专利名称：：出血性大肠杆菌o157重组疫苗的制作方法出血性大肠杆菌0157重组疫苗所属领域本发明涉及出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株，特别是涉及失去了致病能力但保留其特异免疫原性的出血性大肠杆菌0157基因工程重组疫苗菌株。本发明进一步涉及基于所说的出血性大肠杆菌0157疫苗、其生产方法及其在预防人出血性大肠杆菌0157感染和预防出血性大肠杆菌0157在反刍动物消化道定居与繁殖中的应用。
背景技术：
：出血性大肠杆菌(EHEC;是一种重要的新发食物源性人兽共患病病原菌。EHEC主要是通过被污染的食物进入体内，感染肠上皮细胞，导致被感染者的出血性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿路综合症(RileyLW,Wfl/,TheNewEnglandJournalofMedicine,308(12):681-685,1983;LevineMM,JournalofInfectiousDiseases,155:377-389,1987)。迄今，临床上还没有可甩的预防EHEC0157感染的疫苗。为了治疗EHEC0157感染，目前主要是使用抗生素。然而，由于抗生素治疗可导致严重的肠道菌群失调和耐药菌株的发生，而且某些抗生素会裂解细菌菌体而引起毒素释放，以致引发更为严重的病理反应，所以临床上大多不主张使用抗生素治疗，希望尽早找到一种能够有效预防EHgC0157感染的疫苗。美国专利5，354，661号描述了抗出血性大肠杆菌0157:H7和大肠杆菌026:H11的单克隆抗体。美国专利6,410,024号描述了EHEC0157:H7毒素的抗原决定基，以及抗这种毒素的抗体及其作为治疗和诊断制剂的应用。美国专利6,365,723号公开了基于EHEC0157:H7脂多糖O-侧链抗原决定基的抗体及口服疫苗。美国专利6,291,435号公开了含有单糖或多糖序列的组合物及其在降低EHEC毒力和治疗EHEC感染中的应用。美国专利6,485，卯2号公开了使用噬菌体(例如V5)降低肠道内EHEC0157水平的方法。美国专利6,383,496号描述了具有RpoS+表型和多基因突变的减毒伤寒沙门氏杆菌、其生产方法及其在疫苗制备中作为基因递送载体的应用。迄今，只有本发明人曾构建了肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗(中国专利ZL03157537.4)。本发明人在肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗专利的基础上，将突变后的无毒性的志贺毒素1(Stxl)和志贺毒素2(Stx2)突变体基因导入上述疫苗菌株，构建得到本发明的新的EHEC0157重组疫苗菌株，并实验证实了该疫苗菌株具有良好的安全性和免疫保护作用，从而完成了本发明。
发明内容本发明的一个目的是提挺活的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株，其特征在于在肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登记号CGMCCNo.1015)的基础上，导入了突变后的无毒性的志贺毒素突变体基因，从而进一步提高了疫苗菌株的免疫原性。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗是如中国专利号ZL03157537.4中所限定的疫苗菌株。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的志贺毒素基因是EHEC0157:H7基因组中的stxl和stx2基因。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的志贺毒素突变体基因是stxl和stx2基因的A亚基突变后的基因。，本发明的另一个目的是提供生产如上限定的疫苗菌株的方法，该方法包括-(1)扩增得到EHEC0157:H7的stxl和stx2全基因及两侧的部分侧翼序列，并将扩增得到的基因片段克隆到适当的载体中；(2)分别对扩增得到的stxl和stx2A亚基的毒性活性区和跨膜转运区的碱基进行点突变，使之丧失细胞毒性，并将突变后的突变体序列分别克隆到适当的载体中；(3)用步骤(2)得到的重组载体转化适当的宿主细胞；(4)对步骤(3)得到的重组细胞培养物上清进行细胞毒性实验，筛选出丧失了细胞毒性的stxl和stx2突变体序列；(5)用步骤(4)得到的携带有无毒性的stxl和stx2突变体序列的重组质粒转5化到肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗，得到本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株。根据本发明的一个优选实施方案，其中步骤(2)中所说的丧失了细胞毒性的Stxl突变体序列是第167位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E167D)，第170位的精氨酸突变成亮氨酸(R170U，第231位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A231D)和第234位的甘氨酸突变成谷氨酸(G234E)。并且其中所说的丧失了细胞毒性的Stx2突变体序列是第166位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E166D)，第219位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A219D)和第232位的甘氨酸突变成谷氨酸(G232E)。