专利名称：具有益生作用的枯草芽孢杆菌b27及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27及其应用。
背景技术：
抗生素自20世纪50年代以来广泛应用于畜禽养殖业，在促进动物生长，保证动物健康，节约饲料成本，提高经济效益等方面做出了巨大贡献。由于抗生素在动物养殖业中的长期使用，近些年来，由其所致的毒副作用和药物残留问题已引起人们的关注。2006年，欧盟已经全面禁止了饲料中抗生素的使用，美国和日本等国家也对其做出了严格的限制。2011年，韩国全国禁止在动物饲料中添加抗生素。随着人们对畜产品安全和环境保护意识的不断加强，益生菌作为抗生素的替代品倍受关注，越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。由于芽孢杆菌对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。因此，获得新型具有益生特性的芽孢杆菌的研究具有重大意义。分离和筛选抗病原菌且具有益生效果的枯草芽孢杆菌，可以更好的应用于饲料添加剂，以代替抗生素。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27及其应用。为了实现本发明 的目的，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27，是从北京市大兴养猪场附近土壤中筛选到的一株芽孢杆菌。经16S rRNA基因序列分析和体外益生效果评价，该菌株为能够抑制病原菌且具有益生效果的枯草芽孢杆菌，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCCNO. 6538，保藏日期2012年9月7日。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27的微生物学特性为革兰氏阳性菌，无荚膜。菌体表明粗糙，在液体培养基中生长时形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉。本发明还提供含有该具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的菌剂。本发明还提供所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27或上述菌剂在广谱抗菌中的应用。其中，具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的抑菌谱包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，如Staphylococcus aureus IVDC C56005 (中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)；所述革兰氏阴性菌为致病性大肠杆菌，如K88(Escherichia coli IVDC C83901),鼠伤寒沙门氏菌，如Salmonella typhimurium IVDCC79-13 (中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。本发明还提供所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27在制备动物饲料添加剂中的应用。本发明还提供一种含有该具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的动物饲料添加剂。本发明还提供一种含有该具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的动物饲料。其中，所述动物饲料中枯草芽孢杆菌B27的活菌数为1.0X108 3.0X108CFU/g基础日粮，优选
2.0X108CFU/g 基础日粮。本发明通过体外法鉴定了枯草芽孢杆菌B27的益生效果，结果表明，枯草芽孢杆菌B27能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。本发明还提供了一种体外法鉴定菌株耐酸、耐胆盐和模拟胃肠道环境中生长的益生潜力，包括以下步骤 I)配制不同pH值的培养基，检测枯草芽孢杆菌B27的生长情况；2)配制不同胆盐浓度的培养基，检测枯草芽孢杆菌B27的生长情况；3)模拟人工胃肠液，检测枯草芽孢杆菌B27的生长情况。本发明进一步验证了枯草芽孢杆菌B27在断奶仔猪饲料添加中的应用效果。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27，最适pH 7. 2 7. 4，最适温度37°C，能够耐受体内环境，具有良好的益生效果。它是一株能够抑制肠道内病原菌的益生菌，它能够耐酸耐盐耐人工胃肠液的环境，表明其具备益生菌的潜质。通过在断奶仔猪饲料添加中应用效果的研究，表明枯草芽孢杆菌B27可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中。
图1为本发明实施例2中枯草芽孢杆菌B27抑制病原菌的生长情况；其中，A为对照组，B为试验组。图2为本发明实施例4中枯草芽孢杆菌B27在不同pH值下的生长情况。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中涉及的试验材料和试剂1、菌株病原菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus IVDC C56005)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大肠杆菌K88(Escherichia coli IVDCC83901)由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供。2、生化试剂DNA提取试剂盒购自天根公司，胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自Sigma公司，其它均为国产试剂。3、培养基(I)肉汤培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水lOOOmL，pH值
