本发明属于生物工程领域，具体涉及芍药hsp70基因序列及其植物表达载体和应用。
背景技术：
芍药(paeonialactiflorapall.)，芍药科芍药属宿根草本植物，是我国的传统名花，也历来是繁荣兴旺的象征。芍药因其栽培历史悠久，品种繁多，花型丰富，花大色艳，广泛栽植于私家庭院及城市园林绿地中。芍药性喜冷凉气候，但随着我国城市化进程的不断加快和园林园艺事业的迅猛发展，很多南方地区如江苏南京、苏州、扬州、湖南长沙、浙江杭州都纷纷引进芍药种植，扩大了芍药的栽培区域和面积，而栽培品种都基本引进于河南洛阳、山东荷泽等北方地区。由于南方地区的夏季气温高、高温持续时间长，大部分北方芍药品种表现出对高温气候的不适应，严重影响了观赏效果，制约了芍药在我国南方城市的推广与应用。为了解决这一难度，获得适应南方地区夏季持续高温气候的芍药材料，提高芍药耐高温能力已成为当前芍药生产上的一项重要任务。
热激蛋白(hsps，heatshockproteins)是各类生物细胞在高温、干旱、重金属离子胁迫等逆境刺激后广泛合成的一类应激蛋白，它们以分子伴侣的形式参与细胞保护。其中，高温是诱导hsps合成的主要因素，是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分。根据分子量的不同，可将热激蛋白分为6个家族，即hsp110、hsp90、hsp70、hsp60、小分子smhsp和泛素。在对热激蛋白家族成员的研究中，目前hsp70家族最受关注。hsp70是hsps家族中最保守、最重要的一类蛋白，在高温胁迫条件下hsp70能防止蛋白降解，有利于变性蛋白的复性，因此，它与植物的耐高温能力密切相关。但hsp70家族成员很多，在不同植物上具体哪一个成员能够调控其耐高温胁迫能力尚未知晓。目前，hsp70的报道主要集中于大田作物、蔬菜等上，而在芍药上，能提高耐高温胁迫能力的hsp70基因家族成员一直未见报道。
在前期研究中，我们已经发现芍药‘紫凤羽’耐高温能力较强(赵大球,韩晨霞,陶俊.不同芍药品种耐热性鉴定.扬州大学学报(农业与生命科学版),2015,36(4):105-109)，但与其相关的能提高耐高温胁迫能力的hsp70基因家族成员并未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提高植物的耐高温能力，提供一个新的芍药‘紫凤羽’耐高温基因plhsp70的dna序列。
本发明还提供该耐高温基因plhsp70的植物表达载体及其构建方法和应用。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高植物的耐高温能力、创制耐高温新种质。
本发明采用的技术方案：
一种耐高温基因plhsp70，该基因的dna序列为seqidno.1。该基因源自芍药‘紫凤羽’。
本发明还公开了含有上述plhsp70基因的植物表达载体，由本发明所述的芍药‘紫凤羽’耐高温基因plhsp70的cdna序列(seqidno.2)与中间植物表达载体pcambia1301构成。
芍药‘紫凤羽’耐高温基因plhsp70植物表达载体，其构建方法如下：
(1)芍药‘紫凤羽’耐高温基因plhsp70的cdna序列克隆：以芍药‘紫凤羽’幼嫩叶片为材料，提取总rna，反转录为cdna，设计引物扩增plhsp70基因的cdna序列，上游引物plhsp70-cf：5′-atggcaggcaaaggagaaggaccg-3′(seqidno.3)，下游引物plhsp70-cr：5′-ttagtccacctcttcaatcttggg-3′(seqidno.4)，以反转录的cdna为模板，进行pcr扩增，产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆进行序列测定；
(2)植物表达载体pcambia1301-plhsp70的构建：设计引物以芍药‘紫凤羽’cdna为模板，进行pcr扩增，在plhsp70基因cdna序列的上游和下游分别引入bamhi和kpni酶切位点，上游引物plhsp70-mf：5′-cgcggatccatggcaggcaaagga-3′(seqidno.5)，下游引物plhsp70-mr：5′-cggggtaccttagtccacctcttcaa-3′(seqidno.6)。pcr产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆、提取阳性质粒，bamhi和kpni双酶切的plhsp70片段与bamhi和kpni双酶切的pcambia1301连接、转化，提取阳性质粒，酶切，电泳检测并测序验证，植物表达载体pcambia1301-plhsp70构建成功。
(3)芍药耐高温基因plhsp70的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高植物耐高温能力，方法如下：农杆菌菌株eha105感受态制备及冻融法转化；拟南芥花序浸染及种子筛选；转基因植株鉴定及耐高温能力评价。
本发明的有益效果体现在：
1、本发明提供的芍药‘紫凤羽’plhsp70是芍药上的一个新抗逆基因，该基因可提高植物的耐高温能力。
2、本发明构建的芍药‘紫凤羽’plhsp70基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，提高植物的耐高温能力、创制耐高温新种质。