本发明的再一个目的是提供用于免疫接种人以预防EHEC0157感染或免疫接种反刍动物以阻止EHEC0157在消化道定居与繁殖的疫苗组合物，所说的疫苗组合物含有如上限定的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的疫苗组合物还可含有一种或多种包括但不限于弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂在内的免疫增强剂或免疫调节剂。本发明提供出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株，特别是提供失去了致病能力但保留有特异免疫原性的出血性大肠杆菌0157基因工程重组致弱疫苗菌株。本发明进一步提供基于所说的出血性大肠杆菌0157重组疫苗、其生产方法及其在预防人出血性大肠杆菌0157感染或免疫接种反刍动物以阻止EHEC0157在消化道定居与繁殖中的应用。作为一种活的重组疫苗株，应该在弱毒性和免疫原性这两者间保持平衡。也就是说，这样的疫苗株不应在正常宿主体内引发任何疾病或损伤，同时被接种后又能够在机体内定居并发挥免疫原活性。'本发明人在肠出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗(中国专利ZL03157537.4)菌株(保藏登记号CGMCCNo.1015)的基础上，成功地构建了保有这种平衡的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株。本发明的疫苗菌株是在肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株的基础上，导入丧失了细胞毒性的stxl和stx2突变体基因。我们的实验研究证实，本发明的0157重组疫苗菌株确实失去了对正常功能性细胞和活体动物模型的致病性，并且具有预防野生型EHEC0157感染的免疫原性，并对模型小鼠具有良好的免疫保护作用。在制备本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗的实践中，本发明人在以前成功地构建了肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登记号CGMCCNo.1015)的基础上，确定以忐贺毒素stx基因为对象，对stxl和stx2的基因进行点突变，然后筛选出丧失了细胞毒性的Stxl和Stx2突变体，并将无毒性的stxl和stx2突变体基因导入肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株，从而得到丧失了致病性但保留有足够免疫原性的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株。简单地说，为本发明的目的，本发明人f先以肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登记号CGMCCNo.1015)(参见中国专利ZL03157537.4)为基础，使用聚合酶链反应(PCR)方法从EHEC0157:H7野生强毒菌株EDL933中分别扩增出stxl和stx2的全基因及其旁侧序列，并对编码stxl和stx2的基因进行点突变，然后将突变后得到的stxl和stx2突变体基因克隆到质粒pUC18中，并将所得重组质粒转化到宿主菌(大肠杆菌DH5a)内。然后利用vero细胞对携带stxl和stx2突变体基因的重组菌株进行细胞毒性实验，以筛选到丧失了细胞毒性的stxl和stx2突变体基因。将携带丧失了细胞毒性作用的stxl和stx2突变体基因的重组质粒导入肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株内，使带有该重组质粒的0157重组菌株能表达丧失了细胞毒性的志贺毒素，以增强0157疫苗菌株的免疫原性，从而构建出本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株。然后，再利用vero细胞和小鼠模型对本发明疫苗菌株的安全性、免疫原性和免疫保护作用进行了深入研究。结果证实，本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗具有良好的安全性和免疫原性，并对实验动物(小鼠)具有良好的免疫保护作用(参见实施例4-8)。'因此，本发明的方法包括以下步骤(1)从EHEC0157:H7基因组中扩增得到stxl和stx2全基因及旁侧序列，并将其克隆到适当的载体中；(2)对stxl和stx2中的基因进行定点突变；(3)将步骤(2)得到的stxl和stx2突变体基因克隆到适当的载体中；(4)用步骤(3)得到的重组载体转化适当的宿主细胞，并利用细胞毒性实验筛7选丧失了细胞毒性的Stxl和Stx2突变体；(5)将携带有stxl和stx2无毒性突变体序列的重组质粒转入肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株；(6)利用vero细胞检测步骤(5)的重组菌株的细胞毒性；(7)利用小鼠模型检测步骤(5)的重组菌株对实验小鼠的安全性和免疫保护作用。根据本发明的优选实施方案，其中stxl全序列包括A亚基上游S13bp至B亚基下游665bp，共2705bp。根据本发明的优选实施方案，其中所说的stx2全序列包括A亚基上游925bp至B亚基下游232bp，共2402bp。根据本发明的优选实施方案，其中stxl和stx2中突变的碱基是编码毒性活性区和跨膜转运区的核苷酸序列。根据本发明的优选实施方案，其中所说的肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株是如中国专利ZL03157537.4中所限定的、具有保藏登记号CGMCCNo.1015的菌株。具体地说，通过序列分析发现，在Stx的A亚基中有两个高度保守的区域。一个位于毒素的毒性活性区，另一个位于毒素的跨膜转运区。通过对这两个保守区域的突变，可能消除毒素的毒性，但保留完全的免疫原性。