铜绿假单胞菌重组蛋白OprL及制备方法和应用与流程

文档序号:13685345
技术领域本发明属于生物技术制药领域,具体涉及一种铜绿假单胞菌重组蛋白OprL,本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。

背景技术:
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)俗称绿脓杆菌,为非发酵菌中的假单胞菌属,广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中,在医院病房及医疗器械中也普遍存在,是临床上最为常见的条件致病菌之一。目前在全球范围内,该菌已成为ICU病房、烧伤、战创伤感染,机械通气相关肺炎(VAP)分离率最高的病原菌之一。PA感染可发生在人体任何部位和组织,如烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道等,也可引起心内膜炎、胃肠炎、肺炎甚至败血症等全身感染,全身感染死亡率超过20%。此外,由于抗生素的滥用等原因,PA的耐药问题逐渐突出,出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA),且耐药性PA的分离率逐年上升。中国CHINET2005--2012年连续监测资料显示,PA对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平,但略呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0%、42.8%、35.8%、30.5%、30.5%、30.8%、29.1%和29.1%,对美罗培南的年度耐药率分别为32.0%、34.1%、28.5%、24.5%、25.2%、25.8%、25.0%和27.1%,但其中泛耐药(PDR-PA)菌株数量显著增多,在2011年和2012年分别达到1.8%和1.5%(铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识,中华结核和呼吸杂志,2014年1月37卷1期)。由于PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升,寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫,从免疫学角度入手,研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择。基因工程亚单位疫苗通过基因工程的手段,将病原体的致病因子或其突变体的基因克隆至的蛋白表达载体,重组子在工程菌内进行大规模表达,经过纯化后制备成基因工程亚单位疫苗。该疫苗具有工艺简单、成本低、可操作性强等有点,已成为疫苗研发的重要方向。研发基因工程疫苗的关键是筛选到良好的保护性抗原分子。OprL为铜绿假单胞菌的肽聚糖相关蛋白(peptidoglycanassociatedlipoprotein),其位于铜绿假单胞菌的外膜,在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。OprL蛋白在铜绿假单胞菌中高度保守,已经有研究将其作为铜绿假单胞菌的诊断靶点(Xu,J.等.Clin.Microbiol.Antimicrob.2004)。同时有研究发现在病人的血清中发现有抗OprL的抗体的存在(Montor,W.R等,InfectImmun2009),此外OprL还能诱导小鼠产生保护性Th17免疫应答反应(Wu,W等,AmJRespirCritCareMed2012)。鉴于这些因素,OprL可以作为良好的基因工程疫苗候选抗原。

技术实现要素:
本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌重组蛋白OprL及制备方法和应用,所述重组蛋白经动物试验证明,可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用,有利于铜绿假单胞菌的预防、诊断和治疗。采用本发明所示方法制备的重组蛋白,表达量高、便于分离纯化。为实现上述目的,本发明提供如下的技术方案:铜绿假单胞菌重组蛋白OprL包含铜绿假单胞菌肽聚糖蛋白(PeptidoglycanAssociatedLipoprotein)片段,所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO:1,氨基酸序列为SEQIDNO:2。一种表达载体,包含编码上述重组蛋白的核苷酸序列。所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码上述重组蛋白的核苷酸序列形成;优选地,所述骨架质粒选自pGex系列载体、pET系列载体或pQE系列载体。本发明优选采用pGEX-6p-2载体来构建重组表达质粒,表达重组蛋白OprL,pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体,其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST),所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签,此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比,pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入,从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。包含上述表达载体的宿主菌。