两种编码杀虫蛋白质基因和双价融合表达载体及其应用的制作方法

专利名称：两种编码杀虫蛋白质基因和双价融合表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质及编码豇豆胰蛋白酶抑制剂两种杀虫蛋白质的DNA序列，包含所说DNA序列的双价融合植物表达载体，被所说的表达载体转化的植物细胞，以及由所说的细胞产生的对昆虫(特别是鳞翅目昆虫)表现有高抗性且昆虫难以对之产生耐受性的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。
利用生物技术手段可以获得对特定害虫有毒杀作用的转基因植物。其中，较为熟知的例子是应用苏云金芽孢杆菌(Bacillusthurigiensis)的伴胞杀虫晶体蛋白基因。已知属于革兰氏阳性土壤芽孢杆菌的苏云金芽孢杆菌，可以产生对多种昆虫，如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的伴胞晶体蛋白质(Aronson,Microbiol.Rev.50:1-14,1968)。这种杀虫蛋白质包括许多亚类的分别对不同害虫有专一性和高度选择性毒杀作用的蛋白质(Klausner,Bio/Technology 2:408-419)。而且这种生物分子杀虫剂对植物和包括人在内的动物没有毒害，且不会污染环境。
基于苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的性质，多年前就已经生产了有关在商业上出售的含有苏云金芽孢杆菌产生的孢子及结晶蛋白质的商品杀虫制剂(商品名为DIPEL和THURICIDE)。这种商品杀昆虫剂可有效地对抗五十种以上的鳞翅目害虫(Wilcox,et al.,ProteinEngineering,Inouye and Sarma(Eds.)Academic Press,NY,1968)。然而，使用苏云金芽孢杆菌杀虫制剂的一个重要限制是由于所说的结晶蛋白质或δ-内毒素在环境中被降解，而需要重复生产和重复应用这种杀虫制剂，大大增加了成本，从而为农业生产上的实际应用带来困难。
为解决这个问题，科学家们开始了一系列关于可以表达苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的抗虫转基因植物的研究(Umbeck等人，Bio/Technology,5:262-266,1987；Vaeck等人，Nature 328:33-37,1987；schhoff等人，Bio/Technology 5:807-813,1987；Barton等人，PCT89004868；郭三堆等人，CN95119563.8)。
其中，Willbur等人(Plant Physiol.92:1-11,1990)的研究表明，低等生物体细菌和高等生物体植物在密码子的使用上存在很大差异。例如密码子XXC/G(其中两个X各自选自A、G、C和T)在植物中的使用率为45-73.5％，而在苏云金芽孢杆菌库斯塔克HD-1变种(B.t.kurstaki HD-1)(CryⅠA(b))的杀虫基因中仅为24％。另外，有证据表明，植物中的tRNA很难提供细菌基因在植物细胞中的充分翻译。而且，在苏云金芽孢杆菌杀虫结构基因中存在不利于在植物中转录出完整mRNA的不稳定的ATTTA和AATAA等序列，转录出的mRNA因不完整，故翻译出的蛋白质无杀虫活性。
Perlak等人(Bio/Technology 8:939-942,1990)按照双子叶植物优化密码子，以化学合成方法合成衍生于苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质(kurstaki HD-1,CryⅠA(b))和HD-73,CryⅠA(c))的合成基因。其中所说的合成基因中，3’端的1/2序列被缺失，且改变了部分保守序列的密码子。所得到的基因序列包含相当于编码615氨基酸序列的1845bp。将该序列连接到带有2个增强子的花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子的下游，借助植物农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化到双子叶植物棉花细胞中，并再生出抗虫棉花植株。其中杀虫蛋白质表达量(约占叶子中可溶性蛋白质的0.05％-0.1％)约为编码天然苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因的表达量的50-100倍。然而，由于其所构建的重组表达载体表达外源基因的能力并不理想，因而抗虫率仅为72-76％，观察到的棉花植株在生长的中后期抗棉铃虫能力也不甚理想。
郭三堆等人(CN95119563.8,1995)按照植物优化密码子，采用分段全人工合成的方法，获得了一个可在植物中高效表达的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因。并进一步构建了高效双向植物表达载体，转入棉花，获得了抗虫性稳定、抗虫率为80％以上的抗虫转基因棉花。
此外，还有一类可用于抗虫转基因植物研究的生物分子是蛋白酶抑制剂(Proteinase inhibitor)。自然界中存在的蛋白酶抑制剂有四大类丝氨酸蛋白酶抑制剂，巯基蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶制剂。在植物中还没有发现天冬氨酰蛋白酶抑制剂，它和金属蛋白酶抑制剂都基本上没有抗虫性，而在抗虫植物基因工程领域中，丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基蛋白酶抑制剂被证明是很有研究和应用价值。其中，一个较为常见的例子是属于丝氨酸蛋白酶抑制剂的豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpwa typsininhibior,CpTⅠ)。1987年，Hilder等首先报导了将CpTⅠ基因导入烟草获得了高效表达CpTⅠ的抗虫植株。用烟草夜蛾做杀虫实验，结果对烟草夜蛾抗性显著(Hilder,V.A.etc.Nature330,160-163,1987)。
作为生物杀虫剂，单一苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的杀虫活性较为专一，而且靶昆虫较易对之产生抗性(McGaughey W.H.,Science.229:193-195,1985)。而蛋白酶抑制剂则杀虫谱宽，而且害虫很难直接产生抗性。但其杀虫能力不如苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质。因而，为获得昆虫较难以对之产生抗性的，具有较强杀虫能力的转基因植物，本发明尝试了使苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质及豇豆胰蛋白酶抑制剂两种杀虫基因在植物细胞内同时表达。这将在提高转基因植物抗虫能力的同时使昆虫对转基因植物产生耐受性的可能大大降低。
本发明涉及苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因，特别是针对鳞翅目害虫有毒性作用的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因。根据本发明的一个方面，本发明提供的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因是编码B.t.kurstaki HD-1和HD-73杀虫蛋白质的DNA序列。
在本发明一个特别优选实施方案中，该核苷酸序列中所有编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质中各氨基酸的密码子都是适于植物细胞表达的优化密码子及其组合。根据本发明的一个更为具体的优选实施方案，本发明的被修饰的合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因序列中，以XXC和XXG(其中X各自代表A、G、C、T)为代表的密码子的联合使用率大于53.5％，并且其G+C含量在48.1％以上。
根据本发明的一个实施方案，所采用的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因是中国专利95119563.8中所描述的，采用植物优化密码子，分段人工合成而获得的。根据本发明的一个实施方案，该基因具有SEQ ID NO:2中所示的核苷酸64-1824或1-1824号核苷酸。
本发明的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的DNA序列基本是基于上述密码子优化原则和提供相应酶切位点的需要，按照已知的DNA序列合成方法，使用适当的DNA合成装置合成的，但本领域技术人员可以理解到，为本发明的目的，也可以基于天然苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因的野生序列，以核苷酸定点诱变技术PCR酶促合成等技术制得本发明中所涉及的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的DNA序列或其功能等同序列。
本发明还涉及豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTⅠ基因)。特别是为达到本发明的目的而经过修饰的该基因。
根据本发明的一个优选实施办法，本发明所提供的CpTⅠ基因是通过PCR的方法获得的。根据本发明的一个实施步骤，该基因与天然CpTⅠ基因的一个显著区别是基因内部不含有EcoRⅠ位点。
业已知道，天然CpTⅠ基因的5’端有一段约50个碱基对左右的非翻译区序列，该序列片段的缺失不会影响具有天然活性的酶抑制剂分子的生物合成。因而，根据本发明的一个优选实施办法，本发明所提供的CpTⅠ基因不含有所说的非翻译区序列。