本实验即在此基础上，分别对Stxl和Stx2的A亚基上这两个区域内的碱基进行点突变，并针对Stx及其突变体的细胞毒性进行研究。首先进行stxl及其突变体基因的克隆。根据EHEC0157:H7基因组上stxl序列及侧翼序列设计引物。其中引物FSZ34cggaattctgtatactgcatggtgcc(SEQIDNO:5)和FSZ35gaattccatatgcagtgctgtgacgatgatg(SEQIDNO:6)用于扩增stxl全序列。引物FSZ36actgtgacagctcaagctttactttttcggca(SEQIDNO:7)和FSZ37tgccgaaaaagtaaagcttgagctgtcacagt(SEQIDNO:8)位于stxlA亚基的毒性活性区，这一对引物能够互补配对，并在其中引入了两个突变碱基。引物FSZ38taatgccacgctctcgaggatatcattaatgcttc(SEQIDNO:9)和FSZ39gaagcattaatgatatcctcgagagcgtggcatta(SEQIDNO:10)位于stxlA亚基的跨膜转运区，这一对引物能互补配对，并在其中引入了两个突变碱基。用引物FSZ34(SEQIDNO:5)禾[JFSZ35(SEQIDNO:6)从EDL933菌株的基因组中PCR扩增出stxl全基因及侧翼片段的DNA序列，将其克隆到质粒pUC18的Ndel/Xbal位点之间，以构建得到重组质粒pSTXl;用引物FSZ36(SEQIDNO:7)禾卩FSZ37(SEQIDNO:8)对stxl基因毒性活性区进行点突变，并将突变后的片段克隆到质粒pUC18的Ndel/Xbal位点之间，构建出重组质粒pSTXl.l;用引物FSZ38(SEQIDNO:9)禾nFSZ39(SEQIDNO:10)对stxl基因跨膜转运区进行点突变，并将突变后的片段克隆到质粒pUC18的Ndel/Xbal位点之间，构建出重组质粒pSTX1.2。然后，再用上述引物对stxl基因的毒性活性区和跨膜转运区同时进行点突变，将突变后的片段克隆到质粒pUCl8的Ndel/Xbal位点之间，构建出重组质粒pSTXl.3。然后进行stx2及其突变体基因的克隆。根据EHEC0157:H7基因组上stx2全序列及侧翼DNA序列设计引物。引物FSZ31cgggatccttcacaaagcggagggga(SEQIDNO:3)和FSZ32cggaattctgtatactgcatggtgcc(SEQIDNO:4)用于扩增stx2全序列。引物FSZ26gcgtaaggcgtctgctgtg(SEQIDNO:1)和FSZ27cacagcagacgccttacgc(DEQIDNO:2)位于stx2A亚基的毒性活性区，这一对引物能够互补配对，并在其中引入了:两个突变碱基。引物FSZ40taatatatcagacatactggagactgtggc(SEQIDNO:11)禾QFSZ41gccacagtctccagtatgtctgatatatta(SEQIDNO:12)位于stx2A亚基的跨膜转运区，这一对引物能够互补配对，并在其中引入了两个突变碱基。使用引物FSZ31(SEQIDNO:3)和FSZ32(SEQIDNO:4)从EDL933菌株基因组中扩增出stx2全基因及侧翼片段的DNA序列，并将其克隆到质粒pUC18的BamHI/EcoRI位点之间，构建出重组质粒pSTX2;用引物FSZ26(SEQIDNO:1)和FSZ27(SEQIDNO:2)对stx2基因的毒性活性区进行点突变，并将突变后的片段克隆到质粒pUC18的BamHI/EcoRI位点之间，构建出重组质粒pSTX2.1;用引物FSZ40(SEQIDNO:11)禾卩FSZ41(SEQIDNO:12)对stx2基因的跨膜转运区进行点突变，并将突变后的片段克隆到质粒pUC18的BamHI/EcoRI位点之间，构建出重组质粒pSTX2.2;再使用上述引物对stx2基因的毒性活性区和跨膜转运区同时进行点突变，将突变后的片段克隆到质粒pUC18的BamHI/EcoRI位点之间，构建出重组质粒pSTX2.3。9然后，将上述扩增到的Stxl毒性活性区和跨膜转运区突变片段以及Stx2毒性活性区和跨膜转运区突变片段分别克隆到质粒pUC18的Ndel/Xbal和BamHI/EcoRI位点之间，构建出同时含有stxl和stx2突变基因片段的重组质粒pSTX1.3-STX2.3。在最终构建的重组质粒pSTX1.3-STX2.3中，Stxl毒性活性区第167位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E167D)，第170位的精氨酸突变成亮氨酸(R170L);跨膜区第231位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A231D)，第234位的甘氨酸突变成谷氨酸(G234E)。Stx2毒性活性区第166位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E166D);跨膜区第219位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A219D)，第232位的甘氨酸突变成谷氨酸(G232E)。然后将带有志贺毒素突变体基因的重组质粒转化到宿主菌中。由于我们克隆的Stxl和Stx2序列上游包含志贺毒素表达所需的调控序列，所以在将毒素基因及其突变体基因转入大肠杆菌后，毒素及其突变体基因能够利用自身的表达调控元件来启动毒素基因或突变体基因的表达，以尽可能表达出具有天然结构的志贺毒素及其突变体，使之具有天然的构象和免疫原性。由于利用了志贺毒素自身的表达调控元件，并以大肠杆菌作为宿主，因此可与在出血性大肠杆菌中一样将所表达的毒素分泌到细菌培养液中。然后，利用vero细胞作为靶细胞，检测野生型志贺毒素及其突变体对vero细胞的毒性作用。将带有志贺毒素或其突变体序列的重组菌株培养以后，过滤分离细菌培养物上清，并使用经过相同处理的大肠杆菌DH5a培养物上清作为对照，检测志贺毒素及其突变体的细胞毒性作用。