置一共有6个CpG位点。利用SeqMan软件对无明显干扰信号的 测序结果进行序列比对，得到每个克隆中待检测6个CpG位点的甲基化状态。分析结果表 明亚硫酸盐转化效率均达到98%或W上，符合亚硫酸盐转化实验要求，表明BSP分析结果 可靠。结果显示在第3个CpG的位点（89bp)发生了甲基化，对照组未甲基化，说明该位点 的甲基化可能是骨性关节炎致病相关的原因之一。
[0104] 实施例5甲基化特异性PCR(MSP)
[0105] 1.STK39基因甲基化及非甲基化引物设计与合成
[0106] 引物设计后送公司合成。
[0107]表 4MSP引物 [010引
[0109] 2.MSP反应体系
[0110] 表5MSP反应体系
[0111]
[0112] 反应条件：预反应：94°CSmin;反应35个循环（94°C30秒，60°C30秒，72°C30 秒）；延伸72°C5min，反应结束后取出进行琼脂糖凝胶电泳分析。
[011引 3.实验结果
[0114] 非甲基化特异性引物的扩增产物存在，甲基化特异性引物的扩增产物不存在即为 非甲基化；非甲基化特异性引物的扩增产物不存在，甲基化特异性引物的扩增产物存在即 为甲基化。电泳结果显示：37例骨性关节炎患者滑膜组织中，甲基化阳性的有28例，基因 甲基化率为75. 68%，9例对照滑膜组织中甲基化阳性的仅有2例，基因甲基化率为22. 22% (见表6,图1)。
[0115] 表6骨性关节炎组和对照组STK39基因甲基化情况
[0117] 实施例6WB方法检测骨性关节炎滑膜中STK39的表达
[0118] -、蛋白质样品制备及定量
[0119] 1.RIPA裂解液度eyotime)进行蛋白质样品制备，操作步骤如下：
[0120] 将滑膜组织自冰箱取出，用滤纸擦拭组织上的PBS溶液，称取重量，并将滑膜组织 置于机械组织匀浆器中，1:10组织比裂解液的重量体积比例加入相应体积的裂解液进行匀 浆，10000-14000g离屯、3-5分钟，取上清液，按1:1加入样品缓冲液强力混匀后置于100度 的水浴箱水浴加热3-5分钟，1000 Og离屯、10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中。
[0121] 2.利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量
[0122] 采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒（货号：CW2011)，具体步骤见其说明书。
[0123] 二、SDS-聚丙締献胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
[0124] 1.蛋白质样品变性：
[0125]a)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取 物。按照每1微升蛋白样品加入0. 25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上 样缓冲液巧X)。
[0126] b) 100°C或沸水浴加热3-5分钟，W充分变性蛋白。
[0127]C)冷却到室溫后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
[012引 2.胶板制备：
[0129] 采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0. 75mm厚的凝胶，照说明书安装好 玻璃板后，先在小烧杯中配制5ml 10%的分离胶，配方如下：
[0130] 表7分离胶配方
[0131]
[H 30 %丙帰醜胺溶液 1.7ml Tris-HCl(1. 5M,pH8. 8) I.3ml 10%SDS 0. 05ml 10%AP 0. 05ml TEMED 0.002ml 灭菌d册20 补充至5ml
[0132] 混匀后立即灌胶，然后加Iml蒸馈水覆盖，室溫下放置约30min待胶聚合后，用蒸 馈水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2ml5%的浓缩胶，配方如下：
[0133] 表8浓缩胶配方
[0134] 13? [1S 30 %丙帰醜胺溶液 0. 33ml Tris-肥 1(1.OM,P册.8) 0. 25ml
[0135] 混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馈 水和IX蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。
[0136]S、上样及电泳
[0137] 将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满IX蛋白电泳缓冲液，外槽中IX蛋白电泳 缓冲液应超过销丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝 色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
[013引四、蛋白质印迹
[0139] 1.按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。
[0140] 2.预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除 浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开 电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的 滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上， 最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印 夹，将电泳槽放入冰箱内（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印 夹的NC膜应对电泳槽的正极。
