铂类药物疗效相关基因snp检测特异性序列、液相芯片及检测方法

专利名称：：铂类药物疗效相关基因snp检测特异性序列、液相芯片及检测方法
技术领域：
：本发明属丁分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及铂类药物疗效相关基因ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1的SNP检测的特异性序列、液相芯片及其检测方法。
背景技术：
：自从1967年顺铂的抗癌活性被发现以来，铂类抗癌药物的研究和应用得到了迅速的发展。目前已发展出以卡铂为代表的第二代，和以奥沙利铂为代表的第三代铂类药物。铂类是目前常用的广谱抗肿瘤药，已成为癌症化疗中不可缺少的药物。铂类药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要是消化系统毒性，常见为恶心、呕吐，还可有肾毒性、肝毒性和骨髓抑制，耳毒性和神经毒性较轻。铀类药物的抗肿瘤作用是通过作用于DNA，形成Pt-DNA结合物，导致DNA的链内和链间交联，从而抑制DNA的合成及复制。大量的临床研究已经证实，铂类药物的疗效/毒副作用与患者体内四个基因的单核苷酸多态性(SNP)关系密切，艮卩ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1。ERCC1和ERCC2都是DNA核苷酸切除修复途径的关键基因，XRCC1是DNA碱基切除修复途径中的重要因子。GSTP1是一种谷胱甘肽S转移酶，它通过将有毒物质的亲电子基团与谷胱甘肽结合，起到保护细胞大分子的作用。这四个基因通过参与DNA修复等生理过程，使受铂类化合物破坏的DNA回复正常或使DNA免受破坏，在肿瘤细胞中造成耐药，而在正常细胞中则能够减少毒副作用。因此，专家推荐患者在接受铂类化疗之前，进行相关的基因SNP5检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案。这样将明显提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。大量临床研究显示，最常见的造成这四个基因功能减弱的多态性位点分别是ERCC1的C19007T和C8092A，ERCC2的A2282C，XRCC1的G1301A，以及GSTP1的A1578G。在中国人群中，ERCC1-C19007T、ERCC卜C8092A、ERCC2-A2282C和XRCC1-G1301A的基因分布频率分别约为21%、24%、5%和30%;GSTP1-A1578G基因分布频率约2P/。。大量研究表明，在ERCC1、ERCC2、XRCC1这三个基因中携有一个或以上功能减弱等位基因型的患者，在接受铂类化疗时，发生毒副作用的几率明显升高，以致治疗效果较差。而GSTP1-A1578G基因多态性位点的情况正好相反，遗传基因型为GA或GG的患者，在接受铂类化疗时，对铂类药物的反应率较高、有较好的疗效。因此，通过对这五个常见功能SNP位点进行检测，根据患者的基因型判断是否采用铂类药物或制定个体化用药方式，将能明显提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。目前已建立了若干以PCR为基础的检测基因单核苷酸多态性(SNP)的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR—单链构象多态性分析(SSCP)检测，以上技术具有灵敏度低，样品易污染、假阳性率高等缺点。普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应一限制性片段长度多态(PCR—RFLP)分析技术和基于T叫Man技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种SNP位点的检测，耗时费力；传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检6测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用x-Taq液相芯片技术可以同时检测多个SNP位点，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容本发明的目的之一是提供与铂类药物疗效密切相关的ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测以下5个常见的SNP位点ERCC1的C19007T和C8092A，ERCC2的A2282C，XRCC1的G1301A，以及GSTP1的A1578G。一种铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，包括有1.针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物对，每种ASPE引物由3，端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5'端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对分别选自SEQIDNO.l及SEQIDN0.2、SEQIDN0.3及SEQIDN0.4、SEQIDN0.5及SEQIDN0.6、SEQIDN0.7及SEQIDN0.8、禾口/或SEQIDN0.9及SEQIDNO.10;2.分别包被有特异的anti-tag序列l的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列选自SEQIDN0.11SEQIDNO.20中的序列；优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；3.针对ERCC1基因的C19007T、ERCC1基因的C8092A、ERCC2基因的A2282C、XRCC1基因的G1301A、禾B/或GSTP1基因的A1578GSNP位点的目标序列的扩增引物。优选地，分别扩增出五个具有SNP位点的目标序列的引物选自SEQIDNO.21SEQIDNO.30中的序列，即针对C19007T的SEQIDN0.21和SEQIDN0.22,针对C8092A的SEQIDNO.23和SEQIDN0.24,针对A2282C的SEQIDN0.25和SEQIDNO.26,针对G1301A的SEQIDN0.27和SEQIDN0.28,针对A1578G的SEQIDN0.29和SEQIDNO.30。本发明的另一目的是提供用于铂类药物疗效相关基因SNP检测的特异性序列，该序列特性强，能准确区分SNP的各种基因型。所述特异性序列为针对ERCC1基因的C19007T的SNP位点的SEQIDN0.31及SEQIDN0.32、针对ERCC1基因的C8092A的SNP位点的SEQIDN0.33及SEQIDNO.34、针对ERCC2基因的A2282C的SNP位点的SEQIDN0.35及SEQIDN0.36、针对XRCC1基因的G1301A的SNP位点的SEQIDN0.37及SEQIDN0.38、禾卩/或针对GSTPl基因的A1578G的SNP位点的SEQIDN0.39及SEQIDNO.40。