简单地说，将过滤后的细菌培养物上清按IO倍梯度稀释后，加入到培养好的vero细胞中，检测并按下面公式计算野生型志贺毒素或其突变体对vero细胞生长的抑制率。抑制率=(对照组OD值一实验组OD值)/对照组OD值\100%重复实验3次后，绘制出野生型Stxl、Stx2及其突变体对vero细胞生长的抑制曲线，并比较志贺毒素不同突变体对vero细胞的毒性，观察志贺毒素突变后的毒性变化。结果表明相对于未突变的Stxl，突变体Stxl.l和Stxl.3的毒性下降明显，约下降了1000倍，可以认为己基本消除了细胞毒性；而相对于未突变的Stx2，突变体Stx2.1、Stx2.2和Stx2.3的毒性也都明显下降，其中Stx2.3毒性下降最大，故可以认为已完全消除了细胞毒性。将带有已消除了毒性作用的stxl和stx2突变体基因的重组质粒pSTX1.3-STX2.3转入我们以前构建的肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登记号:CGMCCNo.1015;中国专利号ZL03157537.4)中，构建出本发明的目的菌株出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株。按照布达佩斯条约的规定，本发明人已于2008年6月16日，将本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株(命名为0157-AM934,分类命名为大肠埃希氏菌￡^/'^/^^^//)保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登记号为CGMCCNo.2539。为了评价本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的安全性和免疫原性，分别对其生物学特性和免疫学特性进行了下述实验研究。1、Vero细胞毒性实验将EHEC0157:H7EDL933和出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的培养物上清过滤后，按前述细胞毒性实验方法检测这两个菌株培养物上清对vero细胞生长的抑制作用，并对这两个菌株对vero细胞的毒性作用进行比较分析。结果表明，EHEC0157:H7野生型强毒菌株EDL933对vero细胞具有很强的毒性作用，本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株基本丧失了对vero细胞的毒性作用。2、出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的稳定性实验在LB中连续传代培养本发明的疫苗菌株，传代的过程中不使用抗生素，以检验在没有抗生素压力的情况下，重组质粒在疫苗菌株中的稳定性。结果表明，在无抗生素压力的情况下，本发明的疫苗菌株传10代以内，具有良好的稳定性。3、出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的安全性实验将离乳小鼠随机分为2组，分别灌胃接种EHEC0157:H7EDL933(作为对照组)和本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株，接种剂量均为4xl(^CFU/只。同时对小鼠腹腔注射丝裂霉素(2.5mg/kg体重)。观察并记录小鼠生长状态。结果表明，接种本发明疫苗菌株的实验组小鼠生长正常，无可见的临床症状;接种野生型强毒株0157:H7EDL933的对照组小鼠体重迅速减轻，4天内8只小鼠全部死亡。此结果证实，本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株丧失了对实验小鼠的致病性，具有良好的安全性。4、出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株免疫后的小鼠排菌实验将20只昆明鼠，随机分为空白对照组和本发明出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株免疫组。免疫14天后用强毒株EHEC0157:H7EDL933进行灌胃攻毒，然后每天检测小鼠粪便中的排菌情况。结果可见，用生理盐水的空白对照组小鼠，直到攻毒后13天还可检测到粪便中仍然有EHEC0157:H7EDL933。而免疫组小鼠攻毒后第6天，从免疫组小鼠粪便中则检测不到EHEC0157:H7EDL933排出。说明本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株免疫后，可有效縮短强毒菌株在动物肠道内的定居时间。5、出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的被动免疫保护性实验(母源抗体对乳鼠的保护性)将体重约28g的母鼠40只随机分为未免疫空白对照组和本发明疫苗菌株免疫组。首次免疫7天后，将公鼠与母鼠混养交配。再过7天，对母鼠加强免疫l次。第2次免疫后大约2周，将怀孕即将分娩的母鼠分笼喂养。母鼠分娩后，对所生的7日龄乳鼠以强毒菌株EHEC0157:H7EDL933进行灌胃攻毒。记录小鼠死亡情况，以评价疫苗菌株免疫保护效果。结果可见，接受强毒菌株攻击的乳鼠从第3天开始死亡。未免疫对照组母鼠所生乳鼠的存活率只有16.8%，而免疫组母鼠所生乳鼠的存活率为83.0%。表明本发明疫苗菌株免疫母鼠后，戶万生的乳鼠能够从吸晚母乳时获得母源抗体，从而使乳鼠获得较好的被动免疫保护作用。以上对本发明出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的稳定性、安全性、细胞毒性和对强毒菌株在小鼠肠道定居时间的影响，以及用乳鼠进行的免疫保护性实验结果可以充分证实本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株具有良好的稳定性、安全性和免疫原性，并具有良好的兔疫保护作用。