专利名称：水稻OsSPX1蛋白及其编码基因在调控植物种子结实率中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻OsSPXl蛋白及其编码基因在调控植物种子结实率中的应用。
背景技术：
种子结实率是形成作物产量的一个重要因素。影响水稻种子结实率因素比较多，包括遗传与环境因素。在水稻中挖掘与种子结实率相关的优异基因，并把它们应用于水稻 育种生产中，具有十分重要的理论意义和实践价值，也是当前提高水稻高产育种的一条行之有效的途径。本发明人研究小组在研究耐低温和响应低磷胁迫相关的水稻SPX基因功能时发现该基因同时具有影响水稻种子结实率的效能，可能对水稻产量产生影响，在农业生产上具有较强应用价值的基因。已有一些研究表明含有SPX(SYGl/Pho81/XPRl)结构域的基因参与磷的信号转导和调节途径。SPX是约180个氨基酸长，存在于3种已知蛋白(SYGl、Pho81和XPR1)N末端的一个结构域，其名称来源于这三种蛋白的首字母。早在1995年，Spain等人研究发现酵母SYGl的N末端可与G-蛋白结合从而抑制交配信息素(mating pheromone)的信号转导；在磷饥饿条件下，有报导CDK抑制子Pho81可抑制PH080-PH085及Pcl7_Pho85复合体的酶活性；Poleg等人(1996),在真菌Neurospora crassa中发现,与PH081结构相似的NUC-2蛋白可感知磷的存在并参与磷转运的调节途径。2002年，Hamburger等人在拟南芥中亦发现一类SPX基因，即PHOl (具有SPX结构域和EXS结构域)基因和PHOl类似蛋白，它们可参与磷由根到茎的运输，并在根的微管束细胞中特异表达。
发明内容
本发明的一个目的是提供水稻OsSPXl蛋白的新用途，该蛋白质的氨基酸序列如序列表序列3所示，所述新用途为序列表序列3所示蛋白可用于调控目的植物的种子结实率，或调节序列表序列3所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物的种子结实率。本发明的另一个目的是提供一种培育低结实率或低种子产量转基因植物的方法，该方法是降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的编码基因的表达，得到种子结实率和实粒数中至少一种性状低于所述目的植物的转基因植物。在上述方法中，所述降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的编码基因的表达是通过将序列表序列3所示蛋白编码基因的互补序列导入目的植物中实现的。本发明还提供另一种培育高结实率或高种子产量转基因植物的方法，该方法是将序列表序列3所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到种子结实率和实粒数中至少一种性状高于所述目的植物的转基因植物。
在上述两种方法中，所述序列表序列3所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)的基因I)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列3所不蛋白的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列3所示蛋白的DNA分子；所述严格条件可为如下50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0. I % SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS、0. 5MNa3POjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC，0. I % SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0. 5X SSC, 0. 1% SDS 中漂洗；还可为50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0. I X SSC,0. 1% SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65°C，0. I XSSC,0. 1% SDS中漂洗；也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 I X SSC, 0. 1% SDS 各洗膜一次。在上述应用和方法中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。在上述应用和方法中，所述单子叶植物具体可为水稻。本发明的另一个目的是提供一种DNA分子，该DNA分子的核苷酸序列为所述序列表序列3所示蛋白编码基因的互补序列，该DNA分子导入目的植物后可降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的编码基因的表达，从而降低目的植物的种子结实率和实粒数。