根据本发明的一个优选实施办法，本发明所提供的CpTⅠ基因的5’及3’端带有合适的限制性酶切位点。其中，基因5’端带有PstⅠ位点，3’端带有SacⅠ位点。
根据本发明的一个实施方案，所采用的CpTⅠ基因具有SEQ IDNO:4中所示的核苷酸11-271或53-271号核苷酸的编码序列。其编码的蛋白质属于T/T型双头胰蛋白酶抑制剂。即每个蛋白酶抑制剂分子含有两个胰蛋白酶的抑制活性中心。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及为在受体植物中有效地表达上面所述两种杀虫蛋白质所需之调节及控制元件。
为了使外源杀虫基因产物在植物细胞中在转录和翻译水平上获得有效表达，在包含编码区的外源DNA序列侧翼必须连接有适当的表达调节和控制元件。这些控制元件包括启动子、增强子、终止子，转录产物的未翻译部分和多聚腺苷酸化序列、以及便于在适当的培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。常用的植物细胞转录启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的355启动子和根瘤农杆菌T-DNA的胭脂氨酸合酶启动子。这些启动子在大多数植物细胞中都是有效的，但其插入位点和插入的拷贝数目不同，将对其下游的蛋白质编码序列的转录和翻译活性产生很大影响。
因而，本发明涉及增强在DNA指导下经转录过程产生的mRNA在植物细胞中的翻译能力的病毒衍生的翻译增强序列、使mRNA在核糖体结合位点的翻译过程，在任何读码情况下均能正确终止的终止子密码子序列、便于对植物细胞经转录过程得到的mRNA进行正确切割与加工的mRNA切割与加工序列，以及直接加到mRNA3’端上的加速mRNA稳定化的多聚腺苷酸化序列及促使加入这一多聚腺苷酸化序列的多聚腺苷酸化信号序列。
根据本发明的一个优选实施方案，在本发明的双价融合植物表达载体中，所说的5’端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个外源基因在植物细胞内翻译过程中起促进作用的短核苷酸序列组成。
在本发明的融合基因表达载体中，除了上述本发明的杀虫蛋白质的DNA编码序列外，其他位于所说编码序列两侧翼(即5’和3’端边界区域)的用于调节和控制该编码序列在植物细胞中转录和翻译的序列都是本领域已知的和容易得到的。例如，本发明使用的所说的衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列是Ω序列。根据已知的Ω序列核苷酸顺序，我们合成了两段核苷酸片段SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6，通过酶促反应合成了由68bp组成的Ω序列。该序列富集TTAAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richards et al.,Eur.J.Biochem.84:513-519,1987)。其中本发明使用的促进外源基因在植物细胞内翻译过程的短核苷酸序列是如Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak et al.,Nucleic Acids Research 12:857-872,1984；Cell,44:283-292,1986)。我们所合成的Ω序列和Kozak序列如SEQ ID NO:7所示。
适于与本发明杀虫蛋白质编码序列连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开始的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性启动子。例如，它们包括但不只限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子，mannopine合成酶(MAS)启动子，胭脂氨酸合成酶和章鱼碱合成酶启动子，玉米乙醇脱氢酶启动子，以及二磷酸核酮糖羧化酶，氧化酶小亚基启动子等。其中，本发明优选的是带有加倍增强子元件的CaMV 35S启动子。该启动子全序列如SEQ ID NO:8所示。
根据本发明的一个优选实施方案，在本发明的双价融合植物表达载体中，所说的3’端非编码区包括一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列，一个类似多聚腺苷酸化信号序列及多聚腺苷酸化序列。这些调节和控制序列可以是载体质粒载体中天然固有的，或在其被转化到适当的克隆宿主中之后，在dNTP及适当的DNA合成酶和DNA连接酶的存在与作用下，利用各种已知的技术加入的。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码序列及其5’和3’端侧翼序列是以化学方法合成的。
然而，在本发明的一个优选的实施方案中，上述这些3’端调控序列，基本上都是根据我们的预先设计而人为合成的。本领域技术人员可以理解到，建立在大量理论研究工作基础上的本发明的这一实施方案，必将更有利于提高我们所制备的两种杀虫蛋白质编码序列在植物细胞中的表达效率及其稳定性和准确性。
例如，在本发明的一个特别优选的实施方案中，我们设计并合成了直接连接于前述两种杀虫蛋白质结构基因3’端的多联终止子序列(SEQ ID NO:9)，在该核苷酸的短序列中，包括有三个分别位于不同读码框中的终止密码子。从而即使在对其左翼的结构基因序列的翻译过程出现错读，也将得以正确终止。再如，本方面所设计的3’端正确切割和加工序列进一步保证了蛋白质翻译的正确终止(SEQID NO:10)。另外，在本发明的双价融合植物表达载体苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因的3’端非编码区中，我们设计并在上述多联终止密码子的3’侧连接有多聚腺苷酸化poly(A)序列(SEQ ID NO:11)。这样，将避免既使在转录后加工过程中由于未知机制不能加入该(poly(A))序列时所导致的不利于mRNA稳定翻译的问题。
另外，适用于本发明双价融合植物表达载体还可以包括衍生于花椰菜花叶病毒，Nopaline(Nos)基因及其类似物的终止子。在本发明的一个实施方案中，我们使用了Nos基因的终止子。
为了提高本发明的表达双价杀虫蛋白质的基因在单子叶禾木科植物中的表达效率，可在结构基因与启动子序列之间加入适当大小的内含子序列，例如，玉米醇脱氢酶基因的第一内含子(Gene andDevelopment 1:1183-1200,1987)、衍生于蓖麻油植物的过氧化氢酶基因的第一内含子(Tanaka et al.,NucleicAcids Research18:6767-6770,1990)等。
可使用本领域中已知的方法将本发明的适于在植物细胞中表达双价杀虫蛋白质的双价融合基因构建体连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19(Gene 103:1985)，以及经过不同的修饰而造成不同的多克隆酶切位点的一系列统称为pGEM的质粒载体(由Promega公司生产)。尤其是植物表达载体pBI101,pBI121以及pBI131系统(Jefferson,et al.,EMBOJ.16:3901,1987)，等等。在本发明的一系列优选实施方案中，携带上述本发明双价融合基因构建体的载体是pUC19、pBI121.2及pBI131，后两者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体。
当然，如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组的融合表达载体还进一步含有可选择标记和报告基因。所使用的选择标记和报告基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记和报告基因是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因，并一同包含于同一个重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。
因此，根据本发明的另一个方面，本发明进一步提供适于在植物细胞中同时表达苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质及豇豆胰蛋白酶抑制剂的双价融合植物表达载体，其中包含1)．苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因表达盒；a)．5’端非编码区；
b)．编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质氨基端的约608个氨基酸的核苷酸序列；c)．3’端非编码区。
2)．豇豆胰蛋白酶抑制剂基因表达盒；a)．5’端非编码区；b)．编码豇豆胰蛋白酶抑制剂氨基端约87个氨基酸的核苷酸序列；c)．3’端非编码区。
3)．来源于pBI121或pBI131的载体部分a)．新霉素磷酸转移酶基因(NptⅡ)表达盒；b)．β-葡萄糖苷酸酶基因(Gus)表达盒；以及c)．起始复制子及与植物转化相关的左右边界序列等功能结构。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的5’端非编码区和3’端非编码区分别具有如前所述的构成元件及其功能。
根据本发明，所说的编码区域分别具有如SEQ ID NO:2中所示的64-1824或1-1824核苷酸序列及SEQ ID NO:4中所示的11-271或53-271核苷酸序列或其功能等同序列或突变体。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码基因序列及其5’和3’端侧翼序列是以化学方法合成的。