本发明的重组菌株完全可以作为一种疫苗菌株，用于生产针对出血性大肠杆菌0157感染的免疫预防制剂。因此，本发明进一步提供了免疫接种人以预防EHEC0157感染或免疫接种反刍动物以阻止EHEC0157在消化道定居与繁殖的疫苗组合物。所说的疫苗组合物含有如上限定的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。12根据本发明的优选实施方案，其中所说的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株是在我们以前发明的肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登记号:CGMCCNo.1015)(中国专利号ZL03157537.4)的基础上，导入丧失了细胞毒性的stxl和stx2突变体基因后得到的重组菌株。根据本发明的优选实施方案，其中所说的疫苗组合物还可含有一种或多种免疫增强剂或免疫调节剂。其中所说的免疫增强剂或免疫调节剂包括但不只限于弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。本发明的再一个目的是提供预防人EHEC0157感染或免疫接种反刍动物以阻止EHEC0157在消化道定居与繁殖的方法，该方法包括给所说的反刍动物投用预防有效量如上限定的疫苗组合物。可以使用疫苗生产领域已知的常规方法，将本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株原液或其稀释液与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合，并根据需要制成适于口服或非口服途径给药的单位计量形式的疫苗组合物。适于胃肠道外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚乙二醇、油等常用的赋形剂。特别是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作为赋形剂，制备本发明疫苗组合物的缓释制剂。具体地说，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等赋形剂，淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等黏结剂，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性剂，以及着色剂、矫味剂、香料、分散剂等辅助成分，以常规方法制备片剂或胶囊形式的疫苗组合物。或者，可以使用水、生理盐水、植物油'(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶剂，氯化钠和葡萄糖等等渗剂，苯酚、甲酚、对位羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐剂，抗坏血酸和焦磷酸钠等抗氧化剂，以常规方法制备可注射形式的疫苗组合物。为了改善本发明疫苗组合物的热稳定性和有效储存期限，可以将细菌原液或其稀释液按适当比例与疫苗保护剂或稳定剂混合，然后冻干，制成本发明疫苗组合物的冻干制剂。其中所说的保护剂或稳定剂可以由人血清白蛋白或明胶、海藻糖、谷氨酸钠、尿素以及山梨醇和/或甘露醇等成分组成。为了提高本发明疫苗组合物的免疫接种效果，可以在组合物中加入一种或多种免疫增强剂或免疫调节剂。所说的免疫增强或免疫调节剂包括但不只限于弗氏完全或不完全佐剂。下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。具体实施例方式实施例l:志贺毒素(StX)全基因及其突变体基因的扩增与克隆首先进行stxl全基因及其突变基因的克隆。根据已报道的EHEC0157:H7EDL933基因组上stxl的全序列及其两侧翼DNA序列设计引物。弓l物FSZ34(SEQNO:5)和FSZ35(SEQNO:6)分别位于扩增目的序列的5'端和3，端，用于扩增stxl全序列。引物FSZ36(SEQNO:7)和FSZ37(SEQNO:8)位于stxlA亚基的毒性活性区，这两条引物能够互补配对，并在其中引入了两个突变碱基。引物FSZ38(SEQNO:9)禾口FSZ39(SEQNO:10)位于stxlA亚基的跨膜转运区，这两条引物也能够互补配对，并在其中引入了两个突变碱基。用引物FSZ34(SEQNO:5)禾QFSZ35(SEQNO:6)从EDL933菌株基因组中以聚合酶链反应(PCR)方法扩增出包含stxl全基因及侧翼序列的DNA片段，将之克隆到质粒pUC18的Ndel和Xbal位点之间，构建重组质粒pSTXl;用引物FSZ36(SEQNO:7)和FSZ37(SEQNO:8)对stxl基因毒性活性区进行点突变，将突变后的片段克隆到质粒pUC18的Ndel/Xbal位点之间，构建重组质粒pSTXl.l;用引物FSZ38(SEQNO:9)禾口FSZ39(SEQNO:10)对stxl基因跨膜转运区进行点突变，将突变后的片段克隆到质粒pUC18的Ndel/Xbal位点之间，构建重组质粒pSTX1.2;再用上述引物对stxl基因的毒性活性区和跨膜转运区同时进行突变，将突变后的片段克隆到质粒pUC18的Ndel/Xbal位点之间构建重组质粒pSTX1.3。然后进行stx2全基因及其突变基因的克隆。根据已报道的EHEC0157:H7EDL933基因组上stx2的全序列及其两侧翼DNA序列设计引物。弓l物FSZ3114(SEQNO:3)和FSZ32(SEQNO:4)分别位于扩增目的序列的5'端和3，端，用于扩增stx2全序列。弓I物FSZ26(SEQNO:1)禾卩FSZ27(SEQNO:2)位于stx2A亚基的毒性活性区，这两条引物能够互补配对，并在其中引入了两个突变碱基。