培养。当细菌处于对数生长期 时，离屯、收集菌体。菌体沉淀用1/2MS液体培养基（即MS培养基成分减半）洗涂、悬浮，再 离屯、收集。再将菌体用添加lOOmg^乙酷下香酬（A巧的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20 倍用于转化。
[0083] 裸露茎尖用农杆菌感染10分钟，溫度20-28°C。除茎尖部分外，植株其它部位避免 与农杆菌接触。农杆菌感染中，小苗在负压（-〇.〇5MPa)处理下保持15分钟。然后转回到 原固体培养基上，黑暗下共培养2-4天。
[0084] 在弱光下培养1-2天后，将小苗移栽到下层壤±、上层5-6cm赔石的花盆中，用赔 石或其它洁净的介质覆盖苗顶部，隔日诱灌1/2MS培养基无机盐，保持溫度18-28°C。小苗 长出新叶后，在自然光照下生长，待长出3片新叶后，用除草剂处理。
[0085]玉米Basta2mg/l水溶液。
[0086]W叶片掉液滴为宜。未转化的植株无除草剂抗性基因，喷洒后逐渐死亡，转基因植 株则生长正常。
[0087] 植株长到5叶期，定植到溫室。在10叶期进行PCR鉴定和GUS染色。
[0088] 4.转基因植株的PCR检测
[0089] 利用Promega基因组DNA提取试剂盒，按实施例1操作方法提取烟草和玉米叶片 DNA，WpCAM-ZmSUT4p-GUS作为阳性对照，未转基因植株作为阴性对照，不加DNA的作为空 白对照。对转基因植株基因组DNA的ZmSUT4p和GUS片段进行PCR扩增。PCR引物分别为 ZmS4pFW和ZmS4PRev狂mSUT4p扩增）、GUS-563fw:5,gggcgaacagttcctgatta3,和GUS- 563rev:5'ggc曰c曰gc曰c曰tc曰曰曰g曰邑曰〇
[0090] 反应体系：玉米或烟草基因组DNA1. 0μ1 (30ng);;rTaqPreMix12. 5μ1;上游 引物（10μmol/L) 1. 0μL;下游引物（10μmol/L) 1. 0μL;加d地20 至 25μ1。反应条件： 94°(：变性3111111;94°(：变性3〇3,56°(：复性353,72°(：延伸1111111，共35个循环；最后72°(：延伸lOmin。反应产物在1. 0%琼脂糖凝胶电泳上检测（图3)，共检测抗性烟草植株8株，其中4 株阳性，说明外源基因已经整合到烟草的基因组DNA中。玉米芽尖转化材料同样经PCR验 证后，阳性植株进行GUS染色。
[0091] 5.转基因烟草植株的RT-PCR验证
[0092] 利用北京全式金生物技术有限公司的植物RNA提取试剂盒提取总RNA(所取样品 为PCR检测阳性植株），操作方法按说明书进行，反转录及PCR试剂盒购自北京全式金生物 技术有限公司，所用基因特异引物为GUS563fw和GUS563rev，从RT-PCR结果得出4株PCR 阳性材料中的目的基因均有转录，表达水平略有差别，W植株2中的GUS表达量最高。
[0093] 6.转基因植株的GUS染色
[0094] 将长有4-6片真叶的转基因植株的根、幼苗，生长45天的转基因烟草阳性植株，W 及对应时期的野生型本生烟草和转空载体对照植株（各10株）进行GUS染色分析。
[0095] 转空载体对照植株的表型与野生型植株一致。染色结果见图4。图5结果显示， 转基因烟草根、叶片和茎器官维管组织均被染色（图5,B);而野生型烟草相应器官均未被 染色（图5，A) ;GUS染色分析结果表明，ZmSUT4pro启动子确实可W驱动GUS基因在烟草的 根、叶片和/或茎的维管组织表达。
[0096] 对转基因玉米PCR阳性植株的叶片GUS染色，结果如图6,染色结果显示野生型吉 853玉米未被染色（图6，A)，PCR阳性材料的叶片维管组织、叶鞭毛GUS染色明显（图6，B)
[0097] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实 体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示运些实体或操作之间存 在任何运种实际的关系或者顺序。而且，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵 盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要 素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为运种过程、方法、物品或者设备 所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除 在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0098] W上实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例 对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可W对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而运些修改或者 替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
[0099]
【主权项】
1. 一种鹿糖转运蛋白基因启动子ZmSUT4pro,其特征在于，所述启动子序列至少含有 下列核苷酸序列之一的DNA片段： 1) 、序列表中SEQIDNo. 1的核苷酸（DNA)序列； 2) 、与SEQIDNo. 1具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA序列； 3) 、65°C下，在6XSSC和0. 5%SDS溶液试剂中，与SEQIDNo. 1限定的DNA序列杂交 的核苷酸序列。2. 含有权利要求1所述启动子ZmSUT4pr〇的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组 菌。3. 根据权利要求2所述含有启动子ZmSUT4pro的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌，其特征在于，所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。4. 根据权利要求3所述含有启动子ZmSUT4pro的重组载体、表达盒、转基因细胞系 或重组菌，其特征在于，所述重组表达载体为pCAM-ZmSUT4p-GUS，其中空载体为pCAM，在 ZmSUT4pro启动子的下游连接⑶S报告基因。5. 扩增权利要求1所述启动子ZmSUT4pr〇全长或其任意片段的引物对。6. 根据权利要求5所述扩增启动子ZmSUT4pro全长或其任意片段的引物对，其特征在 于，所述引物对为ZmS4pFw和ZmS4pRev。7. 含有权利要求1所述启动子ZmSUT4pro在植物表达中的应用。8. 根据权利要求7所述在植物表达中的应用，其特征在于，所述在植物表达中的应用 具体为在植物根、茎和叶片的表达。9. 根据权利要求8所述在植物表达中的应用，其特征在于，将蔗糖转运蛋白基因 ZmSUT4pro启动子连接于载体中的待表达的外源基因序列上游，从而构建重组表达载体，将 所述重组表达载体连接到植物细胞、组织或器官中进行培育，所述外源基因在分生组织或 胚乳中特异性表达。10. 根据权利要求9所述在植物表达中的应用，其特征在于，所述外源基因受植物激素 与胁迫环境诱导表达，所述植物激素为乙烯利前体1-氨基环丙烷-1-羧酸、细胞分裂素、茉 莉酸甲脂、脱落酸、赤霉素中的一种或二种以上，所述胁迫环境为真菌或病原菌诱导或其混 合诱导。
【专利摘要】本发明公开了一种玉米蔗糖转运蛋白基因启动子ZmSUT4pro及其应用，所述启动子至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：1)序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；2)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)65℃下，在6×SSC和0.5％SDS溶液试剂中，与SEQ？ID？No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明还构建了启动子表达载体pCAM-ZmSUT4p-GUS，本发明的启动子具有跟特异表达调控及多种激素调节相关的顺式作用元件，GUS组织化学染色证实该启动子可用来在植物的根、叶片、茎中表达外源基因，为转基因植物的培育奠定了基础。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/63, C12N1/21, C12N15/113, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105255888
【申请号】CN201510638663
【发明人】贺红霞, 郭嘉, 李毅丹, 陈亮, 柳青, 李楠, 康爽, 刘丹, 薛晶
【申请人】吉林省农业科学院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月30日