专利名称：枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌制备方法及其应用方法
技术领域：
本发明涉及的是一种微生物。本发明还涉及这种微生物的制备方法，同时本发明还涉及这种微生物的应用方法。
背景技术：
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发明内容本发明的目的在于提供一种可以将植物大分子蛋白质转化为小分子植物蛋白活性肽的枯草孢芽杆菌。本发明的目的还在于提供这种微生物的制备方法及其应用方法。
本发明的菌种是一种具有下列特性，命名为枯草孢芽杆菌(Bacillus subtilis)的菌种。
本发明的产品是采用这样的方法来制备的1.采样将采样工具及各种采样容器进行灭菌，在豆腐生产工厂附近下水道的淤泥中进行多点采样，将采集的样品密封带回实验室。
2.稀释将采集的样品混合均匀，称取10克样品，溶解于100mL无菌水中，其中装有80-100粒玻璃珠，用力摇动10分钟，静止一分钟。用1mL无菌吸管吸取1mL上清液，移入9mL无菌水试管中，彻底摇匀。然后再从9mL的稀释样中取出1mL样品再移入9mL无菌试管中，彻底摇匀。如此依次进行稀释，直至稀释到10-9。
3.分离从上述稀释的样品中用0.1mL无菌吸管分别取出0.1mL样品，移入琼脂平板培养基中，用无菌三角刮棒，涂布均匀，每个稀释度做两个重复。琼脂平板培养基的配方大豆分离蛋白6.0g、葡萄糖3.0g、氯化钠0.5g、脱脂乳粉4.0g、琼脂粉1.5g、加入1.6％的溴甲酚绿乙醇溶液1mL、pH7.0，121℃灭菌20分钟。
4.培养将涂布的平板置于37℃培养箱中倒置培养24小时，观察挑菌。
5.挑菌将菌落周围有透明圈的菌落挑入试管斜面中，挑取50个菌落，然后再进行二次分离纯化，最后得到纯培养。从上述50株菌种中选出两株透明圈最大者，进行紫外线照射诱变。
6.紫外线诱变初筛将其中两株菌分别在牛肉膏蛋白胨培养基中进行培养12小时，取出离心，用无菌水洗涤两次，再用生理盐水稀释，用玻璃珠摇匀打碎，使细胞数达到107。在30W紫外灯下，距离10cm照射6分钟，红光下操作，然后涂布于上述琼脂平板上，避光培养36小时。挑取菌落，移入试管斜面中，挑取50株菌株。
7.复筛将50株菌种逐个进行培养、性能测试，从其中筛选出2株性能最佳者，再进行诱变筛选，反复进行3次。最后得到最优良菌种L-B-05进行菌种鉴定。
用本发明的枯草孢芽杆菌制取植物蛋白活性肽的方法以植物蛋白为原料，原料先进行预处理，加水配制成重量百分比浓度为6-18％，调整PH值为6.0-7.0，然后在121℃高温下进行灭菌处理，冷却至30-35℃，按重量百分比为5.0-10.0％接入培养成熟的枯草芽孢杆菌L-B-05菌种，通入无菌空气，进行搅拌发酵，发酵时保持温度在35℃±2℃，发酵周期为24-48小时；发酵结束在121℃温度下进行高温灭活，先进行过滤分离或精制，浓缩至25-40Bx，喷雾干燥制成产品。
用本发明的枯草孢芽杆菌制取植物蛋白活性肽的方法还可以包括1、高温灭活后，先进行过滤分离或精制，上清液再浓缩至25-40Bx，喷雾干燥制成产品。
2、所述的预处理是将原料进行粉碎、配料、灭菌。
3、枯草芽孢杆菌L-B-05菌种的培养方法为斜面培养基牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂15克，水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20分钟，摆成斜面冷却，接种后35℃培养24小时，备用。
三角瓶液体培养基和液体扩大种子培养基称取100g豆粕粉，加1000mL水，使之彻底溶解，pH自然，121℃灭菌20分钟，冷却至35℃，接入种子，35℃温度下进行通风培养12-16小时，培养成熟后接入发酵罐进行发酵。