弓I物FSZ40(SEQNO:11)和FSZ41(SEQNO:12)位于stx2A亚基的跨膜转运区，这两条引物能够互补配对，并在其中引入了两个突变碱基。用引物FSZ31(SEQNO:3)和FSZ32(SEQNO:4)从EDL933菌株基因组中以聚合酶链反应(PCR)方法扩增出包含stx2全基因及侧翼序列的DNA片段，将之克隆到质粒pUC18的BamHI/EcoRI位点之间，构建重组质粒pSTX2;用引物FSZ26(SEQNO:1)禾PFSZ27(SEQNO:2)对stx2基因毒性活性区进行点突变，将突变后的片段克隆到质粒pUC18的BamHI/EcoRI位点之间，构建重组质粒pSTX2.1;用引物FSZ40(SEQNO:11)禾QFSZ41(SEQNO:12)对stx2基因跨膜转运区进行点突变，将突变后的片段克隆到质粒pUC18的BamHI/EcoRI位点之间，构建重组质粒pSTX2.2;再用上述引物对stx2基因的毒性活性区和跨膜转运区同时进行突变，将突变后的片段克隆到质粒pUC18的BamHI/EcoRI位点之间，构建重组质粒pSTX2.3。然后，将上述扩增到的stxl毒性活性区和跨膜转运区突变片段以及stx2毒性活性区和跨膜转运区突变片段分别克隆到质粒pUC18的Ndel/Xbal和BamHI/EcoRI位点之间，构建出同时含有stxl和stx2突变基因片段的重组质粒pSTX1.3-STX2.3。在构建的重组质粒pSTX1.3-STX2.3中，Stxl毒性活性区第167位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E167D)，第170位的精氨酸突变成亮氨酸(R170L);跨膜区第231位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A231D)，第234位的甘氨酸突变成谷氨酸(G234E)。Stx2毒性活性区第166位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E166D);跨膜区第219位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A219D)，第232位的甘氨酸突变成谷氨酸(G232E)。实施例2:志贺毒素(Stx)无毒性突变体的制备、筛选与鉴定将带有stxl和stx2不同突变体序列的重组质粒分别转化到大肠杆菌DH5ot感受态细胞中。由于我们克隆的Stxl和Stx2序列上游包含志贺毒素表达所需的调控序列，目的是在将毒素基因及其突变体基因转入大肠杆菌后，能利用其自身的表达调控元件来启动毒素基因或突变体基因的表达，以尽可能表达出具有天然结构的志贺毒素及其突变体，使其具有天然的构象和免疫原性。由于利用了志贺毒素自身的表达调控元件，并以大肠杆菌作为宿主，因此可与在出血性大肠杆菌中一样将所表达的毒素分泌到细菌培养液中。然后利用vero细胞作为靶细胞，检测分别携带stxl和stx2不同突变体重组菌株的细胞毒性作用。将重组菌株接种到5mLLB培养基中于37'C振荡培养过夜，然后用0.22pm滤膜过滤细菌培养物上清。以经过相同处理的DH5a培养上清滤液作为对照。将细菌培养物上清过滤后按10倍梯度稀释加入到培养好的vero细胞中，继续培养72小时。首先在显微镜下观察细胞。然后倒掉培养液，用PBS轻轻冲洗3次，在各孔中分别加入100^1结晶紫染色液常规染色并脱色(33%醋酸溶液)后，于570nm波长用酶标仪测定吸光度值，按下面公式计算细胞抑制率。抑制率=(对照组OD值一实验组OD值)/对照组OD值><100%重复实验3次后绘制出野生型Stxl、Stx2及其突变体对vero细胞生长的抑制曲线，比较不同毒素突变体对vero细胞的毒性，观察志贺毒素突变后的毒性变化。结果表明，相对于未突变的Stxl，突变体Stxl.l和Stxl.3毒性下降明显，约降低了1000倍，可以认为基本消除了细胞毒性。而相对于未突变的Stx2，突变体Stx2.1、Stx2.2和Stx2.3的毒性均有明显下降，其中Stx2.3毒性下降最大，可以认为已完全消除了细胞毒性。实施例3:出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的构建将带有己消除了毒性作用的stxl和stx2突变体序列的重组质粒pSTX1.3-8丁乂2.3转入本实验室以前构建的肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株(保藏登记号CGMCCNo.1015;中国专利号ZL03157537.4)，构建得到本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株。申请人已按照布达佩斯条约的规定，于2008年6月16日将本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登记号为CGMCCNo.2539。实施例4:出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的细胞毒性实验将EHEC0157:H7EDL933和本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的细菌培养物上清过滤后，以大肠杆菌DH5a培养上清滤液为对照，按前述细胞毒性实验方法绘制这两个菌株培养上清对vero细胞生长的抑制曲线，对这两株菌对vero细胞的毒性作用进行比较分析。结果表明，EHEC0157:H7野生型强毒菌株EDL933对vero细胞具有很强的毒性作用，本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株基本丧失了对vero细胞的毒性作用。实施例5:出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的稳定性实验将本发明的疫苗菌株在LB中连续传代培养，传代培养的过程中不使用抗生素，以检验在没有抗生素压力的情况下，重组质粒在疫苗菌株中的稳定性。