专利名称：：具有溶藻活性铜绿假单胞菌及在蓝藻水华控制中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物应用
技术领域：
，具体涉及一株具有溶藻活性的铜绿假单胞菌及其发酵液、浸膏在蓝藻水华控制中的应用。二
背景技术：
：近几年来蓝藻对湖泊水系的污染日益严重，太湖、巢湖、滇池等淡水水域都受到严重的影响，引起各级政府、环境及科技管理部门的高度重视，积极寻求治理的良方。江苏省2007年设立太湖专项研究治理太湖蓝藻、国家科技部2008年底也将蓝藻的治理列入国家重点科技发展研究项目973，投入巨资研究解决蓝藻污染的问题。目前治理蓝藻的一般思路是利用化学法、物理法、生物学方法等综合治理，其中生物方法由于具有环保、经济等优点，已受到越来越广泛的重视，利用溶藻细菌(algae-lysingbacteria)控治蓝藻是可行的生物学途径之一。溶藻细菌是以直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌统称[1]，它们是水环境生态系统的重要组成部分，对维持藻的生物量、乃至生态平衡均有着重要作用[2]，也有研究者认为水华的突然消亡可能与溶藻细菌的感染有关[3]。因此，从水华暴发水体中分离安全、有效的溶藻细菌，继而用于水污染治理的思路，已引起越来越多的关注[4]。截至目前，国内已筛选到的溶藻细菌还很有限，其中包括华南理工大学李木桂等人从广州市黄埔区某富营养化池塘中分离的两株蜡状芽孢杆菌(&w7"scere^)和一株短小芽孢杆菌[5]，南京农业大学汪辉等人[6]从青岛市黄岛边的某富营养化池塘中分离到的l株无色杆菌属(Achromobacter)的溶藻菌和东南大学赵传鹏等人[7]从太湖中分离的一株假单孢菌属的溶藻菌。但由于水体环境的复杂性，寻找更多种类适应于不同水体环境的、溶藻效果更好、可安全使用的溶藻菌仍具有重要的现实意义。参考文献(1)吴刚，席宇，赵以军.溶藻细菌研究的最新进展.环境科学研究2002,15(5):43-46(2)赵以军，刘永定.有害藻类及其微生物防治的基础一藻菌关系的研究动态.水生生物学报1996,20(2):173-181(3)RothPB,TwinerMJ，MikulskiCM，etal.Comparativeanalysisoftwoalgicidalbacteriaactiveagainsttheredtidedinoflagellate3Akre"J'aZrew's.HarmfulAlgae2008,7(5)，682—691(4)ImamuraN,MotoikeI，ShimadaN，etal.Anefficientscreeningapproachforantimicrocystiscompoundsbasedonknowledgeofaquaticmicrobialecosystem.JAntibiotics2001，54(6):582-587(5)李木桂，刘晶，潘伟斌，张海燕.3株溶藻菌生长特性研究初报.广州环境科学2007，22(2):1-3(6)汪辉，刘兆普，魏微，赵耕毛,刘兴国.一株溶藻菌的分离、鉴定及其溶藻物质的研究.中国环境科学2008,28(5):461-465(7)赵传鹏，浦跃朴，尹立红，吕锡武，李先宁.溶微囊藻菌的分离与溶藻作用.东南大学学报(自然科学版)2005,35(4):602-60
发明内容本发明主要目的是提供一种具有较强溶藻活性且安全的、使用方便的细菌以及含有该菌代谢产物的发酵液或乙酸乙酯萃取浸膏，用于控制水华蓝藻。为实现此目的，本发明采取以下技术方案，研究从太湖水中分离获得的一株具有溶藻活性的铜绿假单胞菌R219的溶藻特性，该菌株已保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2754，保藏日期为2008年11月21日。本发明的技术方案1.菌种的分离从太湖无锡水域采集水样，用査氏液体培养基富集培养，之后采用系列稀释和涂布平板法分离可培养细菌，并根据菌落特征进行菌株初步归类。2.