本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1基因SNP位点进行检测的方法。一种使用上述液相芯片对铂类药物疗效相关基因SNP检测的方法，主要包括以下步骤8(一)PCR扩增待测样品DNA;(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；(六)通过荧光检测仪检测。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分SNP的各种基因型。3.使用本发明所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片的检测方法步骤简单，可通过一步多重PCR即可完成五个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。具体实施例方式实施例l铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片试剂盒，主要包括有.-一、特异性引物序列(ASPE引物)针对铂类药物疗效相关基因的各5个常见SNP位点分别设计特异性的引物序列。ASPE引物由Tag十特异性引物序列组成。ASPE引物序列如下表所示表lASPE引物序列(Tag+特异引物)SEQNO.基因位点类型ASPE引物Tag特异性序列1ERCC1C19007TCl卯07T-w(野生型)5'TAACATTACAACTATACTATCTACACTGAAGTTCGTGCGCAAC3'(SEQN0.31)2C19007T-m(突变型)5'TCATTTACCAATCTTTCTTTATACACTGAAGTTCGTGCGCAAT3'(SEQN0.32)3C8092AC8092A-w(野生型)5TCATTCATATACATACCAATTCATGGACAAGAAGCGGAAGC3'(SEQN0.33)4C8092A-m(突变型)5TTACTACACAATATACTCATCAATGGACAAGAAGCGGAAGA3'(SEQN0.34)ERCC2A2282CA2282C-w(野生型)5TTACTTCACTTTCTATTTACAATCGCAATCTGCTCTATCCTCTT3'(SEQN0.35)6A2282C-m5'TACACAATCTTTTCATTACGCAATCTGCTCTATCCT10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>每条ASPE引物包括两个部分，5'端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3'端为突变型或野牛型特异的引物片段(如表l所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条ASPE弓I物分别用1Ommol/LTrisBnffer酉己制成100pmol/mL的贝亡存液。二、anti-tag序列包被的微球根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，与选择的十种tag序列相应的微球上的anti-tag序列如表2所示<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>选择的十种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5—1O个T的间隔臂序，即在每个anti-tag序列前加上一段5—1O个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工稃技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH20配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下分别取5xl06个上述编号的羧基化的微球悬浮于50u0.mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再孵育30分钟。反应结束后，用0.02%的Tween-20洗涤一次，再用O.lV。的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0),1mmol/LEDTA]中，2-8'C避光保存。三、扩增出具有SNP位点的冃标序列的引物目标检测的5种常见SNP位点ERCC1的C19007T、C8092A，ERCC2的A2282C，XRCC1的G1301A，以及GSTP1的A1578G都在不同的基因或外显子上。利用Pnmer5.0设计五对引物(见表3)，分别扩增出五条具有SNP位点的目标序列。表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物SEQNO.基因位点类型扩增引物21ERCCL—C19007TC19007T-Forward5'ATCAAGGG丁CATCCCTATTGA3'22C1卯07T-Reverse5'AGAGGCTTCTCATAGAACAGT3'23C8092AC8092A-Forward5'AACAGCTCCTTTAATGACTGG3'24C8092A-Reverse5'AAAACAGCAAGATGCCACAGT3'25ERCC2XRCC1A2282CA2282C層For丽d5'ATCTTATGT丁GACAGGGATGG3'26A2282C-Reverse5'AGCTTCTTGGGAACAGTGCA3'27G1301AG1301A-Forward5,TTTCTCCCACCTCAATCTCAT3'28G1301A-Reverse5'ATTGCCCAGCACAGGATAAG3'29GSTP1A1578GA1578G-Forward5'CTGGTGGACATGGTGAATGA3'30A1578G-Reverse5'AACTGGCGACAAATCCTCCT3'所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTrisBuffer酉fi制成100pmol/mL的贝亡存液。实施例2运用铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片对临床样本的检测所述各种溶液的配方如下50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):试剂来源终浓度每250ml的用量MES(2[N-Morpholino]SigmaM-29330.05M2.44g13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>过滤后贮存于4'C。ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。