附图说明
图1plhsp70基因的dna序列扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，图中：m：dnamarkerdl2000；1：plhsp70基因的dna序列扩增产物。
图2plhsp70基因的cdna序列扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，图中：m：dnamarkerdl2000；1：plhsp70基因的cdna序列扩增产物。
图3pcambia1301-plhsp70质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测，图中：m：dnamarkerdl2000；1：pcambia1301-plhsp70质粒双酶切产物。
图4植物表达载体pcambia1301-plhsp70图谱。
图5转基因植株的鉴定，图中：a：gus染色鉴定；b：pcr鉴定。
图6高温胁迫后拟南芥植株的表型。
图7高温胁迫后拟南芥植株相关指标测定，图中：a：plhsp70基因的相对表达水平；b：相对电导率；c：dab染色法观测h2o2积累水平；d：荧光探针法观测超氧阴离子积累水平。
具体实施方式
所涉及的pcambia1301为商品化载体。
实施例1.plhsp70的dna序列克隆
选用芍药‘紫凤羽’幼嫩叶片作为材料，参照minibestplantgenomicdnaextractionkit试剂盒(takara)说明书方法提取dna。
以提取的叶片dna为模板，设计引物plhsp70-df和plhsp70-dr进行pcr反应：上游引物plhsp70-df：5′-ctcttacttttcttctctcgaccccttccg-3′(seqidno.7)，下游引物plhsp70-dr：5′-gaagaccaattacttagtcgacctcttcaa-3′(seqidno.8)；25μl反应体系：10×rcrbuffer(mg2+plus)2.5μl，plhsp70-df、plhsp70-dr引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，taqdnapolymerase0.25μl，cdna模板2.0μl，ddh2o15.75μl；反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，61.7℃退火30sec，72℃延伸4min，反应35个循环，72℃延伸10min；pcr结束后使用1％的琼脂糖电泳检测(图1)，产物使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝胶回收试剂盒(takara)回收纯化，产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体(trans)，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆进行测序，序列测定为seqidno.1(其中282-1721bp为内含子)。
实施例2.plhsp70的cdna序列克隆
选用芍药‘紫凤羽’幼嫩叶片作为材料，参照minibestplantrnaextractionkit试剂盒(takara)说明书方法提取总rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒(takara)取1μg总rna反转录成cdna。
以提取的叶片cdna为模板，设计引物plhsp70-f和plhsp70-r进行pcr反应：上游引物plhsp70-cf：5′-atggcaggcaaaggagaaggaccg-3′(seqidno.3)，下游引物plhsp70-cr：5′-ttagtccacctcttcaatcttggg-3′(seqidno.4)；25μl反应体系：10×rcrbuffer(mg2+plus)2.5μl，plhsp70-f、plhsp70-r引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，taqdnapolymerase0.25μl，cdna模板2.0μl，ddh2o15.75μl；反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，56.7℃退火30sec，72℃延伸2min，反应35个循环，72℃延伸10min；pcr结束后使用1％的琼脂糖电泳检测(图2)，产物使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝胶回收试剂盒(takara)回收纯化，产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体(trans)，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆进行测序，序列测定为seqidno.2。
实施例3.植物表达载体pcambia1301-plhsp70的构建
