YTE?生化分析法采用荧光基础，酶偶联形式，并以磷酸化和非 磷酸化的肽对蛋白水解性裂解的不同敏感度为基础。用二种荧光团标记肽底物一每一端一 种一其建立起FRET对。使用放射性量测法定量反应进程，所述放射性量测法计算供体荧光 团在400nm激发后，供体发射与受者发射的比率（发射比率）。
[0754] 在孔中，在1 %DMS0(最终）中筛选化合物。对于10个点的滴定，从起始浓度开 始，进行3倍连续稀释。在适当的激酶缓冲液中，将所有的肽/激酶混合物稀释成2X工作 浓度。在激酶缓冲液（50mMHEPESpH7.5,0.01%BRIJ-35，10mMMgCl2，lmMEGTA)中，将 所有的ATP溶液稀释至4X工作浓度。预先使用f-LYTEK分析法测定ATPKm表观（ATPKm apparent)〇
[0755] 在lOOnM浓度孵育各化合物（除了对于测试针对ABL和ABLT315I的活性，在 10yM的浓度孵育化合物），表B1至B12总结所获得的结果，其显示化合物的抑制能力。还 使用相同的分析法考察0R0512的抑制活性，并且将在lOOnM的0R0512浓度活性被抑制超 过50%的激酶列于表B13中。
[0756] 2)体外细胞增殖分析（表B14至B33)
[0757] 将癌细胞系（5xl03细胞/孔）或HUVEC(1x10 4细胞/孔）或HRMEC(1x10 4细胞/ 孔）分配于96孔板中，用逐步提高的浓度（10nM至3yM) -式二份孵育化合物72小时。使 用MTT(3 [4, 5-二甲基噻唑-2-基]-2, 5-二苯基溴化四唑）测量细胞增殖。利用Graph-Pad 软件（GraphPadSoftware，LaJolla,CA,USA)的Prism5.0,从S型剂量-反应曲线计算 EC50值，该值被归一化为DMS0-处理的对照孔（0% )和1 %SDS对照孔（100% )。
[0758] 3)体内研究（表B34)
[0759] 制备数种异体移植的小鼠模型：
[0760] 1)通过在无胸腺的雄性裸鼠（HSD，6_7周龄）的右侧腹中，皮下植入Ba/F3T315I 细胞（无菌PBS中1x10s细胞/mL)，引发伊马替尼耐药性白血病。当肿瘤体积达到大约50mm3 时，随机分配小鼠为单独载体处理组或0R0512处理组（每组五只小鼠）。用载体（DMS0)或 0R0512(40mg/kg，一天四次；经口，连续11天）处理小鼠。
[0761] 2)在无胸腺的雄性裸鼠（HSD，6_7周龄）的右侧腹中，皮下植入BxPC-3细胞（无菌 PBS中lxlO7细胞/mL)，引发人类胰腺癌模型。当肿瘤体积达到大约100mm3时，随机分配小 鼠为单独载体处理组或0R0512处理组（每组五只小鼠）。用载体（DMS0)或0R0512(20mg/ kg-天四次；经口，连续32天）处理小鼠。
[0762] 3)在无胸腺的雄性裸鼠（HSD，6-7周龄）的右侧腹中，皮下植入IfepG2细胞（无菌 PBS中lxlO7细胞/mL)，引发人类肝细胞癌模型。当肿瘤体积达到大约100mm3时，随机分配 小鼠为单独载体处理组或0R0512处理组（每组五只小鼠）。用载体（DMS0)或0R0512(20mg/ kg-天四次；经口，连续15天）处理小鼠。
[0763] 4)在无胸腺的雄性裸鼠（HSD，6_7周龄）的右侧腹中，皮下植入H1975细胞（无 菌PBS中lxlO7细胞/mL)，引发带有EGFR突变的人类NSCLC。当肿瘤体积达到大约100mm3 时，随机分配小鼠为单独载体处理组或0R0512处理组（每组五只小鼠）。用载体（DMS0)或 0R0512(20mg/kg-天四次；经口，连续22天）处理小鼠。
[0764] 每周用游标卡尺以mm3为单位测定肿瘤体积三次，并使用以下方程式计算：肿瘤体 积（mm3)=长（mm)x宽（mm)x宽（mm)xl/2。一周测量体重三次，且每日观察小鼠以监视压 力迹象，以检测可能的毒性。使用单因素AN0VA进行统计学比较。用Prism5.Ob(GraphPad Software)，通过单因素AN0VA的Bonferroni事后检验分析数据。肿瘤生长抑制（TGI)被 计算为，0R0512处理组的研究结束时的肿瘤生长与单独载体处理组的肿瘤生长相比减少的 百分比。
[0765] 生物学结果：
[0766] 体外激酶分析法揭示数个激酶抑制分子结构。超过20个化合物能够抑制至少4 种测试的激酶（由于在100nM浓度时抑制百分比超过50%，因此预期对这些激酶的每一个， IC50应小于100nM，但ABL以及ABLT315I除外，其IC50预期小于10yM)。应注意，这些 化合物对代表不同和远缘激酶家族的激酶（丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶）展现出抑制活 性，这些激酶参与简介部分中叙述的肿瘤进展的多重通路（血管生成、移动、转移、肿瘤生 长）。这些化合物是广谱多重靶点激酶抑制剂。
[0767] 在模仿血管生成过程的恶性癌细胞系或原代内皮细胞上评估化合物的抗增殖强 度。测定对应于抑制细胞生长水平50%的化合物浓度的EC50。所获得的结果示于表B14 至B233。
[0768] 在这些实验中，我们认为EC50高于3iiM的化合物对测试的细胞类型无活性。具 有1yM和3yM之间EC50的化合物被视为有活性，如索拉非尼（Sorafenib)(其目前市售 用于治疗肝细胞癌）在本文的4种肝癌细胞系（HepG2、HuH7、HuCCTl和HuH6选殖株5)上 呈现1yM和3yM之间的EC50。
[0769] 数个化合物在各试验细胞类型中是细胞生长的高强度抑制剂。除了 0R0616外的 所有试验化合物对HUVEC展现抗血管生成特性。当用化合物处理时，肝母细胞癌和胆管癌 的癌细胞系（HuCCTl和HuH6选殖株5)生长的降低小于其它细胞类型。对于所有其它癌细 胞系，数个化合物高度抑制细胞生长。总之，这些结果表明，本发明的化合物能够阻断肿瘤 生长的至少二个通路（表皮细胞增殖和血管生成）。