含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围；所述含有所述DNA分子的重组载体具体可为pCOU OsSPXl_antisense,所述pC0U0sSPXl_antisense是将核苷酸序列如下的DNA片段经限制性内切酶BglII和KpnI双酶切后插入PCambial301-UbiN多克隆位点的BglII和KpnI酶切位点之间得到的重组载体由5’至3’端依次为限制性内切酶BglII识别序列、序列表序列2所示核苷酸序列互补序列和限制性内切酶KpnI识别序列。本发明还提供一种用于鉴定序列表序列3所示蛋白编码基因表达的PCR引物对，所述PCR引物对由序列表序列4所示的单链DNA和序列表序列5所示的单链DNA组成；或由序列表序列6所示的单链DNA和序列表序列7所示的单链DNA组成。实验证明，转pCOU OsSPXl_antisense的水稻株系与非转基因日本晴相比，其水稻OsSPXl基因的相对表达量明显降低，同时种子结实率和实粒数也显著降低。本发明在研究植物种子产量性状形成方面具有重要应用价值。
图I为水稻OsSPXl基因的正反义重组表达载体T-DNA区的结构示意图。其中，图A为正义重组表达载体，图B为反义重组表达载体，图A和B中的LB和RB分别代表T-DNA的左臂和右臂，Nos代表胭脂碱合酶终止子，Hpt II代表潮霉素磷酸转移酶基因，CaMV35s代表花椰菜花叶病毒35s启动子，Ubi代表玉米泛素启动子，OsSPXl代表序列表序列2所示的水稻OsSPXl编码基因图2为转基因水稻株系的PCR鉴定电泳图。其中，图A为转pCOU 0sSPXl_antisense的Ttl代转基因水稻株系的鉴定结果，泳道M为分子量标准，从上到下的片段依次为5kb，3kb，2kb，lkb，750bp，500bp，250bp，100bp，泳道8为非转基因日本晴，泳道1-7为待鉴定的T0代转pCOU OsSPXl_antisense水稻株系；图B为转pCOU OsSPXl的T0代转基因水稻株系的鉴定结果，泳道M为分子量标准，从上到下的片段依次为5kb，3kb，2kb，lkb，750bp，500bp, 250bp, IOObp，泳道9为非转基因日本晴，泳道1-8为待鉴定的Ttl代转pCOUOsSPXl水稻株系。图3为实时定量RT-PCR检测转基因水稻株系中OsSPXl基因的相对表达水平。其中，A为转正义重组表达载体的水稻株系，B为转反义重组表达载体的水稻株系。图4为T1代转pCOU OsSPXl的水稻植株和转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻植株与非转基因日本晴种植于大田的表现。图5为T1代转pCOU OsSPXl的水稻植株和转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻植株与非转基因日本晴上所收获的小穗表型。图6为T1代转pCOU OsSPXl的水稻植株和转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻植株与非转基因日本晴上所结种子的表型。图7为T1代转pCOU OsSPXl的水稻植株和转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻植株与非转基因日本晴上所结种子的总粒数、实粒数、结实率和种子千粒重的柱形统计图，其中的Nipponbare为非转基因日本晴。
具体实施例方式下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。日本晴(Oryza sativa L. cv. Nipponbare):中国农业大学保证向公众提供；参考文献Gene expression profiles deciphering rice phenotypic variation betweenNipponbare (Japonica) and 93-11(Indica) during oxidative stress. PLoS One. 2010Jan8,5(1)。根癌农杆菌EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105):中国农业大学保证向公众提供；参考文献Toki S, Hara N, Ono K, Onodera H, Tagiri A, Oka S, TanakaH. 2006. Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speedtransformation of rice. Plant. J. 47 (6) :969_76。实施实例I、水稻OsSPXl基因及其蛋白的获得以4°C低温处理12h的水稻日本晴(Oryza sativa L. cv. Nipponbare)芽期(发芽7-10天的幼苗)植株为材料，利用TRIZOL试剂提取总RNA，并以总RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，再以此cDNA为模板，在引物⑶S-PF和引物⑶S-PR的引导下，用常规PCR法扩增水稻SPX基因的cDNA序列，反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约900bp的DNA片段，对该片段进行测序。
