优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0030] 实施例1、重组腺病毒Ad-LAG-3/Ibal的制备
[0031]1、克隆LAG-3 全长cDNA
[0032] 按Trizol试剂盒说明书提取人肝组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA 为模板，以F1 ：5? -ggctcgaggatgtgggaggctcagttcctg-3?(SEQIDNo. 1，下划线部分为Xho I酶切位点）和R1 :5' -gggaattctcagagctgctccggctc-3?(SEQIDNo. 2,下划线部分为 EcoRI酶切位点）为上下游引物，PCR扩增LAG-3全长cDNA，PCR反应体系为50y1，循环 条件参数为：94°C预变性5分钟；然后94°C变性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分钟，共 30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示。结 果显示，PCR产物在约1500bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符。然后将目的条带切胶 回收，纯化后与pGEM?-TEasy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含 有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，将阳性克隆质粒命名为pT-LAG-3。然后 将阳性克隆质粒测序鉴定，测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列如SEQIDNo. 3所 示，与报道的LAG-3 基因CDS序列一致（GenBank:NM_002286. 5) 〇
[0033] 2、克隆Ibal全长cDNA
[0034] 按Trizol试剂盒说明书提取人胰腺组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总 cDNA为模板，以F2 :5 ' -gtctagaatgagccaaaccagggatttac-3'(SEQIDNo. 4,下划线部分为XbaI酶切位点）和R2 :5' -gggtcgactcagggcaactcagagatag-3'(SEQIDNo. 5,下划线部 分为SalI酶切位点）为上下游引物，PCR扩增Ibal全长cDNA，PCR反应体系为50y1，循 环条件参数为：94°C预变性5分钟；然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟， 共30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示。 由图2可知，琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约500bp处呈单一特异性条带，与预期结 果相符。然后将目的条带切胶回收，纯化后与pGEM?-TEasy载体连接，连接产物转化大肠 杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，将阳性克隆 质粒命名为pT-Ibal。然后将阳性克隆质粒测序鉴定，测序结果显示阳性克隆质粒的插入基 因序列如SEQIDNo. 6所示，与报道的Ibal基因CDS序列一致（GenBank:NM_001623. 3)。
[0035] 3、重组载体pStar-LAG-3/Ibal的构建
[0036] 根据LAG-3和Ibal全长cDNA两端所设计的酶切位点，首先将LAG-3全长cDNA插 入pStar载体（郭建强，H5N1亚型流感病毒双基因共表达的DNA疫苗及腺病毒载体疫苗的 研宄，博士论文，2009)的IRES上游，再将Ibal全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具 体方法为：先将pT-LAG-3载体用XhoI和EcoRI双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒 切胶回收纯化后，与同样经XhoI和EcoRI双酶切的pStar载体连接，连接产物转化大肠 杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，XhoI和 EcoRI双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-LAG-3 ;再将pT-Ibal载体用XbaI和 SalI双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经XbaI和SalI 双酶切的pStar-LAG-3载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨苄青 霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，XbaI和SalI双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命 名为pStar-LAG-3-IRES-Ibal。
[0037] 4、重组载体pShuttle-CMV-LAG-3-IRES-Ibal的构建
[0038]以pStar-LAG-3-IRES-Ibal载体为模板，以F3 :5'-gggtcgacatgtgggaggctcagt tcctg-3'（SEQIDNo. 7,下划线部分为SalI酶切位点）和R3 :5'-ggcggccgctcagggca 8(：1^38383七38-3'（5￡(>)10 1^〇.8，下划线部分为1^〇1:1酶切位点）为上下游引物，？0?扩 增LAG-3-IRES-Ibal片段并将该片段两端的酶切位点更换为SalI酶切位点和NotI 酶切位点，PCR反应体系和循环条件参数同前。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回 收试剂盒切胶回收纯化后，与PGEM35-TEasy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感 受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，将阳性克隆质粒命名为 pT-LAG-3-IRES-Ibal，最后经测序鉴定。
[0039] 将pT-LAG-3-IRES-Ibal载体用SalI和NotI双酶切，双酶切产物经凝胶回收 试剂盒切胶回收纯化后，与同样经SalI和NotI双酶切的pShuttle-CMV载体连接，连接 产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质 粒，SalI和NotI双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pShuttle-CMV-LAG-3-IRES-Ibal。
[0040] 5、重组腺病毒载体pAd-LAG-3/Ibal的构建
[0041]将pShuttle-CMV-LAG-3-IRES-Ibal载体用Pme I酶切线性化，再与pAdEasy-1载 体同时电转化大肠杆菌BJ902感受态细胞，进行菌体内同源重组，用含有卡那霉素的LB平 板培养，挑取较小菌落，用含有卡那霉素的LB液体培养基培养过夜，提取质粒，Pac I酶切 鉴定，将阳性质粒命名为pAd-LAG-3/Ibal。
[0042] 6、重组腺病毒载体pAd-LAG-3/Ibal的包装
[0043] 将人胚胎肾293细胞以40 %~60 %的细胞密度接种至T-25培养瓶中，待细胞生 长至30%~50%融合时弃去培养液，用1^口(^6(^31111116 2000试剂将口4(1-1^6-3/让31载体 转染293细胞，通过显微镜观察细胞病理改变，待出现明显细胞病变效应时离心收集细胞， 细胞沉淀用PBS重悬后，反复冻融4次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清 液，即得Ad-LAG-3/Ibal病毒原液；将病毒原液按1:10的比例重新感染293细胞，收集含病 毒的上清液，重复上述操作3次，得第四代重组腺病毒Ad-LAG-3/Ibal。
[0044] 实施例2、重组腺病毒Ad-LAG-3/Ibal转染小胶质细胞的制备
[0045] 1、小胶质细胞的分选
[0046]小胶质细胞培养按文献方法（Lehnartetal,JNeurosci, 2002;22(7) : 2478-2486,该方法为经典的小胶质细胞培养法，广泛用于研宄）。具体如下：取育龄 1-2天的C57BL/6小鼠前脑组织，用胰岛素消化、研磨37°C、20min，细胞转移至含小牛血清 的DMEM培养基培养，1周后，180rpm震动30min，细胞悬液（含>90 %小胶质胶质细胞）转 移至未包被的培养板，15min后移去未黏附细胞悬液，用PBS洗涤3次，用免疫染色鉴定细胞 纯度（90%小胶质胶质细胞）。
[0047] 2、重组腺病毒Ad-LAG-3/Ibal转染小胶质细胞
[0048] 将小胶质细胞以细胞浓度为1X106个/ml接种于6孔板，按感染复数（M0I)为100 加入第四代重组腺病毒Ad-LAG-3/Ibal，感染后48小时收集细胞，用PBS洗涤并重悬，即得 Ad-LAG-3/Ibal病毒转染小胶质细胞。
[0049]WesternBlot检测：分别超声裂解Ad-LAG-3/Ibal病毒转染小胶质细胞和空病毒 转染小胶质细胞，收集细胞总蛋白进行SDS-PAGE，电泳完毕后电转印PVDF膜，洗膜，封闭， 加入兔抗人LAG-3或Ibal多克隆抗体，37°C孵育1小时，洗膜，再加入羊抗兔IgG，37°C孵育 1小时，洗I旲，显色，结果如图3所不。结果显不，Ad_LAG_3/Ibal病毒在小|父质细胞中可以