溶藻活性筛选及溶藻方式研究将步骤l分离得到的菌株用液体LB常规培养一定时间后，取2ml带菌发酵液与10ml处于对数期生长的铜绿微囊藻培养液混合培养，根据培养液颜色的变化，筛选能使藻黄化的细菌，并初步认定为溶藻菌；之后，通过比较带菌发酵液与经过10000rpm离心10min除菌的无菌发酵液的溶藻活性，揭示活性菌株的溶藻方式；最后，比较不同菌株的溶藻活性差异，获得一株能够产生溶藻物质、且溶藻活性较高的菌株，继而进行该菌株的鉴定及溶藻特性研究。3.菌种鉴定及命名用形态观察、染色、生理生化反应、16SrRNA基因序列分析等方法对获得溶藻活性最强的一株细菌进行了鉴定，该菌的形态为长杆状，有鞭毛；能运动。染色及生化特点为革兰氏染色阴性，产蓝绿色色素，过氧化氢酶阳性，葡萄糖发酵产酸不产气，VP反应阳性，甲基红阴性，淀粉水解阳性。16SrRNA基因序列分析与铜绿假单胞菌的相似性最高，同源性达99%，故鉴定该菌株为铜绿假单胞菌，命名为铜绿假单胞菌R219。44.R219发酵液、无菌发酵液及浸膏的制备方法将纯化的铜绿假单胞菌R219接种于LB液体中常规发酵72h，取带菌发酵液，即R219发酵液；R219发酵液经10000rpm离心10min除菌，即得无菌发酵液；无菌发酵液经乙酸乙酯萃取，得到浸膏。5.R219发酵液、无菌发酵液及浸膏在水华蓝藻控制中的应用通过对铜绿假单胞菌R219发酵液、无菌发酵液及其乙酸乙酯萃取浸膏进行不同条件下的溶藻活性实验，测定溶藻效果、溶藻条件和使用剂量。6.R219发酵液、无菌发酵液的安全评价用小鼠口服急性毒性试验对R219发酵液、无菌发酵液的使用安全性进行了初步检验。本发明与现有技术相比的有益效果(1)铜绿假单胞菌R219发酵液及其乙酸乙酯萃取浸膏具有很好的溶藻活性。(2)铜绿假单胞菌R219产生的溶藻有效成分热稳定性好，其发酵液在10(TC之下处理30分钟仍有溶藻活性；浸膏分别经过25。C、45°C、65°C、85。C和100。C处理30min,溶藻活性也未受影响。(3)铜绿假单胞菌R219产生的溶藻有效成分毒性小，小鼠一次性灌胃2000mg/kg带菌发酵液和无菌发酵液，观察14天都未造成一只小鼠死亡；体增重、心、肝、脾等脏器指数及转氨酶、肌酐、尿酸等脏器损伤指标试验各组与对照组相比均无有意义的变化。(4)铜绿假单胞菌R219环境相容性好该菌来源于湖水环境又用于湖水环境，具有与湖水很好的环境相容性，其溶藻活性物质亦为天然产物，不会造成残留污染。基于上述特点，铜绿假单胞菌R219发酵液及其乙酸乙酯萃取浸膏或以它们为核心的制剂，均可以用于新型杀藻剂的商品化生产，用于湖泊水华或海洋蓝藻的控制。四图l.溶藻活性检测照片，A为不同浓度处理，B为浸膏的溶藻活性图2.R219发酵时间对发酵液溶藻活性的影响图3.R219浸膏对不同生长阶段铜绿微囊藻的溶藻活性图4.R219浸膏对不同密度铜绿微囊藻的溶藻活性图5.R219发酵液及无菌发酵液对太湖水华藻的控制作用五具体实施例方式1.菌种的分离将太湖无锡水域采集的自然水样5(Vl接种到5ml査氏液体培养基中富集培养24小时，稀释106、107、1()S后涂布LB平板，在108稀释的涂布板上根据菌落特征挑出细菌22株。2.溶藻菌的筛选及溶藻方式研究将步骤l分离得到的菌株分别用4mlLB液体培养液小量发酵，取2ml带菌发酵液加到10ml含铜绿微囊藻107个/ml的BGll培养基中，于光照培养箱中培养8天，培养条件为光暗比14:10(日夜)，温度28'C。逐日观察藻培养液颜色的变化，2d后发现培养液开始变黄，显微镜检査发现藻细胞变少。根据不同菌株发酵液使藻黄化能力的差异，发现一株编号为R219的菌株具有较强溶藻活性。进一步的研究发现，R219菌株的LB发酵液及其经0.22pm滤膜过滤除菌后的无菌发酵液具有相似的溶藻活性，表明该菌株的溶藻活性是由其分泌到胞外的代谢物质所致(图l)。3.R219菌株的鉴定从菌落及菌的形态、染色特点、生理生化反应、和16SrRNA基因序列分析等几个方面对R219进行了鉴定。菌的形态为长杆状，有鞭毛；能运动；染色及生化特点有革兰氏染色阴性，产蓝绿色色素，过氧化氢酶阳性，葡萄糖发酵产酸不产气，VP反应阳性，甲基红阴性，淀粉水解阳性；经16SrRNA基因序列分析和同源性比较，该菌与铜绿假单胞菌有99%的同源性，故鉴定该菌为为铜绿假单胞菌，命名为铜绿假单胞菌R219。