专利名称：一种克隆山羊pid1基因编码区全序列的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种克隆山羊磷酸酪氨酸互作结构域I (Phosphotyrosine interactiondomain containing 1，PID1)基因编码区全序列的方法。
背景技术：
磷酸酪氨酸互作结构域(PIDl)是以抑制性消减杂交(Suppressionsubtractivehybridization, SSH)技术筛选肥胖与正常人腹膜后脂肪组织中的差异表达基因，研究人员曾按其工作単位和姓氏的首个英文字母将该基因命名为NYGGF4基因，提交NCBI后，根据该基因的结构特征被国际统一命名为PIDl基因。该基因有ー个PTB(磷酸酪氨酸作用位点)结构域，与信号蛋白Shc上的PTB结构域相似，參与生长因子刺激下细胞增 殖等下游效应。PIDl基因在3T3-L1脂肪细胞中过表达能够显著下调脂肪细胞胰岛素信号途径中与胞膜葡萄糖转运密切相关的基因-葡萄糖转运子4 (GLUT4)的表达，从而推测PIDl基因可能參与了多种组织的胰岛素敏感性调节，而脂肪细胞胰岛素敏感性的高低与脂肪沉积密切相关，研究发现PIDl基因过表达通过下调胰岛素刺激的GLUT4的转位而減少脂肪细胞的葡萄糖摄取率，其机制与抑制PI3K/AKT信号通路、减少GLUT4向胞膜转位有夫，推断它的过量表达可能促进了脂肪细胞的増殖，并抑制了葡萄糖的转换，进而影响机体的胰岛素敏感性，导致脂肪的沉积，山羊肌内脂肪的含量对羊肉品质具有直接影响，研究该基因的作用和功能将对动物遗传改良和培育新品系提供理论基础。RT-PCR克隆是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技木。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因中，然后用质粒PCR产物测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这ー技术很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难于得到的PCR产物；克隆载体PCR测序能克服PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE (cNDA末端快速扩增)技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本低，工作量小。该技术成功的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计上游引物，在終止密码子的下游设计下游引物，使得PCR产物包含完整的基因编码区全序列。分段PCR克隆法将目的基因分成几段来分别克隆，然后做亚克隆测序拼接。成本高，工作量大耗吋，ー个基因分成几段就需要做几次克隆，然后再做序列接拼。现有技术中采用RACE (cNDA末端快速扩增)技术是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。I、目的PCR产物的基因片段长度不明确。2、试验成本高。3、工作量大，实验技术要求高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快捷的获取山羊PIDl基因的完整编码区序列的方法，填补了该基因在山羊上的空白。
本发明采用以下技术方案一种克隆山羊PIDl基因编码区全序列的方法，包括以下步骤Al、提取山羊腹肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；A2、引物的设计及PCR反应以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物；设计的引物为上游引物P 1:5' -CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3'下游引物P 2:5' -TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3'用cDNA为模板进行梯度PCR操作确定普通PCR的扩增条件，温度为范围在50°C到65°C之间的8个温度点.PCR反应体系为IOul体系(5 μ L的2 XMaster Mix Tap,上下游引物各O. 5 μ L，2 μ L的cDNA，2 μ L的ddH20.)，反应条件为95°C预变性5min，38个循环(94°C, 30s ；61°C,40s ;72°C，40s)，最后 72°C 7min ；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。所述的方法，所述步骤Al包括以下步骤用液氮将眼肌磨成粉末装入I. 5mE管，放入_80°C的超低温冰箱中备用；取新的I. 5ml的EP管，加入Iml的Trizol液，然后加入约80mg的眼肌组织粉末，用手摇晃混匀后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置5分钟；加入O. 2ml的氯仿，盖紧离心管，4°C下13000rpm离心8分钟，取上层水相于一新的离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置5分钟，4°C下12000rpm离心10分钟；弃去上清液,加入Iml的75 %こ醇混匀，4°C下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，然后用移液枪吸干管壁上多余的こ醇，加入30ul到IOOul的DEPC水；琼脂糖凝胶检测RNA的质量，将效果好的RNA立即反转录成cDNA。