7.2 7. 4，121。。灭菌 20min。(2)肉汤固体培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水lOOOmL，琼脂20g, pH 值 7. 2 7. 4，121°C灭菌 20min。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中描述的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1枯草芽孢杆菌的分离采集北京市大兴养猪场附近的土壤，按1:10倍比稀释于生理盐水中。取IOOiiL稀释液涂布于营养肉汤固体培养基上，37°C培养24h。挑起菌落表面形成皱醭的单菌落在营养肉汤固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法分离到36株菌种，分别命名为B1-B36。实施例2抗病原菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27的筛选应用琼脂扩散的牛津杯法筛选具有抑菌活力的枯草芽孢杆菌。向肉汤培养基中加入琼脂后，溶解均匀，高压灭菌，冷却到50°C左右，每20mL培养基加入20 y L新鲜培养的指示菌(108CFU/mL)，混匀倒入培养皿冷却。用灭菌的镊子将无菌的牛津杯轻轻的放入培养皿中，在牛津杯中分别加入B1-B36各80 ii L单株菌液，向另一个牛津杯中加入80 ii L无菌营养肉汤培养基作对照，37°C培养24h。筛选出能形成抑菌圈的菌液(图1)，其菌株编号为B27。以上使用的指示菌分别为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus IVDCC56005)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大肠杆菌 K88(Escherichia coli IVDC C83901)。实施例3枯草芽孢杆菌B27的菌种鉴定取IOmL GF103培养液，低`速离心获得菌体。用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN, DP302)提取细菌总 DNA。以IOng纯化的细菌总DNA作为模板，扩增16S rRNA基因。所用引物为原核生物16S rRNA基因的通用引物27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '和1492R:5/ -TACCTTGTTACGACTT-3/。引物由北京博迈德生物有限公司合成。PCR 扩增体系为 50ii L，包括 0. L Taq 酶(0. 5U/mL)、5. 0 ii L10XPCR 反应缓冲液、4. Oii L dNTP Mixture、L Oii L模板DNA、1. Oii L正向引物27F(25iimol/L)、1. Oii L反向引物 1492R(25iimol/L)和 37. 5 u L ddH20。扩增条件95°C5min ；94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，30 个循环；72°C 7min,
4V终止反应。PCR产物序列测定由北京博迈德生物有限公司完成。枯草芽孢杆菌B27经16S rRNA基因测序，提交到GenBank，获得序列登录号为JQ673431 o 测得序列经 Blast 比对，结果该菌株与 GenBank 中 Bacillus subtilis strainA2 16S ribosomal RNA gene (GenBank accession number:EU567068)序列相似性为 99%。初步确定B27为枯草芽孢杆菌。其微生物学特性为革兰氏阳性菌，无荚膜。菌体表明粗糙，在液体培养基中生长时形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉。实施例4枯草芽孢杆菌B27耐酸耐胆盐特性测定测定枯草芽孢杆菌B27在低pH中的生长状态，用lmol/L盐酸调节营养肉汤培养基为不同PH值梯度，分别为2. O、3. O、4. O、5. O、6. 0和6. 4。枯草芽孢杆菌B27培养液按1%(v/v)分别接种于不同pH值营养肉汤培养基中，37°C培养24h，测OD6tltol值。试验结果如图2所示，枯草芽孢杆菌B27在pH=2. 0的培养基中存活率为34%，在pH=3的培养基中存活率为72%，说明枯草芽孢杆菌B27在低酸的环境能够保持一定的活菌数。在营养肉汤培养基中加入猪胆盐，使其浓度分别为0%(对照)、0. 15%、0. 3%和0. 6%。枯草芽孢杆菌B27接种于上述不同浓度的营养肉汤培养基中，37°C培养24h，通过平板计数法计算活菌数。结果见表1，枯草芽孢杆菌能够耐受0.3%胆盐浓度。由于动物体内胆盐浓度在0. 3%左右，所以枯草芽孢杆菌B27能够体内的胆盐环境。表I枯草芽孢杆菌B27在不同浓度胆盐中培养24h的活菌数
权利要求
1.具有益生作用的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B27，其保藏号为CGMCCNO. 6538。
2.含有权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的菌剂。
3.权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27或权利要求2所述菌剂在广谱抗菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的抑菌谱包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌； 所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌为致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌。
5.权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27在制备动物饲料添加剂中的应用。
6.一种含有权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的动物饲料添加剂。
7.一种含有权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的动物饲料。
8.根据权利要求7所述的动物饲料，其特征在于，动物饲料中枯草芽孢杆菌B27的活菌数为1.0\108 3.0父10*^^/^基础日粮。
9.根据权利要求8所述的动物饲料，其特征在于，动物饲料中枯草芽孢杆菌B27的活菌数为2.0X108CFU/g基础日粮。
全文摘要
本发明提供了保藏编号为CGMCC No.6538的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27及其应用。本发明的枯草芽孢杆菌B27，最适pH7.2~7.4，最适温度37℃，能够耐受体内环境，具有良好的益生效果，作为一种新型的益生菌添加剂，可广泛应用于饲料中。
文档编号A23K1/16GK103060222SQ20121035104
公开日2013年4月24日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者刁其玉, 张乃锋, 屠焰, 董晓丽, 周盟 申请人:中国农业科学院饲料研究所