一、样本的DNA提取参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA.二、待测样品的PCR扩增利用Primer5.0设计五对引物，多重PCR—步扩增出ERCC13'UTR和外显子4、ERCC2夕卜显子23、XRCC1外显子10和GSTP1外显子5共五条具有SNP位点的目标序列，产物大小分别为638bp、250bp、507bp、295bp和399bp。引物序列(SEQNO.21-30)见上述表3所示。首先配制多重PCR引物工作液分别各取SEQNO.21-30的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下10x缓冲液(含Mg")5uldNTP(各2.5mmoI/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各20pmol/mL)10ul模板DNA(10ng/ul)1ulddH2029.5ul共50ulPCR扩增程序为:95°C3min;94°C20s，56°C30s，72°C30s，30个循环;72°ClOmin;4'C保存。三、PCR产物的酶切处理参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细歩骤如下1.取7.5ulPCR反应后的产物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37。C孵育15min。8(TC孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。首先配制混合的ASPE引物工作液分别各取C19007T-w、C19007T-m、C8092A-w、C8092A-m、A2282C-w、A2282C-m、G1301A-w、G1301A-m、A1578G-w和A1578G-m相应的ASPE引物贝i存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/LTrisBuffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下10x缓冲液2ul15MgCl2(50mmol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)1ulTsp酶(5U/uI)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500腿ol/L)1ul酶切处理的PCR扩增产物5ulddH2010ul共20ulPCR程序为96'C2min;94°C30s，58°Clmin,72°C2mhi，30个循环4'C保存。五、杂交反应1.根据设计的ASPE引物，选择上述-1种微球(微球浓度均为2.5xl(^个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE弓I物5'端加tag序列特异结合；2.分别取lul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；3.微球于^10000g离心l-2min;4.弃去上清，微球重悬于100ul的2xTm杂交缓冲液中，涡旋混匀；5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH20;6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul;7.95。C解链60s，37°C杂交15min;8.杂交后的微球于^3000g离心2—5min;169.去上淸，将微球重悬于75ul的lxTm杂交缓冲液中；微球于^3000g离心2—5min;11将微球重悬于75ul的lx'Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE);12.37'C孵育15min，于Luminex仪器上检测。六、结果检测与数据分析反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至IOO种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Lummex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10xPCR阴性对照MFI;2.NETMFI-样品MFI—PCR阴性对照MFI(NETMFI小于O的以O表示)；3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值突变比值=突变型NETMFI—(突变型NETMFI+野生型NETMFI)4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(ciit-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。使用本方法检测20份样本的ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1基因SNP，实验数据符合17上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(CUt-Off值)的设置如下突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子30%-70%视为杂合子；80%-100%视为突变型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的铂类药物疗效相关基因突变型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的铂类药物疔效相关基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1基因SNP类型，且结果稳定可靠。