4.发酵液、无菌发酵液及浸膏的制备方法先从冻存管中吸取40l铜绿假单胞菌R219的冻存液接种于4ml液体LB中(按1%接种)，于37。C、100rpm摇床培养12h制得种子液，然后将种子液按1%接种量接种到装有500mlLB的lL摇瓶中，37°C、100rpmin培养48h，制得铜绿假单胞菌R219的LB含菌发酵液；该含菌发酵液经过10000rpm离心10min后获得的上清液即为铜绿假单胞菌R219的无菌发酵液；该无菌发酵液经乙酸乙酯萃取、蒸干，即为浸膏，得率为260mg/L。5.R219发酵时间对无菌发酵液溶藻活性的影响分别于接种后培养24、48、72和96h的R219发酵液，经10000r/min离心10min后制备无菌发酵液，然后按终浓度为IO、20、40、80和100pl/ml的无菌发酵液加到培养至对数期的铜绿微囊藻培养液(藻细胞数为1.25X10Vml)中，40小时后用血球计数板计数藻细胞，并用未加发酵液而用生理盐水补够体积的藻培养液作为对照计算溶藻率，溶藻率计算方法为(对照组藻细胞数-处理组藻细胞数)/对照藻细胞数X10(F/。。结果表明，浓度对溶藻活性影响非常明显，而发酵时间对溶藻活性影响相对不明显，发酵液浓度在IO、20、40、80和100nl/ml的平均溶藻率分别为37.7%、58.4%、72.1%、78.8%和79.4%(见图2)。6.R219浸膏对不同生长阶段铜绿微囊藻的溶藻活性分别将培养2天(延滞期)、13天(对数期)和23天(稳定期)的铜绿微囊藻PCC7820细胞用BG11培养基悬浮，使藻细胞数达lX107个/ml。R219浸膏的使用浓度分别为O、1、5、10、20和40吗/ml。16h后用血球计数板计数藻并计算溶藻率。结果表明，R219浸膏对不同生长阶段的藻表现出不同的溶藻活性，对对数期和稳定期效果较好，对延滞期效果较差。譬如，浸膏浓度为5吗/ml时，溶藻率延滞期为12.4%，对数期为68.6%，稳定期为85.5%;浸膏浓度为10叫/ml时，溶藻率在3个不同时期分别为9.4%，100%和85.5%,但溶藻活性随使用浓度的提高而增加(见图3)。7.R219浸膏对不同密度铜绿微囊藻细胞的溶藻效果用少量丙酮溶解R219浸膏，使其含量达lmg/ml;吸取一定体积的浸膏丙酮溶液，加到细胞数分别为O.5X107，1X107，2X1()7的对数期铜绿微囊藻PCC7820培养液中，使其终浓度分别为O，1，5，10，20和40叫/ml，于光照培养箱中培养16h，用血球计数板计数每个处理中的藻细胞数，并计算溶藻率。结果表明，R219浸膏对不同密度藻细胞的生长均有较强的抑制活性，并表现出显著的量效关系(见图4)，在使用浓度为5、10、20和40吗/1111时的平均溶藻率分别为37.5%、75.1%、86.3%和100%。而不同密度的蓝藻对R219浸膏的敏感性没有显著差异，仅在20yg/ml时高浓度处理组表现出较强的溶藻活性。8.R219浸膏中溶藻活性物质的热稳定性R219浸膏分别于25。C、45°C、65°C、85。C和100。C处理30min，然后按浸膏终浓度10ug/ml进行溶藻试验。结果表明，R219浸膏中溶藻物质具有很好的热稳定性，同一使用浓度、不同温度处理的浸膏的溶藻活性无显著差异。9.R219发酵液及无菌发酵液对太湖水华藻的控制作用将R219培养48h的LB发酵液及无菌发酵液分别以终浓度为25、50、IOO和150u1/ml加入到太湖水华混合藻悬液中(14ml太湖水华藻和6ml水混合组成)，96h后取出2ml样品，经1200rpm离心5min弃上清而留藻；用2ml95y。乙醇溶解藻细胞24h，提取叶绿素a，并用分光光度计测定0D^和0D665，计算叶绿素a含量(计算公式12.7X0D665—2.69X0D649)，并用下面公式计算控制效果(对照组叶绿素a含量-处理组叶绿素a含量)/对照组叶绿素a含量X100。结果表明(见图5)，R219发酵液对太湖水华藻有很好的控制效果，不同浓度的发酵液或无菌发酵液对水华藻的控制效果平均为80%，既使浓度为25nl/m1,也有70%的防治效果。