1.一种Cas9表达载体,其特征在于序列如SEQ ID NO.11所示。
2.如权利要求1所述的一种Cas9表达载体,其特征在于由4.3kb的Cas9片段与5.1kb的pUC-EIN载体骨架连接得到,所述pUC-EIN载体的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求2所述的一种Cas9表达载体,其特征在于所述5.1kb的pUC-EIN载体骨架由BspT Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切pUC-EIN载体得到。
4.如权利要求2所述的一种Cas9表达载体,其特征在于所述4.3kb的Cas9片段由BspT Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切pUC-Cas9载体得到。
5.如权利要求4所述的一种Cas9表达载体,其特征在于所述pUC-Cas9载体由AgeⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ三酶切pX330载体得4.3kb、2.2kb及2.0kb片段,将4.3kb的片段插入到pUC-GZ载体中得到。
6.如权利要求5所述的一种Cas9表达载体,其特征在于所述pUC-GZ载体由pUC-mIKB载体经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切得2.6kb的载体骨架和1.4kb片段,将2.6kb的载体骨架与47bp的GZ短片段连接所得。
7.如权利要求6所述的一种Cas9表达载体,其特征在于所述pUC-mIKB载体的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
8.如权利要求6所述的一种Cas9表达载体,其特征在于所述GZ短片段的制作过程如下:
a)人工合成2条DNA寡核苷酸GZF、GZR,序列如下:
GZF:5'AATTACTTAAGACCGGTGGTACCACTCGTCTCGAGGAATTCGGATCC 3'
GZR:5'AGCTGGATCCGAATTCCTCGAGACGAGTGGTACCACCGGTCTTAAGT 3'
b)将GZF、GZR分别按照10微摩尔/升的浓度稀释,二者等量混合,取50微升置于薄壁PCR管中,按照下述程序孵育:
95℃ 5分钟,72℃ 10分钟,置冰上,GZ短片段制作完成。