[0770] 在携带肿瘤的异体移植小鼠中的体内试验，0R0512显著地引起人类胰腺癌、人 类NSCLC(具有突变形式的EGFR)、人类肝细胞癌模型中的肿瘤生长降低，并且表达突变的 Bcr-AblT315I蛋白的伊马替尼耐药性CML模型中的肿瘤生长稍微降低。
[0771]
[0772] 表B1 -体外激酶分析。使用浓度100yM的ATP，孵育100nM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0773]
[0774] 表B2-体外激酶分析。使用ATP Km表观浓度，孵育100nM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0775]
[0776] 表B3-体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育lOOnM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0777]
[0778] 表B4-体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育lOOnM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0779]
[0781] 表B5-体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育lOOnM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用对照相比的％表示。
[0782]
[0783] 表B6-体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育lOOnM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0784]
[0785] 表B7-体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育lOOnM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0786]
[0788] 表B8-体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育10yM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0789]
[0790] 表B9-体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育10yM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0791]
[0792] 表BIO-体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育lOOnM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0793]
[0794] 表B11 -体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育lOOnM的各化合物。活性 以激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0795]
[0796] 表B12 -体外激酶分析。使用ATPKm表观浓度，孵育lOOnM的各化合物。活性以 激酶的抑制作用与对照相比的％表示。
[0797]
[0798] 表B13 -通过体外激酶分析获得的被0R0512抑制的激酶列表。使用ATPKm表观 浓度孵育l〇〇nM的0R0512。表中列出的激酶是被0R0512抑制的激酶（与对照组比，激酶的 抑制％ >50% )。
[0799]
[0800] 表B14-本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0801]
[0803] 表B15 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0804]
[0805] 表B16-本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0806]
[0807] 表B17 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。 [0808]
[0809] 表B18 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0810]
[0811] 表B19 -本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0812]
[0813] 表B20 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0814]
[0815] 表B21 -本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0816]
[0817] 表B22-本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0818]