根据布达佩斯条约的规定，申请人已于1998年7月3日将转化到大肠杆菌DH5α宿主细胞中的本发明构建的融合表达载体(以pBI121为载体)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0355。
棉花是导入双价杀虫基因，有效地产生抗虫能力的典型靶作物。棉花作为一种经济作物，我们无需考虑其作为食品的安全性问题；其次，在世界范围内被广泛种植的棉花每年因虫害造成的经济损失是十分巨大的；另外，目前已取得进展并开始尝试应用的单价抗虫棉面临着将来害虫对之产生耐受性的潜在危险。因而，根据本发明的一个方面，我们优选棉花作为双价杀虫基因转化植物的靶作物。
因而，本发明涉及编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质以及豇豆胰蛋白酶抑制剂的DNA序列，包含所说的DNA序列的双价融合植物表达载体，用所说的表达载体转化植物细胞，组织和整株植物的方法，以及由此产生的对植物害虫具有控制和毒杀能力的转基因植物，特别是对鳞翅目昆虫例如棉铃虫等具有显著毒杀作用的转基因棉花。
如前所述，为了在植物细胞中特别是整株植物中表达双价杀虫蛋白质，以赋予整株植物及其种子和后代以杀虫能力，必须使用适当的方法将按上述方法制备的携带本发明的双价杀虫蛋白质的编码序列的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。
将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不仅限于1)使用农杆菌(Agrobacterium)作为植物病原体所介导的农杆菌转化法(Agrobacterium Mediated transformation)、2)物理法，如基因枪法(Particle Bombardment & particle gun & Gene gun)、电击融合法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic waves)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoretictransfection)等。3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等。4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等。5)．以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法。
一种特别令人感兴趣的在整体植株中导入外源基因的方法是本发明人使用的所谓种质系统转化法中改进的子房注射植物受精胚囊法(参见CN95119563.8,1995；Zhou et al.,Enzymol.Method.101:433-481,1983)。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的转基因植物是转基因棉花。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了产生对害虫有毒性且害虫对这种毒性较难以产生耐受性的植物的方法，该方法包括1)．构建所说的双价融合植物表达载体；2)．用任何一种可行方法将步骤1)中得到的双价融合植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物及其后代，包括任何部分的植物组织和种子。
这里应特别指出的是，虽然在本发明下述实施例中以转基因棉花的产生举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味本发明制备的双价杀虫蛋白质基因的DNA序列及携带该DNA序列的重组融合表达载体只用于转化和生产具有抗虫能力的转基因棉花。
因此，使用具有本发明所描述的特征的双价杀虫基因表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的导入了外源双价杀虫蛋白质基因的，具有杀伤或控制植物敏感害虫之能力的植物，其后代及其种子和植物部分，均包括在本发明之内。
给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
实施例1 CpTⅠ基因的获得与修饰1.1 PCR对CpTⅠ基因的初步修饰以豇豆的CpTⅠ基因为模板，用所设计合成的引物(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)进行PCR扩增，结果得到大约300bp的DNA片段。纯化后的PCR产物经PstⅠ、SacⅠ双酶切后重新沉淀。载体pUC19经PstⅠ、SacⅠ双酶切后，电泳回收2.7kb大片段。将300bp片段和载体连接后，转化DH5α感受态细胞，通过α-互补现象的观察，得到重组子定名为pGC。经PstⅠ、SacⅠ双酶切鉴定，证实了300bp PCR产物的插入。
1.2对pGC中CpTⅠ基因的序列分析(1)变性模板的制备用小量提取质粒DNA方法(Sambrook J,et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.1989,ColdSpring Harbor Laborotory Press,New York)，制备待测pGC质粒DNA。取1.5～2μg DNA(约2～5μl)加水至总体积32μl，然后加入8μl 2M NaOH，轻轻混匀，室温变性10分钟，然后加入4μlH2O,7μl 3M NaAc(pH4.8),120μl无水乙醇，12000rpm离心8分钟，用70％乙醇洗2次所得的沉淀，真空抽干，溶于10μl水中，放冰上待用。
(2)退火向变性后的模板DNA中加入2μl退火buffer,2μl测序引物，轻轻混匀，瞬时离心后于65℃温育退火5分钟，迅速移至37℃继续温育10分钟，然后于室温放置5分钟以上。
(3)标记反应先吸2μl酶稀释buffer，然后向其中加入0.5μlT7测序酶，置于冰上，然后向退火后的模板，引物退火混合物中加入labal Mix 3μl,α-32P-dATP 1μl；稀释后的T7测序酶2μl，在管中轻轻吸打混匀，瞬时离心甩一下，室温反应5分钟。
(4)链延伸终止反应在4个离心管上分别标上A、C、G、T，并分别加入2.5μl相应的链终止液(Mix short)在37℃至少保温1分钟，从(3)中标记反应液中分别移取4.5μl反应物加入到A、C、G、T，四个管中，混匀后置37℃反应5分钟，各加入5μl终止液，于37℃保温2分钟。
(5)测序胶的制备应用Bio-rad公司的测序仪器。
量取50ml 6％测序丙烯酰胺凝胶贮备液(6％ Seqencing gel:1.5g甲叉双丙烯酰胺，28.5g丙烯酰胺，240g尿素，50ml 10×TBE，加水定容至500ml)，加入500μl 10％过硫酸胺，50μl TEMED，混匀，缓慢注入到洗净的测序板装置中，插入梳子，室温聚合45分钟以上。
(6)装置好电泳装置，加入1×TBE为电泳缓冲液(10×TBE:108gTris,9.3g Na2EDTA.2H2O,55g硼酸，用H2O定溶于1000ml(pH8.3))。将样品80℃变性2分钟，置于冰上，上样电泳。如有必要，当溴酚兰到达板底部时，进行二次上样，继续电泳到二次上样溴酚兰至板底部。
(7)停止电泳，下胶，压片，一70℃放射自显影过夜，冲片阅读。
结果证明该质粒中带有正确的CpTⅠ基因插入片段。该序列与天然CpTⅠ基因序列在5”及3’端不同，且不含有5’端约50bp的前导序列。
1.3 CpTⅠ基因中EcoRⅠ位点的去除进一步通过设计引物(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16)，突变pGC2中CpTⅠ基因中的EcoRⅠ位点。其大致过程为先经过两个PCR反应分别获得约140bp、160bp的DNA片段，然后以这两个DNA片段为模板，通过PCR获得EcoRⅠ位点被突变的约300bp CpTⅠ基因片段。如表1所示表1．CpTⅠ基因中EcoRⅠ位点的去除
反应程序为94℃ 2分钟93℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，35个循环72℃ 5分钟电泳鉴定并纯化PCR产物，获得经修饰去除了EcoRⅠ位点的CpTⅠ基因。再次用PstⅠ、SacⅠ将突变后的CpTⅠ基因克隆到质粒pUC19中。获得重组质粒pGCE。对pGCE的序列分析(所用方法同1.2)证明所克隆的CpTⅠ基因完全符合初始设计方案。其位于pUC19中PstⅠ和SacⅠ位点间的插入核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例2双价杀虫基因植物表达载体的构建2.1修饰后CpTⅠ表达盒的构建本实施例所构建的CpTⅠ表达盒中包括以下基因表达调控元件5’端的35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及kozak序列，3’端的多联终止序列、切割序列、正确加工序列以及NOS终止子。这些表达调控元件除35S启动子和增强子之外都是通过化学方法人工合成的(详见中国专利CN95119563.8,1995)。在本实验室所保存带有人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因表达盒的质粒pG4AB中包括有这些元件。
利用质粒pG4AB，经PstⅠ和SacⅠ双酶切后，回收3.5kb片段作为载体，将pGCE中的CpTⅠ基因用PstⅠ和SacⅠ切下后连接到所回收的载体上去，得到重组质粒pG4ACE。在该质粒中则带有CpTⅠ基因表达盒。载体中的起始密码子ATG与CpTⅠ基因中的起始密码子ATG没有发生移码突变，如附


图1所示。
2.2带有双价杀虫基因的双价融合表达载体的获得将pG4AB中的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因用HindⅢ切下，以平端的连接方式克隆到pG4ACE的AccⅠ位点上。片段及克隆载体均用绿豆芽核酸酶补平。获得了该杀虫基因以正、反两个方向播入的重组质粒pGS4ABC及pGD4ABC。采用不同限制性内切酶经多组酶切鉴定，证明了所构建质粒的正确。
