min;
[0048] 4)样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2Xloadingbuffer，快速离心混合， 95°C变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4°C，35W，电泳6-7h;
[0049] 5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL双蒸水洗胶4次；
[0050] 6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速 洗胶4次；
[0051] 7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入 500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
[0052] 8)读取条带，确定基因型。
[0053] 下面结合实例对发明做进一步说明：
[0054] 实施例1
[0055] 利用I1327E2F/I1327E2R以及I20E3F/I20E3R两对引物对不同扬子鳄个体MHC基 因进行扩增并对PCR产物进行SSCP分型：
[0056] 1.DNA提取：从-20 °C冰箱中取出加有EDTA抗凝的扬子鳄血液样品，解冻，取 20μL于1. 5mL离心管中，消化过夜后，用酚-氯仿抽提法提取血液样品中的基因组DNA。用 分光光度计检测提取所得DNA溶液的浓度，用1 %琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNAmarker 检测提取所得DNA片段的长度范围及质量，取些许DNA原液稀释至浓度约为200ng/μL的 稀释液，-20°C条件下保存。
[0057] 2.PCR扩增：以合格的DNA稀释液为模板，利用本发明设计的I1327E2F/I1327E2R 以及I20E3F/I20E3R两对引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为10yL:扬子鳄基因组DNA稀 释液0.8 4 1^，上下游引物各0.2 4 1^，超纯水4.4 4 1^，2\1]1七抑丁&9]\&18七6『]\^叉4.4 4 1^。？〇? 反应程序为：95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，66°C退火30秒，72°C延伸30秒，共34个 循环，最后72°C延伸10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNAmarker检测扩增产 物的质量，两对引物均能在扬子鳄DNA样品中顺利扩增得到明亮的单一条带，展现了稳定 的位点特异扩增能力。
[0058] 3.对PCR产物进行SSCP分型，操作如下：
[0059] 1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装 板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
[0060] 2)制备12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板 间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
[0061] 3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用 装满0. 5XTBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0. 5XTBE，预电泳20min;
[0062] 4)样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2Xloadingbuffer，快速离心混 合，95°C变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4°C，35W功率下电泳 6h30min；
[0063] 5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL双蒸水洗胶4次；
[0064] 6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速 洗胶4次；
[0065] 7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入 500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
[0066] 8)读取条带，确定基因型。
[0067] 4.SSCP分型结果如图2所示，扬子鳄MHC基因在I1327E2F/I1327E2R以及I20E3F/ I20E3R的扩增位点上均显示相同的SSCP带型，即呈单态。
[0068] 实施例2
[0069] 利用I1327E3F/I1327E3R，120E2F/I20E3R两对引物对不同扬子鳄个体MHC基因进 行扩增并对PCR产物进行SSCP分型：
[0070] 1.DNA提取：从-20 °C冰箱中取出加有EDTA抗凝的扬子鳄血液样品，解冻，取 20μL于1. 5mL离心管中，消化过夜后，用酚-氯仿抽提法提取血液样品中的基因组DNA。用 分光光度计检测提取所得DNA溶液的浓度，用1 %琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNAmarker 检测提取所得DNA片段的长度范围及质量，取些许DNA原液稀释至浓度约为200ng/μL的 稀释液，-20°C条件下保存。
[0071] 2.PCR扩增：以合格的DNA稀释液为模板，利用本发明设计的I1327E3F/I1327E3R， 120E2F/I20E3R两对引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为10μL:扬子鳄基因组DNA稀释液 0.8 4 1^，上下游引物各0.2 4 1^，超纯水4.4 4 1^，2\1]1七抑丁&9]\&18七6『]\^叉4.4 4 1^。？〇?反 应程序为：95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，63°C退火30秒，72°C延伸30秒，共34个循 环，最后72°C延伸10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNAmarker检测扩增产物 的质量，三对引物均能在扬子鳄DNA样品中顺利扩增得到明亮的单一条带，展现了稳定的 位点特异扩增能力。
[0072] 3.对PCR产物进行SSCP分型，操作如下：
[0073] 1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装 板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