所述宿主菌选自大肠杆菌XL1-blue、BL21或HMS174菌株中的一种,优选为大肠杆菌XL1-blue菌株。上述重组蛋白的制备方法,包括以下步骤:1)根据编码铜绿假单胞菌重组蛋白OprL的核酸序列合成或设计正向引物和反向引物,以铜绿假单胞菌全基因组做模板用PCR扩增得到铜绿假单胞菌重组亚单位疫苗OprL目的基因片段;2)将步骤1)所得基因片段克隆至表达载体,然后转化至宿主菌;3)诱导转化后的宿主菌表达OprL重组蛋白。4)OprL重组蛋白的纯化。步骤1)所述的正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。上述重组蛋白在制备用于诊断、预防或治疗铜绿假单胞菌的药物中的应用。所述药物为用于诊断铜绿假单胞菌的试剂盒。所述药物为用于预防或治疗铜绿假单胞菌的亚单位疫苗。本发明采用基因工程技术克隆表达此重组融合蛋白,表达量高,便于分离纯化,而且高效安全。OprL重组蛋白可直接与佐剂(如氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用,适用于注射免疫接种。由于采用了上述技术方案,本发明具有如下的优点:1)OprL重组蛋白表达质粒在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达;2)选择pGEX载体系列时,OprL重组蛋白以融合蛋白形式表达;表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST),所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签,此标签就成为蛋白纯化的标记,使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入,从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性;纯化出来的OprL重组蛋白纯度大于95%;3)OprL重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体和具有免疫保护效果。利用本发明OprL重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种,激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实,所述基因工程重组蛋白疫苗具有良好的抗PA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础,同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。附图说明图1为OprL基因片段的PCR扩增结果;其中,泳道1:核酸(DNA)分子量标准(Marker),从上到下大小分别为:4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;;泳道2:目的基因片段OprL(~450bp);图2为重组质粒pGex-6P-2-OprL的双酶切鉴定结果;其中,泳道1:核酸(DNA)分子量标准(Marker),从上到下大小分别为:4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;泳道2~6:重组表达质粒pGEX-6p-2-OprL经酶切后的鉴定结果,酶切后分离的片段约4000bp和约450bp;图3为蛋白OprL诱导鉴定结果;其中,泳道1:蛋白分子量标准(Marker),从上到下大小分别为:170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd;泳道2&3:结合诱导表达的超声上清的GST填料;泳道4:经PP酶酶切后的上清;泳道5:经PP酶酶切后的GST填料;图4为纯化后的蛋白OprLSDS-PAGE电泳结果,其中,泳道1:蛋白分子量标准(Marker),从上到下大小分别为:170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd;泳道2:纯化的OprL蛋白。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进一步详细说明。应当理解,此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。菌株与各种试剂如下:1.铜绿假单胞菌菌株铜绿假单胞菌国际标准株PA01由美国ATCC提供(BAA-47TM);2.铜绿假单胞菌临床株XN-1(保藏号为CCTCCNO:M2015730,分类命名为:铜绿假单胞菌XN-1,拉丁文名称:PseudomonasaeruginosaXN-1,保藏时间:2015.12.9;保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC);保藏地点:湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山);3.试剂质粒pGEX-6p-2购自GEHealthcareLifeSciences公司,申请人保存;大肠杆菌菌株XL-1blue购自上海超研生物科技有限公司,申请人保存;primeSTARHSDNAPolymerase、DNAMarker、限制性内切酶BamHI和EcoRI、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品;质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品;细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品;T4DNALigase为Fermentas公司产品;谷胱甘肽-琼脂糖凝胶GlutathioneSepharose4B为美国GEHealthcare公司产品。