所述的方法，所述步骤A3包括以下步骤a.将60μ I PCR产物于I %的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手木刀割下所要回收的DNA的琼脂块，放入I. 5ml离心管称取重量。b.按每O. I克胶块加入300 μ I溶胶液；于50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转EP管，以确定胶块充分溶解；c.溶解后的凝胶溶液加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12000r/min离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；d.向吸附柱加入700 μ I漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱
重新放入收集管中；e.向吸附柱加入500 μ I漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液；将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一歩的试验；f.将吸附柱置于另ー个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30uL洗脱液，室温放置2min, 12000r/min离心Imin收集DNA溶液；g.取2uL回收产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度；所述的方法，所述步骤A3包括以下步骤(I)目的片段与载体连接将回收、检测后的目的片段与PMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD_18T载体试剂盒使用说明书，操作连接体系为
PMD-18T Vector0.5 μ L
纯化回后的PCR片段5UL
Solution I4.5 μ L
Total10.0 μ L以上操作在冰上进行，稍离心混匀，16°C在PCR仪中连接12h，_20°C保存备用；(2)大肠杆菌感受态细胞的制备a.从无抗生素平板上挑取新鲜的E. coli JM109单菌落结种于10ml LB液体培养基中，37°C，250r/min摇菌培养过夜；b.取2ml活化过夜的菌液接种于含50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37°C，250r/min摇菌培养至0D_ = 0. 3 ；c.将细菌培养物无菌操作下转移至50ml EP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min离心IOmin,弃上清,收集菌体沉淀；d.加入20ml冰预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次4°C 4000r/min离心lOmin，弃上清，收集菌体沉淀；e.加入2ml冰预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置过夜；f.按200ul/份加入15%冰预冷甘油，混匀分装，_70°C冻存备用；(3)连接产物的转化a.吸取IOul连接物介入冰预冷的I. 5ml EP管中，再取出_70°C冻存的E. coli感受态细胞置于冰上融化，轻弹管壁使细胞混匀；b.小心吸取100 μ I细胞悬液加入到含有连接产物的EP管中，轻弹管壁，混匀后冰浴 30min ；c. 42°C水浴热激90sec,立即冰浴3min ；d.加入500 μ I预热至37°C的LB液体培养基，37°C，250r/min摇菌培养45min ；e.吸取200 μ I菌液,用灭菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固体培养基平板上,室温温浴至完全吸收，37°C培养箱中倒置过夜培养；(4)阳性菌落的筛选随机挑选菌落接种于LB氨节培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，用于相应基因PCR扩增相同的引物及反应条件进行扩増。扩增产物用I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为所克隆基因后，取20 μ I交送北京六合华大生物工程技术有限公司完成测序。该技术相比较分段克隆和RACE技术而言，目的PCR片段的长短大致明确，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的优势。
图1是山羊mi基因的PCR产物电泳图。图2是PIDl基因mRNA在不同组织中的表达情况；y轴表示的是相对表达量，x轴表示的是组织。图3是western bloting检测PIDl基因推测编码的蛋白在不同组织中的表达情况；1_8表示的是心、肝、脾、肺、肾、腿肌、腹肌和背最长肌。
具体实施例方式以下结合具体实施 例，对本发明进行详细说明。实施例I步骤ー提取山羊眼肌组织中的总RNA(核糖核酸)，然后将总RNA反转录成cDNA ；I.组织的采集选取周岁的天府肉羊颈动脉放血后立即取约Ig腹肌放入液氮罐中用于提取总RNA。2. RNA的制备及cDNA的合成在实验室用液氮将腹肌磨成粉末装入I. 5ml的EP管。放入零下80°C的超低温冰箱中备用。取新的I. 5ml的EP管，加入Iml的Trizol液，然后加入约80mg的眼肌组织粉末。
