1] 骨性关节炎患者组：收集2012-2014年在医院就诊，根据1995年美国风湿协会骨 性关节炎的诊断标准，诊断为重度骨性关节炎，有膝关节置换指征的患者病例。
[0032] 其中，临床诊断标准依据1995年美国风湿病协会所制定的标准：
[0033] (1) 1个月内大多数时间有膝痛；
[0034] 似关节活动时响声；
[0035] (3)晨僵不大于30分钟；
[0036] (4)年龄不小于40岁；
[0037] (5)膝关节骨性肿胀伴弹响；
[003引 （6)膝关节骨性肿胀不伴有弹响。
[003引最少存在（（1)、似、（3)、（4)或（1)、似、（3)、妨或（1)、（6)即可诊断0A。
[0040] 样品采集后，选择5例患者组2例对照组送往美吉生物公司进行转录组测序和全 基因组甲基化测序，并提供初步的分析结果。测序结果显示候选基因STK39在骨性关节炎 患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织中甲基化程度明显高于 正常组。
[0041] 实施例2骨性关节炎患者及对照滑膜组织STK39基因表达情况 [004引 1.实验材料
[0043] 选取37例骨性关节炎患者滑膜组织及9例对照滑膜组织，对其进行分组及编号。 病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节置换手术患者；对照组为半月板损伤及交叉 初带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
[0044] 2.实验方法
[0045] 2. 1骨性关节炎患者及对照的滑膜组织总RNA的提取
[0046] 采用I：班巧檢Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操 作按产品说明书进行。
[0047]RNA质量判定标准：RNA样本的0D260/0D280值为1. 7-2. 2之间；总RNA电泳图谱 有清晰的28SU8S条带；70°C水浴保溫1小时后的电泳图谱与水浴保溫前的图谱无明显差 异。
[0048] 2. 2逆转录合成cDNA
[0049]采用S叩crScripl拔IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号 18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0050] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对1 y g总RNA进行逆反录合成cDNA。采用 25 y 1反应体系，每个样品取1 y g总RNA作为模板RNA。获得的CDNA保存放-20°C冰箱备 用。
[0051] 2. 3 Real-Time PCR
[0052] 引物设计
[0053] 采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_013233. 2 (STK39)，内参选 GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
[0054]表 1Real-Time PCR引物序列
[005引操作过程如下：
[0057] ( 一）反应体系：用F*owerSYBR及GreenPCRMasterMixQnvitrogen,货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°C5min预反应，进行40 个循环（95°C15s，60°C45s)的扩增反应。
[0058]表 2Real-Time PCR反应体系
[0059]
[0060]
[006。（二）引物筛选
[0062] 将各样本CDNA混合后，W此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2 y1作模 板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95°C进行融解曲线分析，根 据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
[0063] (S)样品Real-Time PCR检测
[0064] 将各样品CDNA 10倍稀释后取2 y 1作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物 进行扩增。同时在60-95°C进行溶解曲线分析。
[00财3.实验结果
[0066] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增 效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物 溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公 式，比较STK39基因在骨性关节炎组和对照组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果 稳定，其STK39基因在骨性关节炎组中的表达水平仅为对照组织的约=分之一，W上结果 验证了高通量转录组表达数据的整合分析STK39基因在骨性关节炎患者中低表达的结果。