[0141] 3.封闭：用IXTBS漂洗一次。加入含5%的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振荡 培养箱中进行封闭；
[0142] 4. 一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗圧PR6394](油128894))杂 交溶液，置于4°C杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进行杂交；
[0143] 5.回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；
[0144] 6.弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗（GoatAnti-R油bitIgG,HRP Con化gated(CW0103))杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；
[0145] 7.弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；
[0146] 8.E化化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒（康为世 纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。
[0147] 9.W0 -Actin作为内参进行数据标准化，W对照组滑膜组织中STK39作为参照样 本，计算实验组中STK39蛋白的相对表达水平。
[0148] 五、实验结果
[0149] 结果显示，37例骨性关节炎患者组中有13例阳性，9例对照组中有7例阳性， STK39蛋白阳性率分别是35. 13%和77. 78,两组差异具有统计学意义。进一步对骨性关节 炎患者组内STK39蛋白表达和基因甲基化状态做相关性分析，结果见图2, 24例STK39蛋白 表达阴性的患者里有22例都出现甲基化阳性，表明STK39蛋白表达和基因甲基化呈负显著 相关性。
[0150] 表9骨性关节炎患者组内STK39蛋白表达和基因甲基化相关性分析
【主权项】
1. 一种检测STK39基因的试剂在制备诊断骨性关节炎诊断制剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断制剂中含有检测STK39基因表达量和 /或检测STK39基因甲基化程度的试剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用下列方式中的一种或几种检测STK39 基因表达量：荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、ELISA法、胶体金法，优选采用引物序列为序 列表SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2进行STK39基因表达量检测。4. 一种治疗骨性关节炎的制剂，其特征在于，所述制剂中含有促进STK39基因的转录 或表达的试剂或化合物。5. -种骨性关节炎诊疗试剂，其特征在于，诊疗试剂组分中的一种或几种用于检测或 降低序列表中SEQIDNO. 3的CpG岛甲基化程度。6. 根据权利要求5所述的诊疗制剂，其特征在于，所述诊疗试剂组分中的一种或几种 用于检测或降低序列表中SEQIDNO. 3的第89bp处CpG岛甲基化程度。7. 根据权利要求5所述的诊疗试剂，其特征在于，采用BSP测序法对SEQIDNO. 3的甲 基化程度进行检测，优选采用引物序列为序列表SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5进行BSP测 序检测。8. 根据权利要求5或6任意一项所述的诊疗试剂，其特征在于，采用甲基化特异性PCR 法对甲基化程度进行检测，优选采用引物序列为序列表SEQIDNO. 6到SEQIDNO. 9进行 甲基化特异性PCR法对甲基化程度进行检测。9. 根据权利要求5所述的诊疗试剂，其特征在于，采用下列方法中任意一种或几种的 组合对甲基化程度进行检测：甲基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSOJi、芯片技术方法； 所述NaHSO3法包括BSP测序法、联合NaHSO3限制性分析法、甲基化特异性PCR、荧光定量法； 所述芯片技术方法包括甲基化高密度芯片、差异甲基化杂交、甲基化特异性寡核苷酸芯片。10. 权利要5-9任意一项所述的诊疗试剂在制备骨性关节炎诊疗工具中的应用。
【专利摘要】本发明涉及STK39基因甲基化位点及其诊治骨性关节炎的应用。发明基于测序分析结果筛选出候选基因STK39，基因分析显示STK39在骨性关节炎患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织中甲基化程度明显高于正常组，进一步的蛋白分析表明STK39蛋白表达和基因甲基化呈负显著相关性。本发明提供了一种新的骨性关节炎诊治靶点，具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68, A61P29/00, A61K45/00, A61P19/02
【公开号】CN105219854
【申请号】CN201510629981
【发明人】孙锦云, 杨承刚
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月29日