2.3双价杀虫基因植物表达载体的构建用HindⅢ切下pGS4ABC及pGD4ABC中的4.7kb杀虫基因，克隆到植物表达载体pBⅠ121.1及pBⅠ131中的HindⅢ位点上，获得重组质粒pGBⅠ121S4ABC、pGBⅠ121D4ABC、pGBⅠ131S4ABC和pGBⅠ131D4ABC。其中以pBⅠ131为载体的携带两种杀虫基因的双价融合植物表达载体pGBⅠ131S4ABC和pGBⅠ131D4ABC的质粒图谱如附图2所示。以pBⅠ121为载体的双价融合植物表达载体结构与之差别仅在于GUS基因的启动子为35S启动子。
实施例3．双价融合植物表达载体向模式植物烟草中的导入及鉴定3.1 LBA4404感受态细胞的制备挑取LBA4404单菌落接种于5ml YEB(含链霉素100μg/ml)中，28℃，250rpm培养过夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培养基中，继续培养至OD值约为0.6。将菌液转至无菌离心管中，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，用2ml 20mM的CaCl2重悬菌体，按每管200μl分装于无菌小离心管中。
3.2重组质粒转入LBA4404细胞在200μl LBA4404感受态细胞中分别加入2ug重组质粒pGBⅠ121S4ABC、pGBⅠ121D4ABC、pGBⅠ131S4ABC和pGBⅠ131D4ABC DNA，置冰浴5分钟，然后转至液氮中冷冻8分钟，迅速于37℃水浴中温育5分钟后，加入800μl YEB培养基，28℃250rpm预表达培养4～5小时，然后涂铺含有卡那霉素的YEB固体平板，28℃培养24～48小时。则长出的农杆菌菌落带有相应的转化质粒。
3.3烟草的转化(1)农杆菌的准备28℃过夜分别培养带有植物表达载体的农杆菌50ml,5000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀，用液体MS培养液洗涤一次，再用MS重悬至OD600=0.2～0.4。
(2)浸染取烟草无菌苗叶片，用刀切成边长约0.5厘米小方块，在农杆菌悬液中浸泡5～10分钟，然后用灭菌滤纸吸干。
(3)共培养将叶块摆放在不加抗生素的共培养培养基中(上面垫二层滤纸)于25％避光共培养3天。
(4)选择培养将叶片继代到选择培养基中在光照培养箱中(光照12小时，黑暗12小时)培养至抗性芽的出现。
(5)抗性小苗的获得将愈伤移至生根培养基因，每隔二周继代培养一次，最后种植到小塑料钵中。
3.4转基因烟草的分子生物学鉴定3.4.1 PCR鉴定取1～3克烟草鲜叶片，加等量Al2O3用液氮研磨，将粉末置于50ml离心管中，加入20ml DNA提取缓冲液(100mM Tris.HCl pH8.0,500mMNaCl,10mMβ-巯基乙醇，50mM EDTA pH8.0)，剧烈振荡1分钟，加入4ml10％SDS，轻轻混匀，于65℃加热10～20分钟，至颜色翠绿，加入冰冷5M KAC 4ml，冰上放置30分钟，然后在4℃,12000rpm离心15分钟，吸上清，用0.6倍异丙醇沉淀后，用RNAase处理，纯化备用。
以转基因烟草的基因组DNA为模板，分别用双价杀虫基因的特异性引物进行如下PCR反应在0.5ml Eppendorf管中加入H2o 30.5μl10×PCR buffer5μlMgCl2(25mM) 3μl4×dNTP(各2.5mM) 5μlPrimerl(20pmol/μl) 2.5μlPrimer2(20pmol/μl) 2.5μl模板质粒pGUSO DNA(100ng/μl) 1μlTaq酶(3U/μl) 0.5μl
50μl石蜡油 50μl反应程序为94℃ 3分钟93℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 60秒，35个循环72℃ 5分钟所用苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因引物(20pmol/ul)为5’ -GGGCCCGCTGAATCCAACTGGAGAGGC-3’(SEQ ID NO:17)5’ -CCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTG-3’(SEQ ID NO:18)所用CpTⅠ引物(20pmol/ul)为5’-CTACTGCAGCATGGATTTGAACCACCTCGGAAGT-3’(SEQ ID NO:13)5’-GGGAGCTCTTACTCATCATCTTCATCCCTGGACT-3’(SEQ ID NO:14)结果发现分别有与预期大小相符的DNA扩增片段。
3.4.2 PCR产物的Southern分析进一步进行PCR的Southern分析，(1)将植物DNA的PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳并照相。
(2)将胶置于小盘中加入200ml变性液(0.5M NaOH,1.5M NaCl)振荡45分钟。
(3)弃去变性液，用蒸馏水漂洗数次，加入中和液(1M Tris,pH7.4,1.5M NaCl)200ml，振荡30分钟，然后更换新的中和液，继续中和15分钟。
(4)剪相应大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，于蒸馏水中均匀湿透后，将NC膜浸于10×SSC(20×SSC每1000ml含NaCl 175.3g，柠檬酸钠88.2g pH7.0)中，放置20分钟。
(5)使用Bio-rad公司的转膜仪转膜1小时。
(6)去掉胶块，标记好加样孔位置，用6×SSC洗膜5分钟，然后紫外照射5分钟，以固定DNA。2×SSC洗膜，室温风干。
(7)将NC膜卷入杂交瓶中，加入20ml预杂交液(6×SSC,5×Denhardt,0.5％SDS,200ug/ml鱼精DNA)，使膜均匀浸润无气泡，然后置于DNA分子杂交仪中68℃预杂交过夜。
(8)探针的标记采用Promega公司随机引物试剂盒标记。取适量待标记DNA片段，95-100℃变性2分钟迅速置于冰上，在一新的Eppendrof管中，依次加入5×labling buffer10μldCTP,dGTP,dTTP，混合物2μl变性模板 25ngBSA 2μlα-32P-dATP 5μl酶1μl加H2O至总体积 50μl轻轻混匀，室温反应60分钟。95％变性2分钟置于冰上。加入2μl0.5M EDTA。
(9)向预杂交完毕的袋中加入变性探针30～50μl，重新封好继续于68℃杂交8～10小时。
(10)取出杂交膜用2×SSC,0.5％SDS洗膜30分钟，用2×SSC,0.1％SDS洗15分钟，再用0.1×SSC,0.5％SDS于42℃洗膜30分钟～数小时，中间更换新的洗膜液。
(11)0.1×SSC洗膜2分钟，用吸水纸吸去水珠，用保鲜膜包好膜，暗室中压片。
(12)-70℃自显影3～6小时后洗片。
结果表明，两种扩增产物的PCR-Southern的结果均为阳性。
3.5转基因烟草的GUS分析取转基因烟草的叶片，切几个小块(0.5mm2)，放到1.5mlEppendorf管中并加入15ul GUS底物，于37℃处理过夜。然后用95％乙醇脱色2小时，70％乙醇继续脱色数次，每次1小时以上。观察是否出现蓝色反应。结果证明，大部分转基因植株呈现明显的GUS阳性反应。
3.6转基因烟草的胰蛋白酶抑制剂活性的测定(参照Washington(Washington Biochemical Co.,Decker,L.A.:Washington EnzymeManual,Freehold,New Jersey,1977)(1)底物溶液的配置称取189mg对-甲苯磺酰-L-精氨酸乙酯(Nα-p-TOSYL-L-ARGININE METHYL ESTER,TAME,C12H22N4O4S·HCl,FW=378.9,SIGMA公司)溶于50ml去离子水中(2)酶溶液的配置胰蛋白酶(Trypsin,1:250,2～4μ/mg,Difco公司)25mg溶于100ml 0.001N HCl(3)选取状况相似的对照和转基因烟草的叶片，用常规方法提取可溶性总蛋白，用考马斯亮蓝法定量(Braford,M.M.,1976,Anal.Biochem,72:248-254)，并稀释到相同浓度。(4)操作步骤在2.9ml Tris缓冲液反应体系中包含0.30ml底物溶液和待测样品。混合后加入到1cm的石英比色杯中，25℃保温10min后添加0.10ml的酶溶液，于247nm处测吸光度，以Tris缓冲液作对照。3min内每隔30sec读取吸光值。(5)酶活性计算以下面公式计算E247×3/(0.54×Ew)=U/mgE247-----247nm处每分钟的吸光增大值0.54-----1μmol对-甲苯磺酰-L-精氨酸/ml造成的吸光度。
Ew-------0.1ml所用酶液中含酶的重量(mg)3--------反应液的总体积通过计算发现，转基因烟草的胰蛋白酶活力比未转基因对照低。差异显著。
3.6转基因烟草的抗虫性测试取转基因烟草的组培幼苗叶片，分别置于平皿中，叶柄基部用湿润脱脂棉球包裹。每个平皿接一头1～2龄的棉铃虫进行杀虫实验，证明了转基因烟草的幼苗已具有明显的抗虫性。在未转基因烟草中棉铃虫大量取食，发育正常，生长迅速；在转基因烟草中棉铃虫少量取食后即出现拒食反应，发育受到抑制，最后死亡。
取已移栽温室的转基因烟草叶片，分别置于平皿中，叶柄基部用湿润脱脂棉球包裹。每个平皿接12头棉铃虫初孵幼虫进行杀虫实验，在所测试的62株转基因烟草中，有43.5％(27/62)具有明显的抗虫性，21.0％(13/62)具有中度抗虫性，35.5％(22/62)不抗虫。不同载体所获得的转基因烟草的杀虫能力无显著差别。结果统计见表2。继续用一龄或二龄棉铃虫幼虫进行杀虫实验，发现部分抗虫性高的烟草叶片可毒杀一龄或二龄虫。