引物CDS-PF :5’ -ATAGATCTATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3J (带下划线部分序列为限制性内切酶BglII识别位点及保护碱基)；引物CDS-PR :5’ -GCGGTACCTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3’ (带下划线部分序列为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基)。测序结果表明，上述约900bp的DNA片段含有序列表序列2所示的888bp核苷酸序列，该888bp核昔酸序列为OsSPXl基因的编码序列，编码具有序列表序列3所不的由295个氨基酸组成的蛋白，将该蛋白命名为OsSPXl，该蛋白自氨基端(N端)第1-169位氨基酸 残基为SPX蛋白结构域。OsSPXl的基因组DNA定位于水稻第六号染色体的23，875，408bp至23，879，965bp(其序列如序列表序列I所示)，其NCBI定位号为NP_001058013，NCBI基因号(GENE ID)为:0s06g0603600，TIGR 号为 L0C_0s06g40120。实施例2、水稻OsSPXl基因正反义重组表达载体的构建将步骤I中PCR扩增得到的约900bp的含有序列表序列2所示核苷酸序列的DNA片段用BglII和KpnI进行双酶切，回收纯化后插入到植物表达载体pCambial301-UbiN(GenBank号AF234297)多克隆位点的BglII和KpnI酶切位点之间，得到OsSPXl基因的正义重组表达载体，将该正义重组表达载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明含有序列表序列2所示核苷酸序列的正义重组表达载体命名为pCOU OsSPXl，其T-DNA区的结构示意图如图I中的A所示。同时，构建OsSPXl的反义重组表达载体，具体方法如下设计引物5，_GCGGTACCATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3’ (带下划线部分序列为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基)和5’ -ATAGATCTTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3 (带下划线部分序列为限制性内切酶BglII识别位点及保护碱基)，按照实施例I相同的方法进行PCR扩增，回收纯化约900bp的PCR产物，用BglII和KpnI进行双酶切，回收纯化后插入植物表达载体PCambial301-UbiN多克隆位点的BglII和KpnI酶切位点之间，得到OsSPXl基因的反义重组表达载体，将该反义重组表达载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明含有与序列表序列2所示核苷酸序列互补的序列的反义重组表达载体命名为pCOU OsSPXl_antisense，其T-DNA区的结构示意图如图I中的B所示。实施例3、转基因水稻的获得将实施例2构建的水稻OsSPXl的正义重组表达载体pCOU OsSPXl、反义重组表达载体pCOU OsSPXl_antisense用农杆菌转化法转化水稻日本晴(Oryza sativa L. cv.Nipponbare)的成熟胚诱导的愈伤组织,具体方法如下I、将pCOU OsSPXl和pCOU 0sSPXl_antisense分别用电击法转化根癌农杆菌EHA105 得到含有 pCOU OsSPXl 的重组农杆菌 EHA105/pC0U OsSPXl 和含有 pCOU 0sSPXl_antisense的重组农杆菌EHA105/pC0U 0sSPXl_antisense共两种重组农杆菌。将上述两种重组农杆菌分别接种于YEB液体培养液(含100 U g/ml卡那霉素和75iig/ml利福平)中，28°C振荡培养至0D_为0.6-0. 8 ;以10，OOOrpm室温离心Imin,用MS盐溶液(pH 5. 8)重悬菌体并稀释至原培养液菌浓度的20-50倍，得到两种重组农杆菌的菌悬液。上述MS 盐溶液的配方NH4NO3L 65g、KNO3L 9g、KH2PO4O. 17g、MgSO4 7H20 0. 7g、CaCl2 2H20 0. 44g、MnSO4 4H20 22. 3mg、ZnSO4 7H208. 6mg、H3B036. 2mg、KI 0. 83mg、Na2MoO4 2H20 0. 25mg、CoCl2 6H20 0. 025mg、CuSO4 5H20 0. 025mg、FeSO4 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA 2H20 37. 3mg、肌醇 lOOmg、烟酸(B5)O. 5mg、盐酸吡哆醇(维生素 B6)0. lmg、盐酸硫胺素(维生素B^o. 5mg、甘氨酸2. Omg,用水定容至1L。2、将灭菌后的水稻日本晴(WT, Oryza sativa L. cv. Nipponbare)种子接种于N6D培养基(PH5. 8)上，32°C培养1-5天，去除芽和残留胚乳后再继代培养10-20天，得到成熟胚愈伤组织。