[0067] 实施例3DNA的提取及甲基化修饰
[0068] 1.酪-氯仿抽提法处理DNA
[006引基因组DNA提取采用酪-氯仿抽提法，详细步骤如下：
[0070] (I)取0.Ig软骨组织置于研磨中，加入液氮进行快速研磨，待研磨至粉末状时候， 将其转入是离屯、管中，并加600y1消化缓冲液，再加4y1蛋白酶K(IM)，摇匀后置于55°C水浴中至消化清透；
[00川 似用等体积的重蒸饱和酪，混匀，摇床慢速摇动20min，1000 Og离屯、lOmin，取上 清液；
[0072] (3)加氯仿/异戊醇（24:1)酪：抽提液=1:1:2,混匀，摇床慢速摇动20min，离屯、 后取其上清液；
[0073] (4)加氯仿/异戊醇（24:1):抽提液==1: 1，混匀后再次离屯、取其上清液；
[0074] 妨加0. 1倍体积醋酸钢（3M，抑=5.。和2倍体积冰冻的无水乙醇，混匀，冷冻 过夜；
[00巧]化)4°C，12000g离屯、15min弃上清液；
[0076] (7)沉淀用500y1冰冻的70%乙醇充分洗涂，12000g离屯、5min，弃上清液；
[0077] (8)重复执行步骤7,室溫下自然惊干；
[0078] (9)用30-50y1双蒸水充分溶解沉淀，琼脂糖电泳检测DNA的完整性，-20°C冻存 备用。
[0079] 2.DNA样品的修饰及纯化：
[0080]DNA甲基化的修饰是采用EZDNAMethylatiorTKit狂YMORESEARCH,货号D5002) 进行，原理和经典的亚硫酸氨钢修饰基本相似。经试剂盒处理后，甲基化的胞喀晚未发生变 化，而未发生甲基化的胞喀晚（C)都将变成尿喀晚扣）。再设计分别针对甲基化和非甲基化 序列的特定引物，进行PCR的扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析的方法来确定DNA的甲基化状 态变化。
[0081] 具体步骤：
[008引（I)DNA的准备：将之前提取的DNA双蒸水稀释至25-100yg/ml后吸取20y1置 于PCR管中；
[0083] 似CT转化试剂（ConversionReagent)的制备：一个CT转化试剂管中添加 900y1水，300y1的M-稀释缓冲液和50y1的M-溶解缓冲液，室溫下溶解并震荡IOmin;
[0084] (3)将130y1CT转化试剂、20y1DNA样品添加至PCR管中，若DNA样本体积不 足20y1，可用去离子水补足差量，通过移液枪或者轻弹试管等操作混合样品；
[00财 （4)把样品放到循环变溫器中，先于98°C放置10分钟，再于64°C放置2. 5小时后， 马上进行一下步骤；
[008引 妨将600y1的M-结合缓冲液添加到幻mo-Spin1C?吸附柱中，并将吸附柱放 到收集管中；
[0087] (6)在含有M-缓冲液的幻mo-Spin1C?吸附柱中加入步骤（4)中的样品，封盖后 混匀样本；
[008引 （7)经30秒全速离屯、后去掉流出液；
[008引 做将100y1M-漂洗缓冲液添加到吸附柱中，并全速离屯、30秒；
[0090] (9)将200y1M-硫化缓冲液添加到吸附柱中，于室溫下放置20分钟，培养后全速 离屯、30秒；
[00川（10)将200y1M-漂洗缓冲液添加到柱中，全速离屯、30秒后再添加200y1M-漂 洗缓冲液到柱内，再次全速离屯、30秒；
[009引（11)直接将10y1M-洗脱缓冲液添加到柱中，将吸附柱放置在1. 5ml的EP管内， 全速离屯、洗脱DNA;
[009引重复执行步骤11，EP管内即为所修饰和纯化的DNA;
[0094] (13)DNA储存在-70°C冰箱中备用。
[0095] 实施例4STK39基因甲基化CpG位点的研究
[0096] 选择实施例3中的5个骨性关节炎组提取的DNA和5个对照组提取的DNA(均已 经进行了样品的修饰及纯化，即甲基化的胞喀晚未发生变化，而未发生甲基化的胞喀晚（C) 都将变成尿喀晚扣)）。W相应的BSP引物扩增SEQIDNO. 3 (序列长24化P):
[0097] 〉giI 224589811:169100827-169101071Homo sapiens chromosome 2, GRCh37. plSPrimary Assembly
[0099] 所用引物见表3,用凝胶电泳验证引物设计及是否成功，结果显示均得到目的扩增 片段，其大小与预期的大小一致。
[0100]表 3BSP引物
[0102] 将回收纯化的PCR产物分别与PUC18-T载体连接W构建BSP-PCR产物重组质粒， 然后进行连接产物转化制备感受态细胞，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落。用凝 胶电泳对目的片段克隆的菌落进行PCR鉴定W排除假阳性克隆，筛选正确的克隆进行后续 的测序分析。
[0103] 为提高对克隆甲基化测序结果的有效性，每个实验组选取5个鉴定正确的克隆进 行测序分析。待测序列位