表2所获得的转基因烟草叶片的抗虫实验结果测试材料/株数高抗性株数/％中度抗性株数/％低抗性株数/％无抗性株数/％pGBⅠ131S4ABC/33 16/48％ 2/6％ 4/12％ 11/33％pGBⅠ131D4ABC/29 11/38％ 5/17％ 2/7％11/38％注“高抗性”抗虫性显著，虫少量取食后全部死亡，叶片受损轻微；“中度抗性”中度抗虫性，虫少量取食后全部死亡或生长发育明显受到抑制，叶片受损较重；“低抗性”较弱抗虫性，虫取食较多，但其生长发育受到抑制，叶片受损严重。
“无抗性”基本不抗虫，虫正常取食，生长发育正常，叶片受损异常严重。
实施例4制备转化用双价融合植物表达载体pGBⅠ121S4ABC4.1大量提取质粒pGBⅠ121S4ABC(1)接单菌落于20ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃，250rpm条件下振荡培养过夜。
(2)将菌液转入4000ml液体LB培养基中，继续培养8-12小时；(3)用5000rpm离心5分钟，收集菌体；(4)用STE 100ml悬浮洗涤菌体，合并各管于2个500ml离心管中，重新离心去上清；(5)分别向每管加入80ml SolutionⅠ(50mM蔗糖，10mM EDTA,25mM Tris-HCl pH8.0)，将菌体悬浮后加入160ml新配制的SolutionⅡ(0.2M NaOH,1％SDS)，轻轻混匀数次，冰上放置10分钟，再加入120ml预冷的SolutionⅢ(每100ml含5M KAC60ml，冰乙酸11.5ml，蒸馏水28.5ml)，轻轻混匀，冰上放置30分钟；(6)8000rpm离心15分钟，收集上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟；(7)8000rpm离心15分钟，70％乙醇洗涤一次，溶于4mlTE(10mM Tris,1mM EDTA pH8.0)中，加RNAase 8μl(10mg/ml)37℃处理1小时；(8)用酚、氯仿抽提纯化一下，乙醇沉淀后溶于3mlTE中。
4.2超速离心进一步纯化所提取质粒DNA(用Beckman公司超速离心机)(1)在一个50ml离心管中加入2.9mlDNA溶液，6.6ml饱和氯化铯溶液，1ml溴化乙锭溶液(EB,10mg/ml)，混匀待用。
(2)上步中如有许多沉淀，则8000rpm离心5分钟。
(3)将上述混合液转入两个5.2ml超速离心管中，用Beckman超速离心机专用设备热封管口。
(4)用vTi80转头室温真空离心20小时，6,5000rpm。
(5)在暗室中紫外光下，先在离心管上部用针头穿孔，然后用5ml一次性注射器吸出质粒亮带。
(6)用水饱和正丁醇抽提数次去EB。
(7)用TE稀释三倍后用二倍无水乙醇4℃沉淀，离心，溶解后稀释待用。
实施例5植物受精胚囊注射法转化棉花编码杀虫蛋白质的双价基因在植物中的高效表达对于产生转基因植物是最为关键的，但是外源基因转化植物是否能获得成功，也是致关重要的环节。在本发明之前，本领域科技人员熟知的利用农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法等方法转化植物虽然有许多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不仅受到实验室条件和昂贵的仪器及费用极高等的限制，更重要的是上述方法都有一个不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生产上发挥着重要作用的优良植物品种，由于基因型的不同，不能通过愈伤途径再生成植株；或再生植株极为困难。在这样的情况下，本申请的发明人通过植物受精胚囊注射转化的技术或称植物受精胚囊注射转化法(CN95119563.8)，成功地获得了具有高抗虫能力的抗虫转基因棉花。虽然本发明优选棉花作为子房注射外源基因转化植物受精胚囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因转化植物受精胚囊技术的优点在于1)．适合于所有植物的基因型；2)．方法简单，有效；3)．不受实验室条件、仪器的限制，且费用低；4)．速度快，一年内即可获得转基因植物种子及后代。
在本实例中，子房注射外源基因转化植物受精胚囊的方法，是在棉花开花授粉后的大约10-24小时之间。如在珠心孔道封闭之前，用微量注射系统将外源基因溶液注射到子房内，外要材料即可通过珠孔和珠心孔道，逐渐扩散到或在珠心孔道封闭的过程中被挤压到刚受精后的胚囊内。在受精卵分裂的过程中，外源基因被吸收整合到受精卵细胞的基因组中，从而完成外源基因导入和整合过程。
棉花是常异花授粉作物，为保持品种(系)的相对纯度，在开花的前一天下午，将要在第二天开花的蕾用线扣紧，使花辨不易张开，以使其自花授粉。开花后约10小时左右，即当天开花的晚6点钟左右花粉管进入胚囊后，即可进行外源基因的注射。注射前将花辨连同雄蕊剥去露出幼铃，抹去幼铃顶端的花柱，我们设计的微量注射系统吸取预冷的外源基因溶液，从抹掉幼铃的顶端，沿中轴垂直插入幼铃大小的2/3处(如图所示)，再将微量注射器向上提到1/3的地方，留下约幼铃1/3的插入空间，缓慢将注射装置内的外源溶液注射到插入空间内。此后，外源DNA溶液将沿着珠孔和珠心孔道向受精胚囊内扩散，或由于珠心孔道在逐渐封闭而被挤压进受精胚囊中而实现其整合。一般注射的外源基因溶液为10μl，总量约为0.25-0.5μg。当然，对于不同的作物可根据其子房内胚珠数目的多少，适当地增加或减少外源基因的注射量。外源基因注射后，为了防止和减少幼铃的脱落，提高成铃率，在幼铃柄基部用毛笔涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夹在幼铃柄基部和茎(枝)之间，同时将所说注射外源基因的幼铃所在的枝条项端摘掉，以保持幼铃的充分营养，从而将有利于成铃和铃内种子的发育。
实施例6双价抗虫棉的分子生物学检测应用实施例3.4的方法，分别对转基因棉及其后代进行了PCR及PCR-Southern分析，证实了双价融合植物表达载体已转入到了棉花基因组中。
实施例7双价抗虫棉的生物学杀虫试验用生物抗虫方法进行抗虫鉴定试验，是最灵敏有效的方法。采摘筛选到的双价抗虫棉R1代、R2代及R3代(当代种子为R0代，种子发芽生长出的植株为R1代)植株顶部或枝顶展开的嫩叶二张，分别放在两个培养皿中，每个培养皿放12头三日龄幼虫，置28℃恒温室内，于接虫后72小时计算死虫数，活虫数，并观察叶片受损程度，重复三次。计算死亡率或校正死亡率的公式如下
同时也进行了大量的田间杀虫试验。结果证明，转基因抗虫棉与对照未转基因棉相比，具有高抗虫性，且这种抗性可以稳定的遗传给后代。纯合后的抗虫棉品系可保持80％以上的抗虫性。其抗虫能力与单价抗虫棉(CN95119563.8,1995)未有明显提高，但其在抗虫范围及有效减缓或防止害虫对转基因棉产生抗性方面优于前者。
总之，本发明制备的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的合成基因及修饰后的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，都具有与植物相适应的碱基序列。与高效表达调控元件序列重组，构建成的双价基因高效融合植物表达载体，无论是通过农杆菌介导法导入烟草，还是通过子房注射转化受精胚囊方法转化棉花，都证明该双价融合植物表达载体可在植物中高效表达，并能将杀虫基因遗传给后代和种子，使之具有高抗虫性。从而，本发明提供了一种获得具有高抗虫性，且害虫难以对之产生耐受性的双价抗虫转基因植物的方法。
附图的简要说明图一说明构建CpTⅠ基因表达盒时，该基因位于正确的阅读框架中。因而无论翻译发生于第一、第二阅读框架，均产生有活性豇豆胰蛋白酶抑制剂。图中，pGCE为带有CpTⅠ基因的中间质粒载体，pG4ACE及pG4AB分别为携带CpTⅠ基因和人工合成B.t.杀虫蛋白基因的带有表达调控元件的中间质粒载体。图二说明了本发明以pBⅠ131为载体构建的双价融合植物表达载体的质粒结构图序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称中国农业科学院生物技术研究中心(B)地址北京海淀区白石桥路30号(C)国家中国(D)邮编100081(F)电话(010)62184096(G)传真(010)62184096(ⅱ)发明名称两种编码杀虫蛋白质基因和双价融合植物表达载体及其应用(ⅲ)序列数18(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度608氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅲ)其它信息B.t.Kurstaki HD-1/HD-73融合杀虫蛋白(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:1Met Asp Cys Arg Pro Tyr Asn Cys Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu110 20Arg Ile Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu21 30 40Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile Trp Gly Ile41 50 60Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg61 70 80Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr81 90 100Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg101 110 120Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile Pro Leu121 130 140Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu141 150 160Asn Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala161 170 180Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp Leu Tyr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala181 190 200Val Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp Trp Ile201 210 220Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe221 230 240Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile241 250 260Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile261 270 280Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr281 290 300Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly301 310 320Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln321 330 340Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr341 350 360Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu361 370 380Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val381 390 400Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser401 410 420His Arg Leu Ser His Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile421 430 440Ile Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile Ala441 450 460Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val461 470 480Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Gly Asn481 490 500Ile Gln Asn Arg Arg Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr501 510 520Arg Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn Trp Gly Asn521 530 540Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser541 550 560Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val561 570 580Gly Val Arg Asn Phe Ser Gly Thr Thr Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro581 590 600Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu601 608(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(E)长度1824碱基对(F)类型核苷酸(G)链型双链(H)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:2ATGGACTGCA GGCCATACAA CTGCTTGAGT AACCCAGAAG TTGAAGTACT TGGTGGAGAA 60CGCATTGAAA CCGGTTACAC TCCCATCGAC ATCTCCTTGT CCTTGACACA GTTTCTGCTC 120AGCGAGTTCG TGCCAGGTGC TGGGTTCGTT CTCGGACTAG TTGACATCAT CTGGGGTATC 180TTTGGTCCAT CTCAATGGGA TGCATTCCTG GTGCAAATTG AGCAGTTGAT CAACCAGAGG 240ATCGAAGAGT TCGCCAGGAA CCAGGCCATC TCTAGGTTGG AAGGATTGAG CAATCTCTAC 300CAAATCTATG CAGAGAGCTT CAGAGAGTGG GAAGCCGATC CTACTAACCC AGCTCTCCGC 360GAGGAAATGC GTATTCAATT CAACGACATG AACAGCGCCT TGACCACAGC TATCCCATTG 420TTCGCAGTCC AGAACTACCA AGTTCCTCTC TTGTCCGTGT ACGTTCAAGC AGCTAATCTT 480CACCTCAGCG TGCTTCGAGA CGTTAGCGTG TTTGGGCAAA GGTGGGGATT CGATGCTGCA 540ACCATCAATA GCCGTTACAA CGACCTTACT AGGCTGATTG GAAACTACAC CGACCACGCT 600GTTCGTTGGT ACAACACTGG CTTGGAGCGT GTCTGGGGTC CTGATTCTAG AGATTGGATT 660AGATACAACC AGTTCAGGAG AGAATTGACC CTCACAGTTT TGGACATTGT GTCTCTCTTC 720CCGAACTATG ACTCCAGAAC CTACCCTATC CGTACAGTGT CCCAACTTAC CAGAGAAATC 780TATACTAACC CAGTTCTTGA GAACTTCGAC GGTAGCTTCC GTGGTTCTGC CCAAGGTATC 840GAAGGCTCCA TCAGGAGCCC ACACTTGATG GACATCTTGA ACAGCATAAC TATCTACACC 900GATGCTCACA GAGGAGAGTA TTACTGGTCT GGACACCAGA TCATGGCCTC TCCAGTTGGA 960TTCAGCGGGC CCGAGTTTAC CTTTCCTCTC TATGGAACTA TGGGAAACGC CGCTCCACAA 1020CAACGTATCG TTGCTCAACT AGGTCAGGGT GTCTACAGAA CCTTGTCTTC CACCTTGTAC 1080AGAAGACCCT TCAATATCGG TATCAACAAC CAGCAACTTT CCGTTCTTGA CGGAACAGAG 1140TTCGCCTATG GAACCTCTTC TAACTTGCCC TCCGCTGTTT ACAGAAAGAG CGGAACCGTT 1200GATTCCTTGG ACGAAATCCC ACCACAGAAC AACAATGTGC CACCCAGGCA AGGATTCTCC 1260CACAGGTTGA GCCACGTGTC CATGTTCCGT TCCGGATTCA GCAACAGTTC CGTGAGCATC 1320ATCAGGGCTC CTATGTTCTC TTGGATACAC CGTAGTGCTG AGTTCAACAA CATCATCGCA 1380TCCGATAGTA TTACTCAAAT CCCTGCAGTG AAGGGAAACT TTCTCTTCAA CGGTTCTGTC 1440ATTTCAGGAC CAGGATTCAC TGGTGGAGAC CTCGTTAGAC TCAACAGCAG TGGAAACAAC 1500ATTCAGAATA GGAGGTATAT TGAAGTTCCA ATTCACTTCC CATCCACATC TACCAGATAT 1560AGAGTTCGTG TGAGGTATGC TTCTGTGACC CCTATTCACC TCAACGTTAA TTGGGGTAAT 1620TCATCCATCT TCTCCAATAC AGTTCCAGCT ACAGCTACCT CCTTGGATAA TCTCCAATCC 1680AGCGATTTCG GTTACTTTGA AAGTGCCAAT GCTTTTACAT CTTCACTCGG TAACATCGTG 1740GGTGTTAGAA ACTTTAGTGG GACTGCTGGA GTGATTATCG ACAGATTCGA GTTCATTCCA 1800GTTACTGCAA CACTCGAGGC TGAA1824(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度87(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅲ)其它信息CpTⅠ(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:3Met Asp Leu Lys His Leu Gly Ser Asp His His Asp Asp Ser Ser Asp Glu Pro Ser Glu1 10 20Ser Ser Glu Pro Cys Cys Asp Ser Cys Ile Cys Thr Lys Ser Ile Pro Pro Gln