实施例1:OprL基因的克隆和重组质粒pGEX-6P-2-OprL的构建1.首先根据铜绿假单胞菌PA01的OprL蛋白全长基因序列,应用生物信息软件进行结构分析,确定需要扩增的OprL目的基因片段。2.根据分析结果,采用PCR方法自PA01基因组扩增OprL目的基因片段,扩增步骤如下:1)设计PCR引物如下,分别为SEQIDNO:3-4(下划线示酶切位点碱基序列)SeqID引物名称序列(5’-3’)内切酶SeqID3OprL-FCGCGGATCCTGCTCCTCCAAGGGCGBamHISeqID4OprL-RCCGGAATTCTTACTTCTTCAGCTCGACGEcoRI2)-80℃冷冻库中取出保存的铜绿假单胞菌菌株PA01涂布于LB固体培养基上,于37℃培养过夜,再挑取单菌落接种于LB液体体培养基中培养8个小时,参照细菌基因组抽提试剂盒抽提PA01基因组。3)以PA01全基因组DNA为模板PCR扩增OprL基因片段PCR体系:模板(239.2ng\/μl)2.5μlOprL-F(50μM)1.0μlOprL-R(50μM)1.0μlprimeSTAR酶2.5μldNTP2.0μlBuffer15.0μl灭菌双蒸水26.0μl总体积50.0μlPCR扩增反应条件98℃预变性5min,98℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸90s,30个循环,72℃完全延伸6min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果,PCR扩增结果示于图1中。4)使用凝胶回收试剂盒回收OprLPCR产物。3.PCR产物的鉴定与克隆,步骤如下:1)BamHI和EcoRI酶切pGEX-6P-2质粒和OprLPCR产物酶切反应体系:项目体积BamHI3.0μlEcoRI3.0μl10×KBuffer3.0μl0.1%BSA6.0μlProduct45.0μl37℃酶切2h。2)使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamHI和EcoRI酶切的PCR产物。3)连接和转化通过紫外分光光度计测定OprL酶切回收产物核酸浓度:21ng\/μl,pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度:60ng\/μl。连接反应体系:项目体积连接反应液SoultionI5.0μlOprL酶切回收产物4.5μlPGEX-6P-2酶切回收产物0.5μl混匀,16℃连接2h。4)从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞,第一管加入pGEX-6P-2质粒,作阳性对照;第二管加入DNA连接产物;第三管不加外源DNA,作阴性对照。冰浴50min,42℃金属浴中热击90s,迅速冰浴2min。加入600ulLB空白培养基,混匀,置于37℃摇床中220rp振摇1h。各管以5000rpm室温离心3min.,弃去300ul上清,再重悬菌体,取200μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。5)pGEX-6p-2-OprL阳性重组质粒的筛选、鉴定①阴性对照平板没有菌落出现;阳性对照平板长满菌落,说明感受态细胞制作正确,结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落,接种于Amp抗性LB培养基中,37℃振荡培养过夜;②质粒抽提:参照质粒提取试剂盒说明书进行;③质粒DNA进行BamHI和EcoRI双酶切;双酶切反应体系:项目体积BamHI0.5μlNotI0.5μl10×KBuffer0.5μl0.1%BSA1.0μl重组质粒8.0μl37℃酶切2h;④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果,结果如图2,可见泳道2样品为构建成功的pGEX-6p-2-OprL重组质粒;⑤pGEX-6p-2-OprL重组质粒送往上海英俊公司测序,测序结果比GeneBank序列信息比对,结果发现二者的序列核苷酸序列完全相同。实施例2:重组融合蛋白OprL在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定1.OprL诱导表达取过夜培养的pGEX-6P-2-OprL\/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp+抗性的LB培养基中,180rpm37℃过夜培养,分别取过夜培养的菌液400μL加入20mLAmp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用),37℃培养2~3h,转速200rpm,二次活化至OD600为0.8-1.0时,加入IPTG4μL,使其终浓度为200μM,再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。2)将诱导表达后的菌液取出,以12000rpm离心5min,弃去上清,加入1mLlysisbuffer(20mMPB,pH7.2,250mMNacl)混匀,超声裂解3min(超声6次30s\/次),再4℃14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。2.处理上清取GlutathioneSepharose4B20μl,用PBS洗涤3次后,将准备好的上清加入GlutathioneSepharose4B中,室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后,使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次,PBS洗涤一次。