用手摇晃混匀后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置5分钟。4°C下13000rpm离心3分钟将液体用移液枪转运到另ー个新的I. 5ml的EP管，并往这个新EP管中加入O. 2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，然后4°C下13000rpm离心8分钟。离心结束以后用移液枪将这个EP管中的上层水相约移入一新的离心管,加入等体积的异丙醇,室温放置10分钟，4°C下12000rpm离心10分钟。弃去上清液，加入Iml的75%こ醇混匀，4°C下7500g离心5分钟。小心弃去上清液，然后用移液枪吸干管壁上多余的こ醇，注意不要把RNA吸掉，然后根据RNA量的多少。加入适量的DEPC水。用I. 5%琼脂糖电泳法检测RNA的质量。将效果好的RNA立即反转录成cDNA。步骤ニ引物的设计及PCR反应；依据已发表的牛、猪、人、小鼠等的PIDl基因的序列设计保守引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在終止密码子的下游区域设计。设计的引物为上游引物Pl :5' -CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3' (SEQIDN0:1)下游引物P2:5' -TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3' (SEQID NO 2)用cDNA为模板进行PCR操作扩增PIDl基因，退火温度为61 °C。PCR反应体系为 IOul 体系(5μ L 的 2XMaster Mix Tap，上下游引物各(λ 5 μ L，2 μ L 的 cDNA，2 μ L 的ddH20.)，反应条件为 95°C 预变性 5min，38 个循环(94 °C, 30 s ；61°C,40s ;72C，40s)，最后72°C 7min。反应结束后将约有896bp的PCR产物收集到ー个EP管中并切胶回收(图1)，将回收的基因片段克隆到质粒载体中，然后挑取阳性菌进行PCR反应，产物送测序公司测序。步骤三PCR产物的回收和纯化；PCR产物OMEGA公司纯化回收试剂盒Gel Extraction Mini Kit回收PCR产物，具体操作步骤为a.将60 μ I PCR产物于I %的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手木刀割下所要回收的DNA的琼脂块，放入I. 5ml离心管称取重量。在判定DNA片断位置吋，要尽可能使用长波及外线，而且还要注意在紫外光下照射的时间应尽可能的短。b.按每O. I克胶块加入200 μ I溶胶液。于50°C水浴放置，并不断温和地上下翻
转EP管，到凝胶完全凝固为止。c.溶解后的凝胶加入带有吸附柱的收集管中，12000r/min离心30sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。 d.向吸附柱加入700 μ I漂洗液PW(含无水こ醇),12000r/min离心30sec,倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。e.向吸附柱加入500 μ I漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一歩的试验。f.将吸附柱置于另ー个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30uL洗脱液，室温放置2min，12000r/min离心Imin收集DNA溶液。g.取2uL回收产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度。步骤四克隆；(I)目的片段与载体连接将回收、检测后的目的片段与PMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD_18T载体试
剂盒使用说明书，操作连接体系为
PMD-18T Vector0.5 μ L
纯化回后的PCR片段5UL
Solution I4.5 μ L
Total10.0 μ L以上操作在冰上进行，稍离心混匀，16°C在PCR仪中连接12h，_20°C保存备用。(2)大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)a.从无抗生素平板上挑取新鲜的E. coli JM109单菌落结种于10ml LB液体培养基中，37°C，250r/min摇菌培养过夜。b.取2ml活化过夜的菌液接种于含50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37°C，250r/min摇菌培养至OD600 = 0 . 3。c.将细菌培养物无菌操作下转移至50ml EP管中，冰浴lOmin,然后4°C 4000r/min离心lOmin,弃上清,收集菌体沉淀。d.加入20ml冰预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次4で4000r/min离心IOmin,弃上清,收集菌体沉淀。e.加入2ml冰预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置过夜。f.按200ul/份加入15%冰预冷甘油，混匀分装，_70°C冻存备用。(3)连接产物的转化a.吸取IOul连接物介入冰预冷的I. 5ml EP管中，再取出_70°C冻存的E. coli感受态细胞置于冰上融化，轻弹管壁使细胞混匀。