对本发明的菌种进行鉴定结果细胞形态为杆状、能形成芽孢、芽孢不膨大、芽孢呈卵圆或短杆状、不形成伴孢晶体、革兰氏染色阳性、接触酶、VP试验＜pH6、甲基红试验均呈阳性、氧化酶、VP＞pH7试验呈阴性，好氧生长，能够利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，利用葡萄糖不产气，能利用柠檬酸盐、能还原硝酸盐、能水解淀粉和干酪素，在pH5.7和7％NaCl培养基中能够生长，50℃温度下不能生长，不能液化明胶。该菌株L-B-05保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2005年05月08日，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，登记入册编号为CGMCC NO.1367。
以枯草芽孢杆菌L-B-05为菌种，以大豆分离蛋白，大豆粉、大豆粕、豆饼、玉米蛋白粉、花生蛋白、花生饼、小麦谷朊蛋白粉、豌豆蛋白粉、棉籽蛋白、棉籽饼、油菜籽蛋白、菜籽饼中的任何一种或一种以上混合为主要原料进行发酵试验，经发酵将原料中的大分子蛋白质转化为小分子物质的植物蛋白活性肽。
通过生物发酵的方法，将植物中含有的蛋白质，转化成植物蛋白活性肽。其产品的分子量范围在200-10000道尔顿之间，而分子量在2000道尔顿以下的分子占总肽含量的90％以上。小分子植物蛋白活性肽不仅具有很好的溶解性、低粘度、高浓度优良的流动性，而且在体内吸收快、利用率高。植物蛋白肽除了营养丰富、容易吸收外，还具有抗高血压，抗胆固醇，抗血栓形成，改善脂质代谢，消除过多脂肪，防止动脉硬化，增强人体体能和肌肉力量，促进肌红细胞复原，帮助恢复疲劳，促进钙磷和其它微量元素吸收、可以形成螯合钙直接进入血液沉积在骨骼中、不需要VD的参与。植物蛋白肽还有清除自由基、抗氧化性，起血液清道夫作用。植物蛋白活性肽还能促进大脑和神经发育、提高记忆力。植物蛋白活性肽还具有增强吞噬细胞和B细胞活力，增强免疫功能、抗癌、抗衰老、保护表皮细胞、防止黑色素沉淀、促进细胞繁殖。保护肝脏、并有助于肝功能恢复，对糖尿病人具有预防和治疗作用，可预防老年性痴呆、老年性骨质疏松和胆结石的发生。
植物蛋白活性肽的粗制品如果应用于动物饲养可以促进动物的生长发育、提高动物的免疫力，增强抗病能力，降低料肉比，增进和诱发动物食欲。用于断奶仔猪和保育猪可防止红白痢的发生，减少死亡率，促进动物肠道绒毛细胞的发育。用于虾的养殖可促进虾的快速生长，防治虾病的发生。用于奶牛的养殖可增加奶牛的产奶量和奶的质量。用于毛皮动物的养殖可使毛皮更加光亮。植物蛋白活性肽还可以用于花卉、烟草、中草药、人参等经济作物的种植，提高产量和品质。
根据这些功能植物蛋白活性肽可以作为添加剂或者是强化剂，添加到食品或饮料中，制成婴幼儿特制大豆肽奶粉，孕妇、中老年保健大豆肽粉剂、冲剂、片剂、胶囊，大豆肽儿童食品、饮品，学生早餐增智食品、饮品，大豆肽运动员专用增强体能饮料，大豆肽咖啡、提神、醒脑、健脑、抗疲劳饮品，病人康复食品、饮品，妇女抗衰驻颜饮品、食品，肽护肝、保肾、抗癌、减肥、抗血栓、防动脉硬化防糖尿病食品、饮品，肽强力补钙、磷、微量元素吸收剂，肽保健白酒、啤酒、黄酒等酒类，肽养颜扩肤化妆品，优质微生物培养基等。
植物蛋白活性肽主要应用于食品、化妆品、保健品，其粗制品可用于发酵工业的微生物培养基、饲料强化剂、植物生长促进剂等等。
(四)具体实施方案上述方案，也是本发明的最佳实施方案。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征是它是具有如下特性
2.一种枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征是(1)采样将采样工具及各种采样容器进行灭菌，在豆腐生产工厂附近下水道的淤泥中进行多点采样；(2)稀释将采集的样品混合均匀，称取10克样品，溶解于100mL无菌水中，其中装有80-100粒玻璃珠，用力摇动10分钟，静止一分钟，用1mL无菌吸管吸取1mL上清液，移入9mL无菌水试管中，彻底摇匀，然后再从9mL的稀释样中取出1mL样品再移入9mL无菌试管中，彻底摇匀，如此依次进行稀释，直至稀释到10-9；(3)分离从上述稀释的样品中用0.1mL无菌吸管分别取出0.1mL样品，移入琼脂平板培养基中，用无菌三角刮棒，涂布均匀，每个稀释度做两个重复，琼脂平板培养基的配方大豆分离蛋白6.0g、葡萄糖3.0g、氯化钠0.5g、脱脂乳粉4.0g、琼脂粉1.5g、加入1.6％的溴甲酚绿乙醇溶液1mL、pH7.0，121℃灭菌20分钟；(4)培养将涂布的平板置于37℃培养箱中倒置培养24小时，观察挑菌；(5)挑菌将菌落周围有透明圈的菌落挑入试管斜面中，挑取50个菌落，然后再进行二次分离纯化，最后得到纯培养，从上述50株菌种中选出两株透明圈最大者，进行紫外线照射诱变；(6)紫外线诱变初筛将其中两株菌分别在牛肉膏蛋白胨培养基中进行培养12小时，取出离心，用无菌水洗涤两次，再用生理盐水稀释，用玻璃珠摇匀打碎，使细胞数达到107，在30W紫外灯下，距离10cm照射6分钟，红光下操作，然后涂布于上述琼脂平板上，避光培养36小时。