每传IO代后，将传代培养物倍比稀释后铺于无抗性的LB琼脂平板上。然后从平板中挑取单个菌落，接种于加了氨苄青毒素的LB琼脂平板中，同时对每个菌落点样位置进行标记。由于丢失了重组质粒的菌株没有氨苄青毒素抗性，所以在含氨苄青毒素的LB琼脂平板上不能生长；而没丢失重组质粒的菌株则能够生长，从而得以分析重组质粒在出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株中的稳定性。每次挑取100个菌落进行接种，记录在含氨苄青毒素的LB琼脂平板上能生长的菌落数，并计算携带重组质粒的菌落的百分比。结果表明，在无抗生素压力的情况下，本发明的疫苗菌株传10代以内，具有良好的稳定性。实施例6:出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的安全性实验将14-18日龄、体重约10-12g的离乳小鼠随机分为2组。分别灌胃接种EHEC0157:H7EDL933(作为对照组)和本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株，接种剂量均为4xl09CFU/只。同时对小鼠腹腔注射丝裂霉素(2.5mg/kg体重)。每天观察并记录小鼠生长状态。结果表明，接种本发明雍苗菌株的实验组小鼠生长正常，无可见临床症状；17接种野生型强毒株0157:H7EDL933的对照组小鼠体重迅速减轻，4天内小鼠全部死亡。证实本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株丧失了对实验小鼠的致病性，具有良好的安全性。实施例7:出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株免疫后的小鼠排菌实验20只20g左右的昆明鼠，随机分为2组空白对照组(以相同剂量生理盐水进行灌胃)和本发明出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株免疫组。免疫14天后用强毒株EHEC0157:H7EDL933进行灌胃攻毒，攻毒剂量为5xl(^CFU/只。然后每天无菌采集小鼠新鲜辨便，lg粪便加入10mL生理盐水，充分振荡分散混匀，4。C静置30分钟，倍比稀释后于LB(Na150pg/mL)琼脂平板上进行菌落计数，测定并记录免疫组和对照组的平均排菌情况。结果表明，用生理盐水的未免疫对照组小鼠，直到攻毒后13天还可检测到粪便中仍然有EHEC0157:H7,EDL933，而免疫组小鼠攻毒后第6天，从粪便中即检测不到EHEC0157:H7EDL933，说明本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株免疫后，可有效缩短强毒菌株在动物肠道内的定居时间。牛、羊等反刍动物是EHEC0157的主要携带者，也是EHEC0157传播感染人类的主要传染源。因此，从流行病学角度考虑，完全可以用本发明的疫苗对这些动物进行免疫接种，以减少细菌在动物肠道内的定居数量或縮短细菌在动物肠道内的定居时间。从而可以直接在食物源头上控制EHEC0157感染的发生。实施例8:出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的被动免疫保护性实验将28g左右的母鼠40只，随机分为2组未免疫空白对照组(以相同剂量的生理盐水灌胃)和本发明疫苗菌株免疫组,(免疫剂量约l(^CFU/只小鼠)。首次免疫7天后，将公鼠与母鼠混养交配。再过7天，对母鼠加强免疫l次。第2次免疫后大约2周左右，将怀孕母鼠分笼。并对所生的7日龄乳鼠以强毒菌株EHEC0157:H7EDL933进行灌胃攻毒(剂量约5.4><108CFUAR)。记录小鼠死亡情况，评价疫苗的免疫保护效果。结果攻毒后第3天，部分乳鼠开始死亡。乳鼠存活率见表l所示，未免疫对照组母鼠所生乳鼠的存活率只有16.8%，而免疫组母鼠所生乳鼠的存活率为1883.0%。表明本发明疫苗菌株免疫母鼠后，所生的乳鼠能够从吸吮母乳时获得母源抗体，从而对乳鼠具有较好的被动免疫保护作用。表1出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株被动免疫保护性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>以上对本发明出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株的稳定性、安全性、细胞毒性和对强毒菌株在小鼠肠道定居时间的影响，以及用乳鼠进行的免疫保护性实验结果，可以充分证实，本发明的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株具有良好的稳定性、安全性和免疫原性，并具有良好的免疫保护作用，完全可以作为一种有价值的重组疫苗株。该疫苗株可被用于人出血性大肠杆菌0157感染的免疫预防，还可用于反刍动物免疫接种，以预防出血性大肠杆菌0157在反刍动物肠道内的定居和繁殖，降低细菌的环境和食品污染。序列表<110>冯书章〈120〉出血性大肠杆菌0157重组疫苗〈141〉<160>12<210>1〈211〉19〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ26)。〈400〉1'GCGTAAGGCGTCTGCTGTG<210>2<211>19〈212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ27)。<400>2CACAGCAGACGCCTTACGC<210>3<211>26<212〉腿<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ31)。