向结合后的GlutathioneSepharose4B加入20μL2×蛋白质上样buffer,煮沸5min,14000rpm离心3min。3.处理沉淀在沉淀中加入500μLPBS重悬菌体,取80μL重悬菌液加入20μL5×蛋白质上样buffer,煮沸5min,14000rpm离心3min。4.SDS-PAGE电泳将5%浓缩胶灌入制胶版中,在加入蒸馏水将胶压平,室温放置30min使其凝固,将上层的蒸馏水倒干,再灌入10%分离胶,立即插上梳子,室温放置30min使其凝固备用。将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样,进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min,再调至180v,电泳1~2h后,将胶取出,置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色,再置于脱色液中振荡脱色后,在呈像系统下观察结果,PGEX-6P-2-OprL\/XL-1blue在30℃为可溶性蛋白(图3)。实施例3:OprL抗原的制备1.放大培养获取蛋白取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-OprL\/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化,200rpm37℃培养5~6h后,取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化,37℃培养3~4h至OD600为1.0时,加入80μLIPTG(终浓度为200μM)置于16℃摇床中过夜诱导后,12000rpm离心15min收集菌体,再加20mLlysisbuffer(同实施例2)重悬菌体后,将菌液进行超声裂解3min(200V),收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的GlutathioneSepharose4B(GE公司)凝胶珠(beads)结合处理;再进行SDS-PAGE凝胶电泳。2.使用酶切方法,将目的蛋白和GST标签分开,获取OprL目的蛋白向余下约800μL已结合蛋白的GlutathioneSepharose4B中加入800μLPBS和120μLPreScissionprotease(PP酶,GE公司),室温垂直旋转酶切5h后,离心吸取上清后,分别用800μLPBS洗涤3次,各后取10μL样品变性处理后,上样5μL进行蛋白电泳(方法同上),在呈相系统下观察结果,酶切下来的OprL蛋白分子量~16kDa,与预期蛋白分子量大小相符合,见图4。实施例4:铜绿假单胞菌感染肺炎小鼠模型的构建1.铜绿假单胞菌菌液制备取冻存的铜绿假单胞菌临床株XN-1(CCTCCM2015730),采用LB营养琼脂平板复苏,37℃需氧培养过夜。挑取单个菌落接种20mLLB液体培养基,37℃需氧180rpm振荡培养15h后,取0.2mL接种于20mLLB液体培养基中,37℃需氧230rpm振荡培养6h。6000g离心收集菌体,生理盐水洗涤两次后用生理盐水重悬浮菌体。采用分光光度计测定菌液的OD600值,并按照1OD=6.0×109CFU\/ml将其换算成细菌浓度。2.小鼠麻醉及滴鼻方案的建立在铜绿假单胞菌肺炎模型的感染实验中,为保证滴鼻过程的顺利进行,首先采用异氟烷将小鼠麻醉。麻醉方法:以氧气为输送载体以5%浓度的异氟烷进行吸入诱导麻醉,待小鼠进入外科深麻醉期后,以3%的浓度维持麻醉,这种方式可以达到较好的麻醉效果。滴鼻剂量的控制是模型稳定性的保证,为了更好的控制滴鼻剂量,同时防止滴鼻过程中菌液进入口腔和产生气泡,采取了以下措施:(1)由于鼻咽部有一个生理弧度,头仰得越厉害,滴鼻液越容易进入口腔,所以滴鼻过程中小鼠头部仰卧幅度不能超过鼻咽部的生理弧度;(2)顺鼻腔外侧壁滴药,尽可能减少滴鼻过程中气泡的产生;(3)把握好滴鼻的节奏,在小鼠吸气开始的瞬间滴加4μL以下量;(4)本实施例中滴鼻量为20μL,单侧鼻孔一次连续滴入。3.感染剂量的确定采用生理盐水将实施例1获得的PAXN-1菌液调节至五种不同浓度,将实验动物雌性BALB\/c小鼠随机分为5组,用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染,每只小鼠感染剂量为20μL,采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。动物的分组和感染情况如表1所示。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况,观察周期为7天,观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。表1:铜绿假单胞菌肺炎模型感染剂量的确定组滴鼻剂量(CFU)数量浓度(CFU\/ml)滴入量(μl)1PAXN-16.00×108103.00×1010202PAXN-13.00×108101.50×1010203PAXN-11.50×108107.50×109204PAXN-17.50×107103.75×109205PAXN-13.75×107101.88×109206生理盐水-10-20采用不同浓度(2倍梯度稀释)的铜绿假单胞菌菌株PAXN-1感染BALB\/c小鼠时,经过7天的观察,结果如图1所示:感染量为1.5×108CFU时小鼠死亡率为40%,感染量为3.0×108CFU时小鼠死亡率为80%,感染量达到6.0×108CFU时小鼠死亡率100%。