表4样本检测结果(MFI)序号NO.C19007T-wC19007T-mC8092A-wC8092A-mA2282C-、vA2282C-mG1301A-wG1301A-mA1578G-wA1578G-m阴性对照8132061311162157S28921614853229841826—3721273281558615417674033382630152831301164167212518462487212003124495561832901235535366333318710142213458943133316634587555573618241839341816302428231832471611222635611724871827512729733481642177568481456822472922312891552168137731889183188342878241018%202847112531127441821841611125315844789178927267516236512122648353518152521543485112667171321532633941713052925331723331114806952138111782781438221977101518%21294513984461006281970241611021576572314382713463461553718<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表5样本基闪型分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>序列表<110〉广州益善生物技术有限公司<120>铂类药物疗效相关基因SNP检测的特异性序列、液相芯片及其检测方法〈160>40<170>Patentlnversion3.1〈210〉1<211>43〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>1taacattacaactatactatctacactgaagttcgtgcgcaac43〈210〉2〈211>43〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉2tcatttaccaatctttctttatacactgaagttcgtgcgcaat43〈210〉3〈211>41〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉3tcattcatat3c3taccaattcstggacaag33gcgg3agc41〈210〉4〈211〉41〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉4tt3ct3cac33t由ctc3tC33tggaceiagaagcggaag341〈210〉5〈211〉44〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>5ttacttcactttctatttacaatcgcaatctgctctatcctctt44〈210〉6〈211〉44〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉6tacacaatcttttcattacatcatgcaatctgctctatcctctg44〈210〉7〈211〉43〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉7taattatacatctcatcttctacacgtgtgaggccttacctec43〈210〉8〈211〉43〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉8cttttcatcaataatcttacctttcgtgtgaggccttacctct43<210〉9〈211〉43〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉9ctactaattcattaacattactacgacctccgctgcaaataca43〈210〉1023〈211〉43<212〉DNA<213>人工序列<400>10tcaatcaattacttactcaaatacgacctccgctgcaaatacg43〈210〉11<211〉24〈212〉DNA〈213>人工序列<400>11gtagatagtatsgttgt33tgtts〈210〉12〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉12gt3t333gaa3g3ttggt333tg32424〈210〉13〈211〉24〈212〉腿<213>人工序列〈400〉13atgaattggtatgtatatgaatga〈210〉14〈211〉24<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉14attgatgagtatattgtgtagtaa<210〉15〈211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉15gattgtaaatagaaagtgaagtaa<210〉16〈211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列<400>16atgatgtaatgsssagsttgtgta24242424<210>17〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>17tgtagaagatgagatgtataatta〈210〉18〈211〉24〈212〉腿〈213〉人工序列<400〉18aaaggtaagattattgatga犯3g〈210〉19〈211〉24〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉19gtagtaatgttaatgaattagtag〈210〉20〈211〉24<212〉DNA24242426〈213〉人工序列〈400>20gtatttgsgt33gta3ttg3ttg324〈210〉21〈211〉21<212>腿〈213〉人工序列〈400〉21atcaagggtcatccctattga21〈210〉22〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉22agaggCttctC3t3g33C3gt〈210〉23<211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉23aacagctcctttastgactgg<210〉24<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉24aaaacagcaagatgccacagt21〈210〉25<211>21〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉25atcttatgttgacagggstgg〈210〉26〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列〈400>26agcttcttgggaacagtgca<210>27<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉27tttctcccacctcaatctcat〈210〉28〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉28attgcccagc3c3gg3t33g〈210〉29〈211〉20〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉29Ctggtgg3C3tggtg33tg3〈210〉30〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉30aactggcgacaaatcctcct2120202029<210>31〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉31actg3agttcgtgcgc3ac19〈210>32<211〉19<212>DNA〈213>人工序列〈400>32actgaagttcgtgcgcaat19〈210〉33〈211〉17<212>DNA〈213〉人工序列〈400>33gg3C3卿3gCgg33gC<210>34〈211〉17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉34ggac3,3gcgg3aga17〈210>35〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉35gcaatctgctctatcctctt20〈210〉36〈211〉20〈212〉DNA<213>人工序列〈400>36gcaatctgctctatcctctg〈210>37<211〉19<212〉DNA〈213>人工序列〈400〉37cgtgtgaggccttacctcc〈210〉38〈211〉19〈212>DNA<213>人工序列〈400〉38cgtgtgaggccttacctct19<210>39〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉39gacctccgctgcaaataca19〈210〉40〈211〉19〈212〉腿<213〉人工序列〈400〉40gacctccgctgcaaatacg权利要求1.一种铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(1).针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物对，每种ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对分别选自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、和/或SEQIDNO.9及SEQIDNO.10；(2).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的序列；(3).针对ERCC1基因的C19007T、ERCC1基因的C8092A、ERCC2基因的A2282C、XRCC1基因的G1301A、和/或GSTP1基因的A1578GSNP位点的目标序列的扩增引物。2.根据权利要求1所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，(3)中所述引物为针对C19007T的SEQIDN0.21及SEQIDN0.22，针对C8092A的SEQIDN0.23及SEQIDN0.24,针对A2282C的SEQIDN0.25及SEQIDNO.26,针对G1301A的SEQIDN0.27及SEQIDN0.2S，禾口/或针对A1578G的SEQIDNO,29及SEQIDNO.30。3.根据权利要求1所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，(2)中所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。4.根据权利要求3所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5—10个T。5.根据权利要求1-3任一项所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(1).5对针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物，每种ASPE引物由3'端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5，端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对为SEQIDN0.1及SEQIDN0.2、SEQIDN0.3及SEQIDN0.4、SEQIDNO,5及SEQIDN0.6、SEQIDNO,7及SEQIDN0.8、禾口SEQIDNO.9及SEQIDNO.10;(2).分别包被有特异的anti-tag序列的10种微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列选自SEQIDN0.11SEQIDNO.20中的序列；(3).扩增出具有C19007T、C8092A、A2282C、G1301A、和A1578GSNP位点的目标序列的引物对，为:SEQIDN0.2及SEQIDN0.22，SEQIDN0.23及SEQIDN0.24,SEQIDN0.25及SEQIDN0.26，SEQIDN0.27及SEQIDN0.28,禾口SEQIDN0.29及SEQIDN0.30。6.—种对铂类药物疗效相关基因SNP检测的方法，其特征是，使用权利要求l所述的液相芯片，主要包括以下步骤(一)PCR扩增待测样品DNA;(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；(六)通过荧光检测仪检测。7.—种用于铂类药物疗效相关基因SNP检测的特异性序列，其特征是，所述特异性序列为针对ERCCl基因的C19007T的SNP位点的SEQIDNO.31及SEQIDNO.32、针对ERCC1基因的C8092A的SNP位点的SEQIDN0.33及SEQIDNO,34、针对ERCC2基因的A2282C的SNP位点的SEQIDN0.35及SEQIDN0.36、针对XRCC1基因的G1301A的SNP位点的SEQIDN0.37及SEQIDN0.38、禾口/或针对GSTPl基因的A1578G的SNP位点的SEQIDN0.39及SEQIDN0.4Q。全文摘要本发明公开了一种铂类药物疗效相关基因SNP检测特异性序列、液相芯片及检测方法，所述液相芯片主要包括有选自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、和/或SEQIDNO.9及SEQIDNO.10的野生型及突变型特异性ASPE引物对；分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的序列；扩增SNP位点的目标序列的引物。本发明所述检测液相芯片及检测方法的检测灵敏度高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。文档编号C12N15/11GK101580875SQ20091004009公开日2009年11月18日申请日期2009年6月9日优先权日2009年6月9日发明者何嘉英,杨惠夷,许嘉森申请人:广州益善生物技术有限公司