一种Bt cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种Bt?cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用,所述cry71Aa1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或为SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述cry71Aa1基因编码的Bt蛋白Cry71Aa1可以用于制备Bt杀虫剂，cry71Aa1基因可以转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
【专利说明】—种Bt cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种Bt cry71Aal基因及其编码蛋白和应用。【背景技术】
[0002]在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。
[0003]苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌,它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins,简称ICPs), ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。
[0004]自1981年Schn印f从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了 630多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N, et al.Microbiol Mol BiolRev, 1998, 62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。现在已经分离克隆了 72个类群的杀虫蛋白。一般而言，Cryl，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kDa，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.1sraelensis,简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(McGaughey，1985.Science.229:193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年,McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在Dipel (Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下,繁殖15代后,抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik B.E., et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.91:4120-4124),上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.昆虫学报，39(3):238-244;Hofte H.，1988.Appl.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf, E., et al.1998.Mol.Biol.Rev.65(3):77 5-806)。另外，有研究证明 Bti 在大田的使用中尚未发现抗性问题，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou G P, 1997.Applied and EnvironmentalMicrobiology, 63:1095-1101.)。
[0005]为避免抗性昆虫所造成的损失，许多针对于这个问题的方法被提出来，例如加大使用剂量和多基因协同使用，但是能从根本上解决这一问题的还是寻找新的、高毒力、宽杀虫谱的Bt基因资源，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种Bt cry71Aal基因及其编码蛋白和应用。
[0007]为了实现本发明的目的，本发明通过对苏云金芽孢杆菌菌株HS18-1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCjia:北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为 CGMCC N0.2718，已在专利号为 ZL200910081594.2 的发明专利申请中公开。通过对本菌株HS18-1的毒力测试表明，菌株HS18-1对鳞翅目害虫，双翅目害虫等均具有极高的毒力。通过对本菌株的基因组和质粒测序进行研究，发现该菌株存在一个新的cry基因，设计其全长基因引物，克隆得到cry71Aal基因的完整基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，全长为2151bp。分析表明，cry71Aal基因GC含量为35.15%。编码716个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。在softberry网站采用bacterial sigma7.0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为cry71Aal。Cry71Aal蛋白的氨基酸组成如表1所示。
[0008]表1 cry71Aal蛋白的氨基酸组成
[0009]
【权利要求】
1.一种Bt Cry71Aal基因，其特征在于，所述Cry71Aal基因具有(I)或(2)所示的核苷酸序列: (1)SEQID N0.1所示的核苷酸序列； (2)SEQID N0.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.权利要求1所述基因编码的Bt蛋白Cry71Aal。
3.含有权利要求1所述Cry71Aal基因的载体。
4.含有权利要求1所述Cry7IAal基因的工程菌。
5.一种用于扩增Cry71Aal基因的引物，其特征在于，所述引物序列为: 引物 PS71-F:5，-GCC GGATCC A ATGAATTCATATCAAAGTGAA-3’ 引物 pS71-R:5’ -GGG GTCGACCTACTTTGTTTTAAATAAACT-3，。
6.权利要求1所述的Cry71Aal基因在提高植物抗虫性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为将Cry71Aal基因与表达载体连接，得到能够表达Bt蛋白Cry71Aal的重组表达载体，再通过转基因方法将所述重组表达载体导入植物，得到含有Cry71Aal基因的转化体，表达Bt蛋白Cry71Aal，提高植物抗虫性。
8.权利要求1所述基因在培育转基因植物中的应用。
9.含有权利要求2所述Bt蛋白Cry71Aal的杀虫剂。
10.权利要求2所述Bt蛋白Cry71Aal在提高植物抗虫性中的应用。
【文档编号】A01P7/04GK103525835SQ201310428864
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】郑爱萍, 李平, 李巧, 朱军, 邓其明, 王世全, 李双成 申请人:四川农业大学