal-6中的表达量显著高于 Hca-P和化a-F，说明miRNA-9的表达量与小鼠肝癌细胞的恶性程度负相关。
[0034] 实验结果与忍片结果一致，即miRNA-9在不具有转移能力的小鼠肝癌细胞中的表 达量显著高于具有转移能力的小鼠肝癌细胞。
[00巧]实施例2
[0036] 为了寻找miRNA-9的祀基因，通过化rgetScan、Mi畑B等生物信息预测软件找到了 感兴趣的祀基因之一:StSgal 1，将此作为研究对象。StSgal 1是真核细胞生物中高度保守的 一个糖基转移酶，其在糖链上的表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。
[0037] 具体为：将对数期的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、化a-F分别贴壁和悬浮培养在 含有90%DMEM、90%RPMI1640和10%FBS的全培培养基中，在37°C、5%C02的培养条件下培 养24h，收集细胞，分别提取总蛋白质，通过Western blotting实验，证实了S种细胞中 Stegall的表达，结果如图2所示。结果表明Stegall在化a-F的表达量显著高于化pal-6和 Hca-P，StSgal 1在S种细胞中的相对表达量与miRNA-9在S种细胞中的相对表达量存在正 确的逻辑关系，说明StSgal 1的表达与miNRA-9具有相关性。
[003引为了直接证明Stegall是miRNA-9的祀基因，构建了双巧光素酶报告基因，设计引 物将St6gall3'UTR区域中与miNRA-9结合位点的片段扩增出来(结合位点如图3所示，结合 位点用粗体字标注），并将此段序列连接到pGl-3载体中，然后将其与miRNA-9的mimic共转 染到Hepa 1-6中。
[0039] 扩增片段引物设计：
[0040] 设计引物扩增Stegal 1基因（NM_001252505)的3 ' irre非翻译区片段，并根据pGl-3 载体上的酶切位点选择适合的酶切位点，在引物的5 '端和3 '端分别加入MiilI和化〇11酶切 位点，引物分别命名为St6gall/3'UTR-F(上游引物）St6gall/3'UTR-R(下游引物），引物序 列如下：
[0041 ] St6gal/3 ' UTR-F:5 '-ACGCGTTATAAGGCATCAGGACTGT-3 '
[0042] Stegal1/3 ' UTR-R:5 '-CCGCTCGAGGATTTCTGAAAAAGATATT-3 '
[0043] 上述Stegall基因（NM_001252505)的cDNA序列如沈Q ID 齡.4，总长度为41776口。
[0044] 按照前述方法提取化pal-6细胞中的总RNA，反转录得到cDNA，使用PCR扩增试剂盒 (TaKaRa PCR Amplification Kit,Japan)扩增目的片段。PCR体系如下所示： PC民反应体系（撕冲）： ClNTP 叫 10邻C及Bu瓶r 3 Hl 灭菌蒸溜水 23.7山
[004引 Taq 酶 0.3.ul 上游引物 0.5|il 下游引物 0.5叫 cDNA 叫 1 总体載 30,LU
[0046] PCR 条件为:95°C，预变性 4min; 94°C 变性 40s，60°C 复性 40s，70°C 延伸 60s，40 个循 环;72°C延伸10min;4°C保存。
[0047] 反应结束后，PCR反应产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带进行切 胶回收步骤，收集目的片段（即Stegall的3'UTR片段），测序，序列如SEQ ID No.5,长度 239bp。将目的片段与克隆载体PMD-19T在16°C下过夜连接，目的片段和PMD-19T分别用Mii 11和化Ol I进行双酶切后，进行连接，连接体系如下： pMD19-T Simple V说 1;or 0.5 (SO ng/jiL ) St6galI 3，UT民片段 4.5 ^iL (〇3pmolDNA)
[004引 Sokition I 5.0 JiL 总体巧 10.0睐
[0049] 将连接产物转化至制备好的感受态细胞E.COli JM109中，具体方法如下：
[0050] (1)取200iil感受态细胞溶液，加入IOiil连接产物，混匀，于冰上SOmin;
[0051 ] (2)42°C水浴90秒钟热激，放置于冰水中2min;
[0052] (3)加入37°C预热培养基(无抗性)振荡培养50min;
[0053] (4)取出50iU转化物涂于含Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板放置于解箱中，37 °C培养过夜。
[0054] 筛选阳性克隆：
[0055] (1)随机挑取平板上独立的圆滑的菌落，37°C下摇菌培养约12h，收集菌液后，使用 试剂盒(OMEGA质粒小量提取试剂盒，D6942-01 E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I)提取质 粒。将质粒测序，选取测序正确的质粒与pGl S-Control Vector连接。将质粒和pGL3-Control Vector分别用M山I和化oil进行双酶切，得目的片段和线性载体，在16°C下过夜连 接，连接体系如下： pGO-Control Vector 2 jxl T4 DNA Iigase I jil