这一结果表明，R219发酵液可以直接用于太湖水华的控制。10.R219发酵液及无菌发酵液的安全性检验50只18-23g的健康昆明种雌小鼠，按10只一组随机分成5组，分别灌胃0.4ml生理盐水、带菌发酵液及无菌发酵液，带菌发酵液及无菌发酵液的灌服水平各有两个，一个500mg/kg体重，一个2000mg/kg体重。然后每天观察动物精神状况、采食、饮水量的变化、活动及毛发、粪便等；隔天称量体重，计算体增重；14天试验结束时摘眼球采血后处死动物解剖观察内脏病理变化及称量心、肝、脾、肾计算脏器指数，所采血分离血清化验转氨酶、肌酐、尿酸等指标。结果显示，实验全程对照与试验组均无一只小鼠死亡，试验各组小鼠未因灌服R219发酵液及无菌发酵液而引起外观、精神、采食、饮水及粪便等异常变化；体增重心、肝、脾等脏器指数及转氨酶、肌酑、尿酸等脏器损伤指标试验各组与对照组相比均无有意义的变化(表l);解剖显示，带菌发酵液组部分小鼠肺部颜色及大小表现异常，肠壁变薄、胀气；无菌发酵液组解剖肉眼未见明显病理变化。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一株具有溶藻活性的铜绿假单胞菌，其特征是用太湖自然水样在查氏培养基中富集培养后稀释涂布LB平板所得，菌的形态、生理生化特点包括长杆状，有鞭毛，能运动；革兰氏染色阴性；产蓝绿色色素；过氧化氢酶阳性，葡萄糖发酵产酸不产气，VP反应阳性，甲基红阴性，淀粉水解阳性；经16SrRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与铜绿假单胞菌有99％的同源性，故鉴定为铜绿假单胞菌，命名为铜绿假单胞菌R219，该菌种已保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2754，保藏日期为2008年11月21日；该菌种的16SrRNA基因在GenBank中的登录号为FJ472952。2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌R219的LB发酵液及离心除菌后的无菌发酵液的制备方法，其特征是将铜绿假单胞菌R219接种于pH7.O的灭菌LB液体培养基中，37°C、100rpm发酵48小时，发酵过程中不补料及调节pH;所得含菌发酵液即为铜绿假单胞菌R219的发酵液；将含菌发酵液经10000rpm离心10min取上清，即为无菌发酵液。3.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌R219的无菌发酵液的乙酸乙酯萃取浸膏的制备方法，其特征是用乙酸乙酯按与发酵液滤液2:1的比例萃取无菌发酵液，然后用旋转蒸发仪浓縮得到浸膏。4.权利要求1所述的铜绿假单胞菌R219或权利要求2所述的铜绿假单胞菌R219的含菌发酵液及无菌发酵液或权利要求3所述的铜绿假单胞菌R219无菌发酵液的乙酸乙酯萃取浸膏以及以它们为核心成分的制剂在水华蓝藻或其它藻种控制中的应用。全文摘要本发明属于微生物应用
技术领域：
，具体涉及一株具有溶藻活性的铜绿假单胞菌Z219及其发酵液和有机溶剂萃取浸膏在蓝藻水华控制中的应用。该菌是通过查氏液体培养基富集太湖水后，用涂布LB平板的方法分离并经溶藻活性检测所得，经鉴定并命名为铜绿假单胞菌R219。R219用液体LB培养后的含菌发酵液及离心除菌后的无菌发酵液均具有较强的溶藻活性，其中无菌发酵液对处于对数期生长的铜绿微囊藻以及太湖水华藻有显著的溶藻作用。R219发酵液的溶藻活性成分可以用乙酸乙酯萃取所得，萃取物呈黄褐色粘稠状物质，即浸膏。当浸膏使用浓度大于5μg/ml，就能有效抑制铜绿微囊藻的生长。R219及其发酵液和乙酸乙酯萃取浸膏均可用于水华蓝藻或其它藻种的控制。文档编号C12N1/20GK101481670SQ20091002816公开日2009年7月15日申请日期2009年1月20日优先权日2009年1月20日公开号200910028165.9发明者任洪芹,刘常宏,双惊雷,平张,张新燕,王秋硕,薛雅蓉申请人:南京大学被以下专利引用(1),