[0074] 2)制备12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板 间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
[0075] 3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用 装满0. 5XTBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0. 5XTBE，预电泳20min;
[0076]4)样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2Xloadingbuffer，快速离心混 合，95°C变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4°C，35W功率下电泳 6h30min；
[0077] 5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL双蒸水洗胶4次；
[0078] 6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速 洗胶4次；
[0079] 7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入 500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
[0080] 8)读取条带，确定基因型。
[0081] 4.SSCP分型结果图 3、图 4 所示，扬子鳄MHC基因在I1327E3F/I1327E3R，120E2F/ I20E3R扩增位点上均显示出三种不同的带型，根据带型可分为AA型，BB型以及AB型。
【主权项】
1. 一种用于扬子鳄抗病毒潜力检测的I类MHC基因的单位点特异性扩增引物组，其特 征在于，引物组共包含四对特异性引物，每对引物的名称、具体引物序列如下： 引物对一：上游引物I1327E2F :GTGGGTAAGCGGCCCTCTGC ; 下游引物I1327E2R:CTGCCCTCCCTGCCCCCCCCG; 引物对二：上游引物I1327E3F :AGGGGCCTGGATCTGTGTTTG ; 下游引物I1327E3R:CCTGGTTAGTGCTGCCGTTA ; 引物对三：上游引物I20E2F :GCCCGCTAGTGCTGACCATC ; 下游引物I20E2R:CCTGCTCACACCTGCCTGCTA ; 引物对四：上游引物I20E3F :TCAGCCTGGAAGCCCTCAA ; 下游引物I20E3R :GGCGGGAATTGCCTGGGT。2. -种扬子鳄抗病毒潜力检测的I类MHC基因的分型方法，其特征在于采用权利要求 1所述PCR引物对，进行PCR反应，每对引物均在10μLPCR体系中进行目标片段扩增，然后 将扩增产物分别利用SSCP进行基因分型。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的10μLPCR体系为：扬子鳄个体基 因组DNA0. 8μL，上游引物 0· 2μL，下游引物 0· 2μL，超纯水 4. 4μL，2XUltraTaqMaster Mix4· 4μL〇4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的程序为：95°C预变性5分 钟，95°C变性30秒，各引物对相应退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，共34个循环，最后 72 °C延伸10分钟。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序中，所述引物对一、引物 对四的退火温度为66°C;所述引物对二、引物对三的退火温度为63°C。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法中，固定后、银染后以 及显色后应分别使用双蒸水洗胶4次，以获得清晰的SSCP条带。7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述SSCP分型的方法是： 1) 用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将 间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上； 2) 制备12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确 认无气泡存在后插入梳子，常温平置； 3) 待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满 0. 5XTBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0. 5XTBE，预电泳20min; 4) 样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2Xloadingbuffer，快速离心混合，95°C变 性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4°C，35W，电泳6-7h; 5) 将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入 500mL双蒸水洗胶4次； 6) 加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶 4次； 7) 加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固 定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次； 8) 读取条带，确定基因型。
【专利摘要】本发明涉及用于一套扩增扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类主要组织相容性复合物基因序列的单位点特异性引物及分型方法，引物的具体序列如SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.8所示。本发明的扩增引物，在扬子鳄种群内具有稳定的单位点特异扩增能力，其扩增得到产物可以通过后续的单链构象多态性检测(single？strand？conformation？polymorphism,SSCP)实验对不同的个体进行基因分型，实现对种群中扬子鳄个体Ⅰ类MHC基因多态性的评估，检测其抵抗病毒性疾病的潜力，为扬子鳄保护工作中的新种群奠基者选择、野化放归个体选择以及人工配对等工作提供重要参考。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105349535
【申请号】CN201510737487
【发明人】方盛国, 万秋红, 倪小伟
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月3日