挑取菌落，移入试管斜面中，挑取50株菌株；(7)复筛将50株菌种逐个进行培养、性能测试，从其中筛选出2株性能最佳者，再进行诱变筛选，反复进行3次，最后得到最优良菌种L-B-05进行菌种鉴定。
3.一种枯草芽孢杆菌的应用方法，其特征是以植物蛋白为原料，原料先进行预处理，加水配制成重量百分比浓度为6-18％，调整PH值为6.0-7.0，然后在121℃高温下进行灭菌处理，冷却至30-35℃，按重量百分比为5.0-10.0％接入培养成熟的枯草芽孢杆菌L-B-05菌种，通入无菌空气，进行搅拌发酵，发酵时保持温度在35℃±2℃，发酵周期为24-48小时；发酵结束在121℃温度下进行高温灭活，先进行过滤分离或精制，浓缩至25-40Bx，喷雾干燥制成产品。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌的应用方法，其特征是高温灭活后，先进行过滤分离或精制，上清液再浓缩至25-40Bx，喷雾干燥制成产品。
5.根据权利要求3或4所述的枯草芽孢杆菌的应用方法，其特征是所述的预处理是将原料进行粉碎、配料、灭菌。
6.根据权利要求3或4所述的枯草芽孢杆菌的应用方法，其特征是枯草芽孢杆菌L-B-05菌种的培养方法为斜面培养基牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl5克，琼脂15克，水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20分钟，摆成斜面冷却，接种后35℃培养24小时，备用。三角瓶液体培养基和液体扩大种子培养基称取100g豆粕粉，加1000mL水，使之彻底溶解，pH自然，121℃灭菌20分钟，冷却至35℃，接入种子，35℃温度下进行通风培养12-16小时，培养成熟后接入发酵罐进行发酵。
7.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌的应用方法，其特征是枯草芽孢杆菌L-B-05菌种的培养方法为斜面培养基牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl5克，琼脂15克，水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20分钟，摆成斜面冷却，接种后35℃培养24小时，备用。三角瓶液体培养基和液体扩大种子培养基称取100g豆粕粉，加1000mL水，使之彻底溶解，pH自然，121℃灭菌20分钟，冷却至35℃，接入种子，35℃温度下进行通风培养12-16小时，培养成熟后接入发酵罐进行发酵。
全文摘要
本发明提供的是一种枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌制备方法及其应用方法。该菌种具有细胞形态为杆状、能形成芽孢、芽孢不膨大、芽孢呈卵圆或短杆状、不形成伴孢晶体、革兰氏染色阳性、接触酶、VP试验＜pH6、甲基红试验均呈阳性、氧化酶、VP＞pH7试验呈阴性，好氧生长，能够利用葡萄糖、木糖、L－阿拉伯糖、甘露醇产酸，利用葡萄糖不产气，能利用柠檬酸盐、能还原硝酸盐、能水解淀粉和干酪素，在pH5.7和7％NaCl培养基中能够生长，50℃温度下不能生长，不能液化明胶的特性。以植物蛋白为主要原料，用本发明的菌种进行发酵，可将原料中的大分子蛋白质转化为小分子物质的植物蛋白活性肽。
文档编号C12R1/125GK1782068SQ20051001022
公开日2006年6月7日 申请日期2005年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者梁金钟 申请人:乐能生物工程股份有限公司