Cys His21 30 40Cys Thr Asp Ile Arg Trp Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Met Cys Thr Arg41 50 60Ser Met Pro Gly Lys Cys Arg Cys Leu Asp Ile Ala Asp Phe Cys Tyr Lys Pro Cys Lys61 70 80Ser Arg Asp Glu Asp Asp Glu81 87(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度282碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息经过修饰的CpTⅠ基因序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:4CTACTGCAGG ATGGATTTGA AGCACCTCGG AAGTAATCAT CATGATGACT CAAGCGATGA 60ACCTTCTGAG TCTTCAGAAC CATGCTGCGA TTCATGCATC TGCACTAAAT CAATACCTCC 120TCAATGCCAT TGTACAGATA TCAGGTGGAA CTCGTGTCAC TCGGCTTGCA AATCCTGCAT 180GTGTACACGA TCAATGCCAG GCAAGTGTCG TTGCCTTGAC ATTGCTGATT TCTGTTACAA 240ACCTTGCAAG TCCAGGGATG AAGATGATGA GTAAGAGCTC CC282(6)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度57碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息Ω序列片段引物-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:5CCTAGGATCC TATTTTTACA ACAATTACCA ACAACAACAA ACAACAAACA ACATTAC 57(7)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息Ω序列片段引物-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:6GTTGTTTGTT GTAATGTTAA TGATAAATGT TATTGTTACC TGACGTCGGG 50b(8)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度91碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息合成的Ω序列和Kozack片段(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:7CCTAGGATCC TATTTTTACA ACAATTACCA ACAACAACAA ACAACAAACA ACATTACAATTACTATTTAC AATAACAATG GACTGCAGCC C 91bp(9)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度802碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息外源基因表达盒5’端带有加倍增强子的355启动子序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:8CAAGCTTCAT ACAGAGCTCA ATGACAAGAA GAAAATCTTC GTCAACATGG TGGAGCTCTC 60bTTACGAACGA CACGATTGTC TACTCCAAAA ATATCAAAGA TACAGTCTCA GAAGACCAAA 120bGGGCAATTGA GACTTTTCAA CAAAGGGTAA TATCCGGAAA CCTCCTCGGA TTCCATTGCC 180bCAGCTATCTG TCACTTTATT GTGAAGATAG TGGAAAAGGA AGGTGGCTCC TTACAATGCC 240bATCATTGCGA TAAAGGAAAG GCCATCGTTG AAGATGCCTC TGCCGACAGT GGTCCCAAAG 300bATGGACCCCC ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA 360bAGCAAGTGGA TTGATGTGAT ACTCCAAAAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG 420bGGCAATTGAG ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCCGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC 480bAGCTATCTGT CACTTTATTG TGAAGATAGT GGAAAAGGAA GGTGGCTCCT TACAATGCCA 540bTCATTGCGAT AAAGGAAAGG CCATCGTTGA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA 600bTGGACCCCCA CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA 660bGCAAGTGGAT TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC 720bTTCGCAAGAC CCTTCCTCTA TATAAGGAAG TTCATTTCAT TTGGAGAGGA CACGCTGAAA 780bTCACCTCTAG AGGATCCCCG GG 802b(10)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息读码框不同的终止子编码序列(UT)(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:9CACTCGAGGC TGAATGAGTA AGTGAGTAGG TTAAC 35bp(11)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度95碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息正确切割和修饰以及植物多腺苷信号肽序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:10GGTTAACTTT GAGTATTATG GCATTGGAAA AGCCATTGTT CTGCTTGTAA TTTACTGTGT TTCTTTCAGTTTTTGTTTTC GGAAATAAAG TTAAC 95bp(12)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度137碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息多腺核苷酸序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:11GTTAACAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATTTAACAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 60bpAATTTAACAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAATTTAACA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 120bpAAAATTTAAA AGAGCTC137bp(13)SEQ ID NO:12的信息(ⅱ)序列特征(A)长度261碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息3’非编码序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:12CACTCGAGGC TGAATGAGTA AGTGAGTAGG TAACTTTGAG TATTATGGCA TTGGAAAAGC 60bpCATTGTTCTG CTTGTAATTT ACTGTGTTCT TTCAGTTTTT GTTTTCGGAA ATAAAGTTAA 120bpCAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATTTA ACAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAATTT 180bpAACAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAATTT AACAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAATT 240bpTAAAAGAGCT C 261bp(14)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度34碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息CpTⅠ基因的PCR引物-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:13CTACTGCAGC