上述N6D 培养基的配方KN032. 83g/L、(NH4)2SO4O. 463g/L、MgSO4 7H20 0. 185g/L、CaCl2O. 166g/L、KH2PO4O. 4g/L ；MnSO4 4H20 4. 4mg/L、ZnSO4 7H20 I. 5mg/L、KI 0. 8mg/L、H3BO3L 6mg/L、FeSO4 7H20 27. 8mg/L、Na2EDTA 2H20 37. 3mg/L ;2，4_D 2mg/L, CH :0. 3g/L,L-脯氨酸2. 878g/L,鹿糖30g/L,固化剂4g/L。3、将步骤2得到的成熟胚愈伤组织平均分成2组，每组分别浸于步骤I得到的两种农杆菌菌悬液中，轻轻晃动约I. 5min，接种于含有10-20mg/L乙酰丁香酮的N6D培养基(DH = 5. 2)上，该培养基上预先垫有一层浸有0. 5毫升AAM培养基(Hiei，Y.，S. Ohta,TKomari andT. Kumashiro. 1994. Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.Plant J. 6 :271-282.)的无菌滤纸，25°C黑暗条件下共培养3天。4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于含有50mg/L潮霉素(hygromycin B)和250mg/L羧苄青霉素(carbenicillin)的RE分化培养基(pH 5. 8)中培养1-2周后，选取生长旺盛的抗性愈伤组织进行分化、壮苗，获得分别转pCOU OsSPXl和pC0U0sSPXl_antisense的Ttl代转基因水稻株系。上述RE 分化培养基的配方=NH4NO3L 65g/L、KNO3L 9g/L、KH2PO4O. 17g/L、MgSO4 7H20 0. 7g/L、CaCl2 2H20 0. 44g/L、MnSO4 4H20 22. 3mg/L、ZnSO4 7H20 8. 6mg/L、H3BO36. 2mg/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、CoCl2 6H20 0. 025mg/L、CuSO4 5H200. 025mg/L、FeSO4 7H20 27. 8mg/L、Na2-EDTA 2H20 37. 3mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸(B5) 0. 5mg/L、盐酸卩比卩多醇(维生素B6) 0. 5mg/L、盐酸硫胺素(维生素1^)0. lmg/L,鹿糖30g/L，山梨醇30g/L，酸水解酪蛋白2g/L，a-萘乙酸0. 02mg/L，激动素2mg/L，呋喃甲基腺嘌呤2mg/L,植物凝胶4g/L。T0代表示转基因当代植株，T1代表示Ttl代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。5、转基因水稻株系的PCR鉴定将步骤4获得的两种水稻转基因株系内的所有植株叶片分别提取基因组 DNA，进行 PCR 扩增，引物为 HPT-F :5’ -TACTTCTACACAGCCATC-3’ 和 HPT-R 5’ -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3’，靶序列为潮霉素磷酸转移酶基因的部分序列，预测目的产物片段长度947bp，结果与预期相符，部分扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。共获得阳性转pCOU OsSPXl的Ttl代转基因水稻株系8个，阳性转pC0U0sSPXl_antisense的Ttl代转基因水稻株系9个。实施例4、转基因水稻的实时定量RT-PCR检测分别取非转基因日本晴、按照实施例3中步骤5的PCR鉴定呈阳性的T1代转pCOUOsSPXl的水稻株系2个和按照实施例3中步骤5的PCR鉴定呈阳性的转pC0U0sSPXl_antisense的水稻株系2个在大田种植约120天的植株旗叶，利用TRIZOL试剂提取总RNA，以此RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，利用表I所示的专用引物，进行实时定量RT- PCR检测。表I、水稻各转基因株系的实时定量RT-PCR扩增引物
检测的水稻株系_I编I引物(5'端到3'端)I序列I IE序列_目的
反应体系4U I cDNA 模板(2ng/ U I), 4. 5 U I SYBR Green Master Mix, I u I 特异引物,0. I ddH20。扩增程序(利用MJ Research公司生产的检测系统)95 V 5min, I个循环，95 °C 30s, 60 °C 30s,读板(read plate) ,85 °C Is 读板(read plate),共 40 个循环，72°C 2min，65°C _95°C每隔0. 2°C作溶解曲线。上述实验设3个重复。弓丨物I和2是检测转pCOUOsSPXl的水稻株系中OsAPXl基因的表达量，靶序列为OsSPXl基因编码区的特征片段；引物3和4是检测转0sSPXl_antisense的水稻株系其内源OsSPXl基因表达的被抑制程度，为排除干扰，靶序列为OsSPXl基因3’ URT上的特征片段。结果如图3中的A和图3中的B所示转pCOU OsSPXl的水稻株系(Ox-Iinel和0x-line2)中OsSPXl基因的表达量较非转基因日本晴有明显提高，而转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻株系(Anti-Iinel和Anti_line2)中OsSPXl基因的表达量明显低于非转基因日本晴。