[0056] 目的片段 15叫 I O.xT4 Ligation Btrffer 2 jil 总体親 20叫
[0057] 将连接产物转化至感受态细胞中，进行重组质粒的转化实验和质粒提取实验，方 法同上述实验过程。将大量精提取好的重组质粒与miRNA-9的mimic共转染至化pal-6细胞 中，接下来进行双巧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase?Repo;rter Assay System, Promega,USA)
[0058] 具体为：将重组质粒与miRNA-9的模拟物共转染至化pal-6细胞培养12小时后，收 集细胞，用裂解液进行裂解，裂解液按照试剂说明配置蛋火虫巧光素酶检测试剂工作液和 Renilla巧光素酶检测工作液，用巧光测定仪进行检测，检测结果进行统计学分析，结果如 图4所示。图4中，mock为没有转染的Hepa 1-6细胞，mimic为转染了 miRNA-9的模拟物的 Hepal-6细胞，mimic NC为转染了miRNA-9模拟物的阴性对照的H邱al-6细胞，可见，miRNA-9 的模拟物可W显著抑制pGL3的巧光强度，故Stegall为miRNA-9的祀基因之一。
[0059] 实施例3
[0060] 为了进一步寻找miRNA-9与小鼠肝癌细胞转移能力的关系，将miRNA-9的模拟物 (mimic)、miRNA-9的抑制物（inhibitor)和miRNA-9模拟物的阴性对照物（mimic NC)与 miRNA-9抑制物的阴性对照物QnMbitor NC)的分别转染至H邱al-6、Hca-P、Hca-FS种细 胞中。培养36-48小时后，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blotting检测StGgall的表 达水平，结果如图5A-C所示。试验结果可见，转染miRNA-9的mimic可W下调Stegall在细胞 中的表达水平，相应的，转染miRNA-9的inhibitor上调了Stegall的表达水平。
[0061] 实施例4
[0062] 为了进一步研究上调、下调miRNA-9在S种细胞中的表达量对细胞功能的影响，进 行细胞增殖、侵袭、迁移和黏附的实验。
[0063] 1.细胞转染
[0064] 将复苏好的化pal-6、化a-P、Hca-F细胞分别铺在6孔板中，每孔约5*105个细胞。参 照转染试剂(rAoWCT? CP，RIBOBIO，China)说明书，分别稀释miRNA-9的mimic、mimic NC、 inhibitor、inhibitor NC和转染试剂，并按照说明书混合转染试剂与相应的siRNA。置于37 °C，0)2培养箱中解育2地。转染结果在巧光显微镜下观察，结果如图6,如图6A-C分别为在 Hca-F、Hca-P、Hepal-6S种细胞中转染了带有巧光标记的miRNA-9模拟物的阴性对照物 mimic NC后的巧光效果图，表明在该转染条件下转染实验成功，同样，转染其他试剂时，也 表现出良好的转染效率，转染率在60-70 %之间。
[0065] 2.对小鼠肝癌细胞增殖的影响
[0066] 细胞增殖-CCK8实验:采用CCK8试剂盒(DojindoJapan)进行检测，具体方法如下：
[0067] 收集成功转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inWbitor、inWbitor NC，W及未作转 染处理(mock)的化pal-6，化a-P，化a-FS种细胞，用血球计数板计数大约2*104个细胞，并 将记数后的细胞铺在96孔板的每孔中，总体积为10化1，每组设3个复孔。将96孔板放置于 37°C，C02培养箱中分别培养2地、4她、72h、96h。每孔细胞悬液中加 IOiil CCK-8溶液，置于37 °C，0)2培养箱中解育化。测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的 方差分析方法来分析各组数据，结果如图7所示。图7可见，转染了 miRNA-9模拟物(miRNA-9 mimic)的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、化a-F的增殖速率显著低于转染了 miRNA-9抑制物 (miRNA-9 inhibitor)的小鼠肝癌细胞，表明miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、Hca-F的增殖速率。
[0068] 3.对小鼠肝癌细胞的转移能力
[0069] Transwe 11小室法检测mi RNA-9对H邱a 1 -6、Hca-P、Hca-F细胞迁移能力的影响：同 细胞增殖实验一样，收集转染后培养2地的各组细胞，使用