设计引物plhsp70-mf、plhsp70-mr进行pcr反应，在plhsp70cdna序列的上游和下游分别引入酶切位点bamhi和kpni，pcr产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆、提取阳性质粒，bamhi和kpni双酶切的plhsp70片段与bamhi和kpni双酶切的pcambia1301连接、转化，提取阳性质粒，酶切，电泳检测并测序验证为seqidno.2，具体步骤如下：上游引物plhsp70-mf：5′-cgcggatccatggcaggcaaagga-3′(seqidno.5)，下游引物plhsp70-mr：5′-cggggtaccttagtccacctcttcaa-3′(seqidno.6)。(1)以芍药‘紫凤羽’叶片cdna作为模板，进行pcr反应，25μl反应体系：10×rcrbuffer(mg2+plus)2.5μl，plhsp70-mf、plhsp70-mr引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，taqdnapolymerase0.25μl，cdna模板2.0μl，ddh2o15.75μl；反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，57.6℃退火30sec，72℃延伸2min，反应35个循环，72℃延伸10min；pcr产物使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝胶回收试剂盒(takara)回收纯化。
(2)取表达载体pcambia1301质粒和含酶切位点的plhsp70胶回收产物分别用bamhi和kpni双酶切，20μl双酶切反应体系：0.5×kbuffer2.0μl，质粒pcambia1301或plhsp70胶回收产物10μl，bamhi1.0μl，kpni1.0μl，ddh2o6.0μl；37℃反应1.5h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝胶回收试剂盒(takara)回收纯化质粒pcambia1301大片段和plhsp70大片段。用t4dna连接酶(takara)连接两个回收的产物，20μl连接反应体系：10×t4ligasebuffer2.0μl，t4dnaligase1.0μl，pcambia1301大片段2.0μl，plhsp70大片段10μl，ddh2o5μl；22℃室温连接15min后65℃水浴10min，取5μl连接产物转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.05％卡那霉素的lb平板上37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pcambia1301-plhsp70，对质粒进行双酶切(图3)，并测序验证为seqidno.2。植物表达载体pcambia1301-plhsp70构建成功(图4)。
实施例4.植物表达载体pcambia1301-plhsp70遗传转化拟南芥及其耐高温能力鉴定
(一)农杆菌菌株eha105感受态制备及冻融法转化
从yeb(50μg/ml利福平)平板上挑取eha105单菌落，接种于50ml含有50mg/l利福平的yeb液体培养基中，28℃、200rpm培养至od600值0.5，而后冰浴菌液30min，转至预冷的50ml离心管中，4℃、5000rpm、离心10min收集菌体，悬浮于2ml预冷的50mmcacl2(15％甘油)溶液中，混匀后以100μl/管分装在1.5ml灭菌离心管中，液氮冷冻后-80℃保存待用。
取10μlpcambia-mir156e-3p载体质粒，加入200μleha105感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μlyeb液体培养基，28℃、200rpm预培养4h，菌液涂板于yeb(50μg/ml利福平+50μg/ml卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆pcr检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。
(二)拟南芥花序浸染及种子筛选
将阳性单克隆接到50ml的yeb(50μg/ml利福平+50μg/ml卡那霉素)液体培养基中，培养24h，5000rpm离心20min，然后用转化液(1/2ms，添加50g/l的蔗糖，调ph为5.8，然后加200μl/l的silwetl-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。
将处于盛花期的拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1min，用保鲜膜密封包裹植株，暗培养12h后打开保鲜膜，置于适宜的环境中继续生长，待种子成熟时采收。