实施例5、转基因水稻株系的种子结实率统计按照实施例3中步骤5的PCR鉴定呈阳性的T1代转pCOU OsSPXl的水稻植株和T1代转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻植株与非转基因日本晴正常种植于大田中，观察其生长状况和种子结实的情况。与非转基因日本晴相比，转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻株系抽穗晚、灌浆迟、成熟缓慢，而转pCOU OsSPXl的水稻株系的生长态势较好或相近，如图3所示。同时，观察T1代转pCOU OsSPXl的水稻植株和转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻植株与非转基因日本晴的穗粒情况结果如图5和图6，T1代转pCOU OsSPXl_antisense的水稻株系(Anti-Iinel和Anti-line2)的穗小、穗粒少、瘪粒多，而T1代转pCOU OsSPXl的水稻株系(Ox-Iinel和0x_line2)和背景材料非转基因日本晴的水稻株系则穗大、穗粒多、
饱满度高。分别统计T1代转pCOU OsSPXl的水稻株系和T1代转pCOU OsSPXl_antisense的水稻株系与非转基因日本晴的不同株系(每一株系内随机取10-15个单株)上所结种子平均的总粒数、实粒数、结实率(结实率=实粒数/总粒数)和千粒重，结果如表2和图7所示。与非转基因日本晴相比，转pCOU 0sSPXl_antisense的水稻株系的种子实粒数、结实率明显降低，表明OsSPXl基因在调控水稻种子的结实率方面具有重要作用。表21\代转基因水稻株系的种子产量性状调查结果(平均值土标准差)
权利要求
1.序列表序列3所示蛋白在调控目的植物种子结实率中的应用。
2.一种培育低结实率或低种子产量转基因植物的方法，是降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的编码基因的表达，得到种子结实率和实粒数中至少一种性状低于所述目的植物的转基因植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的编码基因的表达是通过将序列表序列3所示蛋白编码基因的互补序列导入目的植物中实现的。
4.一种培育高结实率或高种子产量转基因植物的方法，是将序列表序列3所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到种子结实率和实粒数中至少一种高于所述目的植物的转基因植物。
5.根据权利要求I所述的应用或权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述序列表序列3所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)的基因 1)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子； 2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列3所示蛋白的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列3所示蛋白的DNA分子。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述单子叶植物为水稻。
8.—种DNA分子，其核苷酸序列为权利要求5中的所述序列表序列3所示蛋白的编码基因的互补序列。
9.含有权利要求8所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒；所述含有所述DNA分子的重组载体具体可为pCOU OsSPXl_antisense，所述pCOUOsSPXl_antisense是将核苷酸序列如下的DNA片段经限制性内切酶BglII和KpnI双酶切后插入pCambial301-UbiN多克隆位点的BglII和KpnI酶切位点之间得到的重组载体由5’至3’端依次为限制性内切酶BglII识别序列、序列表序列2所示核苷酸序列互补序列和限制性内切酶KpnI识别序列。
10.用于鉴定序列表序列3所示蛋白编码基因表达的PCR引物对，其特征在于所述PCR引物对由序列表序列4所示的单链DNA和序列表序列5所示的单链DNA组成；或由序列表序列6所示的单链DNA和序列表序列7所示的单链DNA组成。
全文摘要
本发明公开了一种水稻OsSPX1蛋白及其编码基因在调控植物种子结实率中的应用。该蛋白质的氨基酸序列如序列表序列3所示，可用于调控目的植物的种子结实率，或调节序列表序列3所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物的种子结实率。实验证明，转pCOU OsSPX1_antisense的水稻株系与非转基因日本晴相比，其水稻OsSPX1基因的相对表达量明显降低，同时种子结实率和实粒数也显著降低。本发明在研究植物种子产量性状形成方面具有重要应用价值。
文档编号A01H5/00GK102628059SQ20121010177
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者于静娟, 刘凤霞, 张群莲, 徐文英, 王春超, 王玲, 苏震, 赵琳娜, 魏强 申请人:中国农业大学