[0819] 表B23 -本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0820]
[0821] 表B24 -本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0822]
[0823] 表B25 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0824]
[0833] 表B30 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0834]
[0836] 表B31 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0837]
[0838] 表B32 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0839]
[0840] 表B33 _本发明的化合物对数种癌细胞系和原代内皮细胞的抗增殖活性。
[0841]
[0842] 表B34 -在四种癌症小鼠模型中0R0512的抗肿瘤活性（肿瘤生长抑制-TGI)。 小鼠组（n= 5)每天口服单独载体（DMS0)或化合物0R0512。**P〈0. 05对载体处理组。
【主权项】
1.下式（I)的化合物，和/或其药学上可接受的加成盐、溶剂化物、对映异构体、非对映 异构体，及其混合物：其特征在于， -R1是Q-Ce烷基，优选甲基、乙基或正丙基， -X是邸2或C=0， -R2是氨原子、烷基或面素原子， -Y选自HNC(0)、HNC(S)、HNS02、HNC(0)邸2、HNC(0)畑、HNC(巧畑、C(0)畑、C(0)畑邸2、C&NHC(0)和C&NHC做，和 -R3选自： -被下列单或多取代的苯基： -径基， -面素， -Q-Ce烷基胺，优选二级Ci-Ce烷基胺， -Ci-Cg烷氧基， -Ci-Ce=氣烷氧基，优选=氣甲氧基， -Ci-Cg烷基，优选甲基、异丙基， -Ci-Ce=氣烷基，优选=氣甲基， -杂芳基片段，其任选被Ci-Ce烷基、C1-C己氣烷基、面素和/或径基取化其中所述杂 芳基片段选自二氨苯并巧喃、吗I噪、苯并二氧戊环、苯并=挫、化晚或优选被甲基单取代的 嚷挫， -咪挫，条件为Y是HNC(S)、HNS02、歴"0)邸2、HNC(0)NH、HNC(巧畑、C(0)畑邸2、 邸2畑C(0)、邸2畑C做或C(0)NH，其中NH直接连接至R3，优选Y是HNC做， -杂芳基，其优选自任选被Ci-Ce烷基、Ci-Ce=氣烷基、面素和/或径基取代的二氨苯 并巧喃、吗I噪、苯并二氧戊环、苯并=挫、化晚， -非芳香族单取代的环状基团，优选为环状C3-C1。烷基，其被径基、面素、Ci-Ce烷基胺、Ci-Ce烷氧基、C1-Ce=氣烷氧基、C1-Ce烷基、C1-Ce=氣烷基单取代，和 -选自W下的片段：田2. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于， -X是CHz，和 -R2是烷基或面素。3. 根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于， -R1是Q-Ce烷基，优选甲基、乙基或正丙基， -X是邸2， -R2是甲基或氯原子， -Y选自HNC(0)、HNC(0)邸2、HNC(0)畑、HNC(巧畑、C(0)畑、C(0)畑邸2和CHzN肥（0)， -R3选自： -被下列单取代的苯基：Ci-C己氣烷基、C1-C己氣烷氧基、Ci-Ce烷基、面素、或任选被CFs和/或甲基单取代的嚷挫基团， -被Ci-CeS氣烷基、Ci-Ce烷基胺、和/或径基多取代的苯基， -化晚基团，其任选被Ci-Ce烷基或C1-C己氣烷基取化优选被甲基和/或立氣甲基取 代， -非芳香族环状基团，其选自被Ci-Ce烷基和/或C1-03氣烷基单取代的环状C3-Ci。烧 基，和 -选自W下的片段：4. 根据权利要求1至3任一项所述的化合物，其特征在于， -R1是Ci-Ce烷基，优选甲基、乙基或正丙基， -X是邸2， -R2是甲基， -Y是HNC* (0)，其中C*连接至R3，和 -R3选自：5.根据权利要求1至4任一项所述的化合物，其具有通式（II):其特征在于， -R1是甲基， -X是邸2， -R2是甲基， -Y是HNC* (0)，其中C*连接至R3，和 -R3选自：优选R3是：6. 根据权利要求2-5任一项所述的化合物，其特征在于，X由CH2换成C= 0。7. -种制备根据权利要求1-6所述的化合物的方法，其特征在于，其包含至少一个下 列步骤： a. 在X是C0的情况下，利用肤偶联技术，使用被N02基团取代的芳香族簇酸，优选通过 使用碳化二亚胺或脈阳离子偶联剂，形成NH-C0键；或者如果X是CH2,通过还原胺化反应， 使用被N02基团取代的芳香族醒，优选在氨化棚的存在下，形成NH-CH2键， b. 优选通过氨化反应，如，例如在钮碳存在下的催化剂氨化反应，在氨气氛下，将N02基 团还原成畑2。8. -种制备根据权利要求1-6所述的化合物的方法，其特征在于，所述方法优选在根 据权利要求7所述的方法的步骤（a)和/或化）之后包含下列步骤之一： Cl)在Y是HNC(0)NH的情况下，通过将步骤b)之后获得的化合物与异氯酸醋反应形成 脈， C2)在Y是HNC(巧NH的情况下，通过将步骤b)之后获得的化合物与异硫氯酸醋反应形 成硫脈， C3)在Y是HNS02的情况下，通过将步骤b)之后获得的化合物与横酷基面素如横酷氯 反应形成横酷胺， C4)在Y是HNC0的情况下，通过将步骤b)之后获得的化合物与活化的簇酸如酷氯反应 形成酷胺，或 ce)在Y是HNCS的情况下，通过将步骤C4)之后获得的化合物与劳氏试剂反应形成硫 酷胺，和 d)任选皂化所获得的产物，优选通过使用K0H。