种子消毒与播种：将种子放入1.5ml的灭菌离心管中，加入1ml消毒液(75％酒精+0.1％的tritonx-100)不间断振荡15min，再用100％酒精清洗1min，重复两次，吸取拟南芥种子到双层滤纸盘上，静候风干，而后将种子均匀播种于筛选培养基(1/2ms+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂+25mg/l氨苄青霉素+25mg/l潮霉素，ph5.8)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用保鲜膜覆盖幼苗1周以保湿。
(三)转基因植株鉴定及耐高温能力评价
(1)转基因植株鉴定：
①gus染色鉴定：在80mgx-glca中加入229μlx-glcasolvent，使其浓度达到350mg/ml，轻轻振荡混匀，即为x-glcasolution；再按照gusbuffera2.5ml、gusbufferb10μl、gusbufferc10μl、ddh2o5.5ml、甲醇2ml、x-glcasolution20μl比例配制10ml的gus染色液；随后取拟南芥幼苗于1.5ml灭菌离心管中，加入适量的gus染色液浸没全株幼苗，37℃孵育24h，使用100％-50％梯度浓度酒精脱色，时间间隔30min，最后用镊子轻轻夹取脱色幼苗拍照观察。从图5a中可以看出，野生型col-0拟南芥植株为透明白色，而转plhsp70植株则被染成蓝色，表明表达载体pcambia1301-plhsp70已成功导入拟南芥。
②pcr鉴定：待抗性苗7～8片叶，采集拟南芥叶片为材料，参照rnaisoplus(totalrna提取)试剂盒(takara)说明书方法提取总rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒(takara)取1.0μg总rna反转录成cdna。将反转录所得的cdna进行pcr扩增、电泳检测，以拟南芥actin为内参基因，设计引物为：上游引物atactin-f：5′-tctcccgctatgtatgtcgc-3′(seqidno.9)，下游引物atactin-r：5′-taaggtcacgtccagcaagg-3′(seqidno.10)；plhsp70扩增的上游引物plhsp70-cf：5′-atggcaggcaaaggagaaggaccg-3′(seqidno.3)，下游引物plhsp70-cr：5′-ttagtccacctcttcaatcttggg-3′(seqidno.4)；25μl反应体系：10×rcrbuffer(mg2+plus)2.5μl，上游引物、下游引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，la
(2)植株耐高温能力评价：
①植株表型：将经pcr鉴定成功的转基因苗在抽薹前置于40℃高温条件下胁迫处理48h，而后观察植株的生长情况。图6为植株在高温胁迫后的生长情况，野生型col-0和转pcambia1301植株的叶片均出现了黄化、卷缩的高温伤害症状，而转plhsp70植株的叶片表现良好，并未出现上述的高温伤害症状。
②plhsp70基因表达水平：以拟南芥的叶片为材料，参照rnaisoplus(totalrna提取)试剂盒(takara)说明书方法提取总rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒(takara)取1.0μg总rna反转录成cdna。将反转录所得的cdna按照
③其他生理指标：测定相对电导率时，称取1g叶片用含有适量蒸馏水的注射器抽真空至叶片沉底后加入试管中，试管中蒸馏水总体积20ml，常温下放置3h后采用电导率仪(雷磁dds-307a，中国)测定电导率e1，同时测定蒸馏水(空白)的电导率e0；然后将试管封口后于沸水浴中煮沸30min，冷却后再测量电导率e2，按下列公式计算叶片相对电导率：相对电导率(％)＝(e1-e0)/(e2-e0)×100％。从图7b中可以看出，野生型col-0拟南芥植株的相对电导率显著高于转plhsp70植株，约为转plhsp70植株的1.9倍。随后，一方面采用dab染色法观测h2o2的积累水平，将叶片浸没在使用50mmtris-醋酸盐缓冲液(ph5.0)配成的0.1mg/ml的dab染色液中，在黑暗条件下25℃放置24h，而后在95％的酒精中煮15min再进行拍照；另一方面，参照活体细胞氧化应激活性氧(ros)原位染色试剂盒(超氧阴离子)(上海哈灵)说明书方法观测超氧阴离子的积累水平。从图7c中可以看出，野生型col-0拟南芥植株的dab染色程度和ros的荧光信号均较强，h2o2和超氧阴离子积累水平均显著高于转plhsp70植株。
综上所述，本发明构建了含有芍药抗逆基因plhsp70的植物表达载体pcambia1301-plhsp70，其中plhsp70基因的dna序列为首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高拟南芥植株在高温胁迫下的生长势。
sequencelisting
<110>扬州大学
<120>芍药hsp70基因及其植物表达载体和应用
<130>
<160>12
<170>patentinversion3.3
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<212>dna
<213>芍药
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