0147]
[0148] 按照实施例5公开的方法，由5-(2, 5-二氯啼陡基-4-氨基）戊酸（53mg, 0. 2mmol) 和N-(5_氨基-2-氟苯基）丙烯酰胺（40mg,0. 4mmol)制备得到灰色固体5-(2-(3-丙烯 酰胺基-4-氟苯基氨基）-5-氯嘧啶基-4-氨基）戊酸（40mg，50% yield)。LC-MS(m/ z)408(M+l) 〇
[0149] 实施例24 5-(2-(3-丙烯酰胺-4-氟苯基氨基）-5-氯嘧啶基-4-氨基）-N_ (2-氨 基_4_氟苯基）戊酰胺的制备
[0151] 按照实施例6公开的方法，由5-(2-(3-丙烯酰胺基-4-氟苯基氨基）-5_氯嘧啶 基-4-氨基）戊酸（40mg, 0. lmmol)和4-氟邻苯二胺（50mg, 0. 4mmol)制备得到白色固体 5- (2- (3-丙烯酰胺-4-氟苯基氨基）-5-氯啼陡基-4-氨基）-N- (2-氨基-4-氟苯基）戊 酰胺（30mg, 60 % yield)。1H NMR(DMS0-d6) δ 1. 49-1. 61 (m, 4H, 2XCH2), 2. 36-2. 38(m, 2 H, CH2), 3. 36-3. 38 (m, 2H, CH2), 5. 26 (s, 2H, NH2), 5. 73 (d, J = 9. 9Hz, 1H, CH), 6. 26 (d, J = 15. 6Hz, 2H, Ar-H), 6. 48 (d, J = 10. 6Hz, 1H, CH), 6. 49-6. 64 (m, 1H, CH), 7. 12-7. 14 (m, 1H, Ar -H), 7. 15-7. 16 (m, 1H, Ar-H), 7. 20-7. 22 (m, 1H, Ar-H), 7. 48-7. 49 (m, 1H, miazine-NH), 7. 94 (s, 1H, miazine-H), 8. 27 (s, 1H, Ar-H), 9. 24 (s, 1H, benzene-NH), 9. 30 (s, 1H, benzene-NH), 9.95 (s, 1H, benzene-NH). LC-MS(m/z)516(M+l)。
[0152] 实施例25酶学活性检测
[0153] 实验主要原理
[0154] 体外酶学活性检测的基本原理是利用荧光标记的特异性底物，在激酶作用下进 行磷酸化，磷酸化底物和非磷酸化底物在不同波长会产生强弱不同的荧光信号（445nm与 520nm)。当加入不同测试化合物时，其对激酶活性的抑制体现为底物磷酸化的程度，从而表 现出不同的荧光信号，并以此计算化合物对激酶的抑制活性。基本的检测原理如图1所示， 图1为本发明实施例激酶活性检测原理示意图。
[0155] 酶学抑制活性检测利用GST标记的人重组JAKs激酶JAK1/PV4774、JAK2/ PV4210、JAK3/PV3855、TYK2/PV4790 及其相应的特异性底物 Tyr6( Z'-LYTE? Kinase Assay Ki t_Tyro s ine6Pept i de , JAK1/PV4 1 22)、Tyr4 ( Z'-LYTE? Kinase Assay Kit-Tyrosine4Peptide, JAK2/PV3193) > Tyr4 ( Z'-LYTE1? Kinase Assay Kit-Tyrosine4Peptide, JAK3/PV3193) > Tyr3 ( Z'-LYTE? Kinase Assay Kit_Tyrosine4Peptide，TYK2/PV3192)。检测试剂均为显色剂 A (Development reagent A， PV3297)。上述所有材料均从Invitrogen公司购买。
[0156] 实验主要过程
[0157] 实验过程按照检测试剂使用说明书要求的流程进行（Invitrogen)。流程如下：
[0158] (1)实验准备：按照要求配制激酶反应缓冲液（工作液），用激酶反应缓冲液将测 试化合物稀释成不同浓度梯度（对JAK1、JAK2检测，化合物最高浓度均为10 μ Μ ;对JAK3 检测，化合物最高浓度为1 μ Μ)。
[0159] (2)酶学反应体系10 μ L，包括2. 5 μ L测试化合物、5 μ L激酶反应缓冲液和2. 5 μ L ATP溶液（试剂盒提供），混匀后，室温反应lh。
[0160] (3)检测反应同时设置有对照反应，包括未添加测试化合物的0抑制对照、未添加 ATP的0磷酸化对照以及添加磷酸化底物的阳性对照。所有检测采用复孔。
[0161] (4)酶学反应结束后，加入5yL预先配制的显色反应缓冲液，室温反应lh。随后 加入5 μ L终止缓冲液终止反应。
[0162] (5)使用突光检测仪（Ascent Fluoroskan FL reader，Thermo Labsystems)检测 每孔的荧光信号，激发波长为400nm，检测的发射波长分别为445nm和520nm。底物磷酸化 的比例参照荧光信号强度C445/F520。
[0163] (6)测试化合物的酶学抑制率计算公式：抑制率（％)= 1-检测孔底物磷酸化/0 抑制对照孔磷酸化率。
[0164] 选取的阳性对照物为CP690550,结构式如下：
[0166] 根据上述实验方法，对本发明所述通式I化合物进行体外酶学活性检测，实验结 果见表2,表2为本发明实施例提供化合物对JAK激酶体外抑制活性结果。
[0167] 表2本发明通式I化合物对JAK激酶体外抑制活性结果
[0169] 表1中，实施例化合物的抑制活性为与阳性对照物相比的抑制活性。
[0170] 表1中，对JAK3、JAK2,测试化合物浓度为30nM ;对JAK1检测，测试化合物浓度为 300nM〇