<400>3CGGGATCCTTCACAAAfiCGGAGGGGA<210>4<211>26<212>腿<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ32)。〈400〉4CGGAATTCTGTATACTGCATGGTGCC20〈210〉5〈211>26<212>醒<213>人工序列<220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ34)。〈400>5CGGAATTCTGTATACTGCATGGTGCC<210>6〈211〉31〈212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ35)。<400>6GAATTCCATATGCAGTGCTGTGACGATGATG〈210〉7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ36)。〈400〉7ACTGTGACAGCTCAAGCTTTACTTTTTCGGCA<210>8<211〉32〈212〉DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ37)。<400>8TGCCGAAAAAGTAAAGCTTGAGCTGTCACAGT<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列〈220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ38)。<400〉9TAATGCCACGCTCTCGAGGATATCATTAATGCTTC<210>10<211>35<212>DNA〈213>人工序列〈220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ39L<400>10GAAGCATTAATGATATCC丁CGAGAGCGTGGCATTA〈210〉11<211>30<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ40)。<400>11TAATATATCAGACATACTGGAGACTGTGGC<210>12<211〉30<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物(FSZ41)。<400>12GCCACAGTCTCCAGTATGTCTGATATATTA权利要求1、出血性大肠杆菌O157重组疫苗菌株，特征在于该菌株是在已有的肠出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗菌株基础上，导入了定点突变后的无毒性的志贺毒素突变体基因，从而进一步加强了该疫苗菌株的免疫原性。2、根据权利要求1的重组疫肆菌株，其中所说的肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株是如中国专利号ZL03157537.4所限定的，保藏登记号为CGMCCNo.1015的疫苗菌株。3、根据权利要求1的重组疫苗菌株，其中所说的志贺毒素基因源自出血性大肠杆菌0157:H7基因组中的stx^和stx2基因。4、生产出血性大肠杆菌0157'重组疫苗的方法，该方法包括(1)扩增得到出血性大肠杆菌0157:H7的stxl和stx2全基因及其部分侧翼序列，并将扩增到的基因片段克隆到适当的载体中；(2)分别对扩增得到的stxl和stx2A亚基的基因进行点突变，并将突变后的基因克隆到载体中；(3)用步骤(2)得到的重组克隆载体转化适当的宿主细胞；(4)对步骤(3)得到的重组细胞培养物上清进行细胞毒性实验，从中筛选出丧失了细胞毒性的stxl和stx2:突变体；(5)用步骤(4)得到的丧失了细胞毒性的stxl和stx2突变体的重组质粒转化肠出血性大肠杆菌0157基因缺失疫苗菌株，得到权利要求1的疫苗菌株。5、根据权利要求4的方法，其中步骤(2)中所说的丧失了细胞毒性的Stxl突变体序列是第167位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E167D)，第170位的精氨酸突变成亮氨酸(R170L),第231位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A231D)和第234位的甘氨酸突变成谷氨酸(G234E)，并且其中所说的丧失了细胞毒性的Stx2突变体序列是第166位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E166D)，第219位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A219D)和第232位的甘氨酸突变成谷氨酸(G232E)。6、根据权利要求1的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株在生产用于预防人出血性大肠杆菌0157感染和预防出血性大肠杆菌0157在反刍动物消化道定居与繁殖的疫苗中的应用。7、含有根据权利要求1的出血性大肠杆菌0157重组疫苗菌株，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的疫苗组合物。全文摘要本发明涉及出血性大肠杆菌O157重组疫苗菌株，特别是涉及失去了致病性但保留其特异免疫原性的出血性大肠杆菌O157重组疫苗菌株。本发明进一步涉及基于所说的出血性大肠杆菌重组菌株的疫苗和疫苗组合物、其生产方法及其在预防人出血性大肠杆菌O157感染和预防出血性大肠杆菌O157在反刍动物消化道定居与繁殖中的应用。文档编号C12N1/21GK101629158SQ20081005096公开日2010年1月20日申请日期2008年7月17日优先权日2008年7月17日发明者冯书章,军刘,洋孙,郭学军申请人:冯书章