9. 根据权利要求1-6任一项所述的化合物，其特征在于，其为药物。10. 根据权利要求1-6任一项所述的化合物，其用于抑制人类或动物疾病中设及的细 胞增殖和/或血管生成。11. 根据权利要求1-6任一项所述的化合物，其用作如下列疾病中的蛋白激酶抑制剂 的用途：癌症，更特别的是液体肿瘤如血液学癌症，如白血病、慢性或急性骨髓增生性疾病； 或实体瘤，如鱗状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、膜腺癌、胶质细胞肿瘤如胶 质母细胞瘤与神经纤维瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀脫癌、乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、子 宫内膜癌、唾腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肉瘤和/或星状细胞瘤W及其它激 酶相关的疾病，优选免疫失调、炎性疾病、血栓疾病、神经退行性疾病、骨病、黄斑变性、纤维 化、囊肿生成、过度增生性疾病。12. 根据权利要求11所述的化合物的用途，其中所述疾病选自肝癌、膜腺癌、肺癌、乳 腺癌、前列腺癌、白血病、肾癌、子宫内膜癌、结直肠癌、化疗抗性癌、黄斑变性。13. -种药物组合物，其特征在于，其含有根据权利要求1至6任一项所述的化合物作 为活性成分，w及药学上可接受的赋形剂。14.根据权利要求13所述的药物组合物，其用作如下列疾病中的蛋白激酶抑制剂的 用途：癌症，更特别的是液体肿瘤如血液学癌症，如白血病、慢性或急性骨髓增生性疾病； 或实体瘤，如鱗状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、膜腺癌、胶质细胞肿瘤如胶 质母细胞瘤与神经纤维瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀脫癌、乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、子 宫内膜癌、唾腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肉瘤和/或星状细胞瘤W及其它激 酶相关的疾病，优选免疫失调、炎性疾病、血栓疾病、神经退行性疾病、骨病、黄斑变性、纤维 化、囊肿生成、过度增生性疾病。15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述疾病选自肝癌、膜腺癌、肺癌、乳腺 癌、前列腺癌、白血病、肾癌、子宫内膜癌、结直肠癌、化疗抗性癌、黄斑变性。16. -种体外预测需要其的患者如呈现癌症的患者是否有可能对根据权利要求1至6 所述的化合物的至少一种产生应答的方法，所述方法包含确定所述患者样本中蛋白激酶的 表达水平、基因修饰、活化状态或突变形式的外观，其中所述蛋白激酶选自下列激酶列表： BRAF、EGFR、FGFR2、邸R、PDGFRA、SRC、ABL、FGFR1、VEGFR1、PDGFRB、ABL2、BLK、BMX、BTK、CSK、 EPHA1、EPHA2、EPHA4、EP皿2、EP皿4、肥R2、ERBB4、阳S、FGR、化T3、FMS、F服、FYN、肥K、LCK、 LYN、MAPK14、E服2、PKC目、RET、VEGFR3和YES。17.-种体外预测被施用于需要其的患者如呈现癌症的患者的至少一种根据权利要求 1-6任一项所述的化合物的方法，其特征在于，其包含下列步骤： e) 使所述化合物与人类组织或细胞的样本接触， f)通过例如IC50和/或通过所存在的蛋白激酶的活性比较，确定化合物对样本的活 性，所述所存在的蛋白激酶可W选自下列激酶列表：BRAF、EGFR、EGFR T790M L858R、FGFR2、 邸R PDGFRA、SRC、ABL、ABL T315I、FGFRl、VEGFRl、PDGFRB、ABL E255K、ABL G250E、ABL Y253F、ABL2、BLK、BMX、BRAF V600E、BTK、CSK、EPHAl、EPHA2、EPHA4、EP皿2、EP皿4、肥R2、 ERBB4、阳S、FGR、化T3、FMS、F服、FYN、肥K、LCK、LYN、MAPK14、E服2、PKC目、RET、VEGFR3和 YES； g) 任选用健康细胞，如所述患者的血液细胞或干细胞或肝细胞，进行与步骤e)相同的 试验，W确定根据权利要求1至6所述的化合物对健康细胞的毒性； h) 选择呈现最佳活性和/或实际上最低毒性的根据权利要求1至6所述的化合物，将 其施用至需要其的患者。
【专利摘要】本发明涉及下式(I)的化合物和/或其药学上可接受的加成盐、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体，及其混合物。本发明的主题因此也包括式(I)化合物的制备，其用途，特别是抑制例如许多疾病如癌症或免疫系统病症中涉及的蛋白激酶的用途。
【IPC分类】A61K31/4375, A61P35/02, A61P35/00, C07D471/04
【公开号】CN105008355
【申请号】CN201380071999
【发明人】G·舍韦, B·戴德-卡扎尔斯, B·福韦尔, C·博里, A·亚里
【申请人】奥里巴斯医药公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2013年12月30日
【公告号】CA2896822A1, EP2938613A1, US20150353540, WO2014102378A1