[0171] 由表1可知，与全抑制剂CP-690550相比，本发明提供的化合物对JAK激酶具有选 择性抑制作用，对JAK3激酶抑制作用较为显著，而对JAK2激酶和JAK1激酶抑制活性不显 著，可以用作选择性JAK3蛋白激酶抑制剂。
[0172] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 式（I)所示的嚼巧衍生物或其药学上可接受的盐：其中， A选自6~10元的芳香环或5~10元的杂芳环； X为因素； R1独立地选自氨、氛基、因素、氨基、居基、C1~C6的烷基或因代烷基、C1~C6的烷氧 基中的一个或多个； R2独立地选自氨或因素中的一个或多个； R3为氨或C1~C6的烷基或取代烷基；η为1到7的整数； Ρ为0到3的整数。2. 根据权利要求1所述的嚼巧衍生物，其特征在于，Ar为苯环或化巧环。3. 根据权利要求1所述的嚼巧衍生物，其特征在于，Ri独立地选自氨、氯基、氣、氨基、 Η氣甲基中的一个或多个，R2选自氨或氣，R3选自氨或甲基。4. 根据权利要求1所述的嚼巧衍生物，其特征在于，A为苯环；Ri独立地选自氣、氨基、 Η氣甲基中的一个或多个；R2为氣；R3为甲基；η为4,P为0。5. 根据权利要求1所述的嚼巧衍生物，其特征在于，具有式（1)~式（10)结构：6. -种式（I)所示的嚼巧衍生物的制备方法，包括： 将通式（VI)化合物与通式（VII)化合物在有机溶剂和催化剂作用下形成通式为（I) 的化合物；其中， A选自6~10元的芳香环或5~10元的杂芳环； R1独立地选自氨、氛基、因素、氨基、居基、C1~C6的烷基或因代烷基、C1~C6的烷氧 基中的一个或多个； R2独立地选自氨或因素中的一个或多个； R3为氨或C1~C6的烷基或取代烷基；η为1到7的整数； Ρ为0到3的整数。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂选自1-己基-3-(3-二甲 胺丙基）碳二亚胺、Ν，Ν'-二环己基碳二亚胺或Ν，Ν'-碳醜二咪哇。8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自苯、甲苯、四氨巧 喃、1，4-二氧六环、二氯甲焼、氯仿或Ν，Ν-二甲基甲醜胺。9. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述通式（VI)化合物按照W下方法 制备： 将通式（IV)化合物与通式（V)化合物在有机溶剂和催化剂的作用下形成通式为（VI) 的化合物；10. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂选自Η氣己酸、盐酸或 甲礙酸。11. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自异丙醇或正了 醇。12. -种药物制剂，包括权利要求1~5任意一项所述的嚼巧衍生物或其药学上可接受 的盐W及药学上可接受的辅料。13. 根据权利要求12所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊剂、粉剂、糖 浆、液剂、悬浮剂、针剂或膏剂。14. 权利要求1~5任意一项所述的嚼巧衍生物或其药学上可接受的盐或权利要求11 或12所述的药物制剂在制备JAK3激酶抑制剂中的应用。15. 权利要求1~5任意一项所述的嚼巧衍生物或其药学上可接受的盐或权利要求11 或12所述的药物制剂在制备预防或治疗与JAK3激酶活性异常相关的疾病的药物中的应 用。16. 根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述疾病为自身免疫性疾病、炎症性疾 病、癌症、骨髓增生性疾病、骨再吸收疾病或器官移植排斥疾病。17. 根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述疾病为类风湿性关节炎、克罗恩 病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、过敏性疾病、哮喘、慢性阻塞性肺 病、白血病或淋己瘤。
【专利摘要】本发明提供了式(I)所示的嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、其制备方法及其应用。式(I)所示的嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐具有JAK激酶抑制活性，尤其对JAK3激酶具有选择性的、较高的抑制活性，可以用于制备JAK3激酶抑制剂，用于制备预防或治疗与JAK3激酶活性异常相关的疾病的药物，从而预防或治疗与JAK3激酶活性异常相关的疾病。
【IPC分类】A61P3/10, A61P25/00, A61P37/06, A61P35/00, C07D401/12, C07D239/48, A61P11/06, A61P35/02, A61P37/08, A61K31/505, A61P19/08, A61P29/00, A61P37/00, A61P11/00, A61P19/02, A61K31/506, A61P17/06
【公开号】CN105399686
【申请号】CN201410472716
【发明人】鲁先平, 余金迪, 杨千姣, 李志斌, 潘德思, 山松, 朱江飞, 王祥辉, 刘湘衡, 宁志强
【申请人】深圳微芯生物科技有限责任公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2014年9月16日