确定小鼠感染的优选剂量为3.0×108CFU。实施例5:动物的免疫1)首次免疫,用PBS稀释OprL抗原,加入浓度为1mg\/mL的Al(OH)3;用5号半型针头,双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射,每只BALB\/C小鼠注射量为100μL,并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组;2)第二次免疫,第7天进行第二次免疫,免疫组分同上,注射量蛋白抗原量是首次免疫的1\/2,免疫途径同上;3)第三次免疫,第14天进行第三次免疫,免疫组分同上,注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同,免疫途径同上;实施例6:抗体的检测第三次免疫后第7和14天,采集BALB\/C小鼠的血,用ELISA检测小鼠免疫后,IgG、IgG1、IgG2a体液应答水平。1.制备液体1)包被液的配制:称取Na2CO31.6g,NaHCO32.9g,溶于1LddH2O,用PH计将pH调至9.6;2)封闭液的配制:1g牛血清V,溶于100mL抗体稀释液(1∶100);3)抗体稀释液的配制:将磷酸盐溶于1LddH2O,再加入500μLTween20,再用PH计将pH调至7.4;4)洗涤液的制备:同抗体稀释液5)显色液(TMB),为天根公司产品;6)终止液(2MH2SO4)的制备:将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mLddH2O中。2.ELISA检测OprL重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价1)用包被液将纯化后的OprL重组蛋白稀释为:1ug\/mL、5ug\/mL、10ug\/mL;2)包被:将重组蛋白稀释液加入酶标板,100μL\/孔,4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍,空干后用保鲜膜包上,置于4℃冰箱中备用;3)封闭:酶标板加封闭液200μL\/孔,置于37℃孵育箱中2小时,洗涤3遍;4)将血清进行1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000等倍比稀释;5)取封闭好的酶标板,依次加入稀释血清,100μL\/孔,置于37℃孵育箱1h,洗涤3遍,空干;6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液,稀释1∶5000,制成抗体工作液;7)加入稀释抗体工作液,100μL\/孔,置于37℃孵育箱40min,洗涤三遍,空干;8)加入底物显色液(TMB)100μL\/孔,室温避光反应5min;9)加入终止液(2MH2SO4),立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值;10)结果判断:A样品A阴性值≥2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1∶1000倍稀释)。结果:检测OprL蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1∶512000;免疫后第7天的抗体阳性率达到100%,说明本发明构建的OprL重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。实施例7:OprL重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价OprL末次免疫后10~14天,采用与实施例3相同的方法,用生理盐水将准备PAXN-1菌液并调节浓度至1.5×1010CFU\/mL,用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染,每只小鼠感染量为20μL,采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况,观察周期为7天,观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。表2OprL重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果表2显示:阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为15%和20%,重组融合蛋白OprL加Al(OH)3佐剂组的平均免疫保护率为70%。因此,本发明的OprL重组蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生免疫应答,并且能够对PAXN-1的感染起到保护作用,可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。通过以上实施例,本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂,例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒,例如检测试剂盒,用于诊断是否感染铜绿假单胞菌、确定预后等。本领域技术人员可以将本发明OprL重组蛋白用于其他任何适用的用途。以上所述仅为本发明的较佳实施例,并非用来限定本发明的实施范围;如果不脱离本发明的精神和范围,对本发明进行修改或者等同替换,均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
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