ATGGATTTGA ACCACCTCGG AAGT 34b(15)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度34碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息CpTⅠ基因的PCR引物-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:14GGGAGCTCTT ACTCATCATC TTCATCCCTG GACT 34b(16)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息CpTⅠ突变EcoRⅠ引物-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:15CAGGTGGAAC TCGTGTCAC 19b(17)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核苷酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息CpTⅠ突变EcoRⅠ引物-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:16GTGACACGAG TTCCACCTG19b(18)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度27碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因的PCR检测引物-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:17GGGCCCGCTG AATCCAACTG GAGAGGC 27b(19)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因的PCR检测引物-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:18CCATACAACT GCTTGAGTAA CCCAGAAGTT G 31b
权利要求
1．合成的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质或其部分的如SEQID NO:2所示的核苷酸序列及其功能等同序列。
2．根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其编码具有如SEQID NO:1所示的从氨基端约1-608的608个氨基酸或22-608的587个氨基酸的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质或其功能等同蛋白质。
3．根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其具有如SEQ IDNO:2所示的64至1824的核苷酸序列或其功能等同序列。
4．根据权利要求1至3中任一项的核苷酸序列，特征在于其基本上是由适合于在植物细胞中表达的优化密码子组成的。
5．经过修饰的编码豇豆胰蛋白酶抑制剂或其部分的如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列及其功能等同序列。
6．根据权利要求5的核苷酸序列，特征在于其具有如SEQ IDNO:4所示的53至271的核苷酸序列或其功能等同序列。
7．根据权利要求5的核苷酸序列，特征在于其编码具有如SEQID NO:3所示的从氨基端约1-87的87个氨基酸或15-87的73个氨基酸的豇豆胰蛋白酶抑制剂或其功能等同蛋白质。
8．适于在植物细胞中同时表达苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质或其部分及豇豆胰蛋白酶抑制剂或其部分的双价融合植物表达载体，其中包含1)．苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因表达盒；2)．豇豆胰蛋白酶抑制剂基因表达盒；
9．根据权利要求8的双价融合植物表达载体，其中1)的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因表达盒包含a)．5’端非编码区b)．权利要求1的核苷酸序列c)．3’端非编码区
10．根据权利要求8的双价融合植物表达载体，其中2)的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因表达盒包含a)．5’端非编码区b)．权利要求5的核苷酸序列c)．3’端非编码区
11．根据权利要求9或10的基因表达盒，其中a)所说的5’端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个编码核糖体结合蛋白的序列组成。
12．根据权利要求11的5’端非编码区，其中所说的带有加倍的增强子元件的CaMV 35S启动子序列具有如SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其功能等同序列。
13．根据权利要求11的5’端非编码区，其中所说的翻译增强序列是Ω序列和Kozak序列，具有如SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其功能等同序列。
14．根据权利要求9的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因表达盒，其中b)中所说的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:2所示的1-1824的核苷酸序列或其功能等同序列。
15．根据权利要求9的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因表达盒，其中b)中所说的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:2中所示的64至1824的核苷酸序列或其功能等同序列。
16．根据权利要求10的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因表达盒，其中b)中所说的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:4所示的11-271的核苷酸序列或其功能等同序列。
17．根据权利要求10的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因表达盒，其中b)中所说的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:4中所示的53至271的核苷酸序列或其功能等同序列。
18．根据权利要求9的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因表达盒，其中c)中所说的3’端非编码区具有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或其功能等同序列。该序列包含一个多联终止子序列，一个融合基因转录产物的切割序列和一个融合基因转录产物的加工序列，一个类似多聚腺苷酸化信号序列，和一个多聚腺苷酸化序列所组成。
19．根据权利要求10的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因表达盒，其中c)中所说的3’端非编码区包含一个多联终止子序列，具有如SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列或其功能等同序列。一个融合基因转录产物的切割序列和一个融合基因转录产物的加工序列，具有如SEQ IDNO:10所示的核苷酸序或其功能等同序列。
20．适于在植物细胞或整株植物中表达苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质以及豇豆胰蛋白酶抑制剂的双价融合植物表达载体，其具有保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0355的携带于大肠杆菌DH5α中的重组表达载体的特征。
21．产生对害虫有毒性且害虫对这种毒性较难以产生耐受性的植物的方法，该方法包括1)．构建所说的双价融合植物表达载体，具有如权利要求8至20所描述的特征。2)．用任何一种可行方法将步骤1)中得到的双价融合植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物及其后代，包括种子和任何部分的植物组织。
22．根据权利要求21的方法，其中所说的植物是可表达权利要求8的双价融合植物表达载体的任何一种植物。
23．根据权利要求21的方法，其中所说的植物是棉花。
全文摘要
本发明提供了全合成的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的基因序列以及经过修饰的编码豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因序列;包含所说两种基因序列的双价融合植物表达载体;这种载体导入植物后,可产生对昆虫表现有高抗虫性的转基因植物及其后代和种子,且昆虫不易对含有这两种杀虫蛋白质的转基因植物产生抗性,因而转基因植物应用生产后具有抗虫时效长的使用特点。本发明特别提供了可同时表达以上两种杀虫蛋白质的双价抗虫棉。
文档编号A01H5/00GK1219586SQ9810288
公开日1999年6月16日 申请日期1998年7月20日 优先权日1998年7月20日
发明者郭三堆, 崔洪志, 徐琼芳, 倪万潮 申请人:中国农业科学院生物技术研究中心