b.小心吸取100 μ I细胞悬液加入到含有连接产物的EP管中，轻弹管壁，混匀后冰浴 30min。c. 42°C水浴热激90sec,立即冰浴3min。d.加入500 μ I预热至37°C的LB液体培养基，37°C，250r/min摇菌培养45min。e.吸取200 μ I菌液,用灭菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固体培养基平板上,室温温浴至完全吸收，37°C培养箱中倒置过夜培养。(4)阳性菌落的筛选随机挑选菌落接种于LB氨苄培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，用于相应基因PCR扩增相同的引物及反应条件进行扩増。扩增产物用I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为所克隆基因后，取20 μ I交送宝生物工程技术有限公司完成测序。步骤五检验试验的正确性；将测序结果在NCBI上运用blast在线比对软件以验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法获得的山羊PIDl基因完整编码区序列的核苷酸序列与其他已知的9种哺乳动物的同源性为76% 97%。表明该方法能达到获得山羊PIDl基因的完整编码区序列的目的。获得的山羊PIDl基因序列为(SEQID NO 3)山羊PIDl基因预测编码的氨基酸序列为(SEQ ID NO 4)本技术简单、快捷的获取了山羊PIDl基因的完整编码区序列，填补了该基因在山羊上的空白。该技术相比较分段克隆和RACE技术而言，目的PCR片段的长短大致明确，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的优势。实施例2实时荧光定量PCR(I)PIDl和GAPDH基因实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序如下表2-5PCR 反应体系 Table. 2_5Reaction system of PCR
上游引物0.5 μ I
下游引物0.5 μ I
SYBR Premix Ex Taq (2 X )12.5 μ I
模版 cDNA2 μ I (IdH2O9.5 μ I Total25 μ I
PIDl和GAPDH基因实时荧光定量PCR的反应条件95°C预变性IOsec — 45个循环(95°C变性 IOs — 61°C退火 30s)。反应体系在伯乐iq5荧光定量PCR仪上进行。在PCR反应过程中，设定无cDNA样品的空白管作为阴性对照。
(2)标准曲线的绘制取103、104、105、106、107、108、109、101Q的标准品各I μ I加入和上面完全相同的反
应体系中，在同样的反应条件下进行PCR扩增。根据荧光定量PCR仪绘制的PCR动力学曲线，以样品拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，分别拟合PID1、GAPDH基因的PCR标准曲线。(3) PIDl基因mRNA表达水平计算利用荧光定量PCR分别检测出目的基因MPIDl和管家基因GAPDH的Ct值后，可计算出目的基因与管家基因的相对表达量。相同组织不同时间的天府肉羊PIDl基因的相对表达设成年羊的表达量为对照，相同时间不同组织的天府肉羊PIDl基因的相对表达设各年龄阶段背最长肌的表达量为对照。不同品种羊PIDl基因的相对表达设天府肉羊的表达量为对照。计算公式如下
权利要求
1.一种克隆山羊PIDl基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤Al、从健康的山羊腹肌组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；A2、引物的设计及PCR反应以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物；设计的引物为上游引物 PI : 5' -CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3'下游引物 P2 :5' -TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3'用cDNA为模板进行梯度PCR，优化PIDl基因普通PCR的条件，温度为范围在50°C到 65°C之间的8个温度点。PCR反应体系为IOul体系(5 μ L的2 XMaster Mix Tap，上下游引物各O. 5 μ L，2 μ L的cDNA, 2 μ L的ddH20.)，反应条件为95°C预变性5min, 38个循环(94°C， 30s ；61°C,40s ;72°C，40s)，最后 72°C 7min ；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤Al包括以下步骤用液氮将腹肌磨成粉末装入I. 5ml的EP管，放入_80°C的超低温冰箱中备用；取新的I. 5ml的EP管， 加入Iml的Trizol液，然后加入约SOmg的眼肌组织粉末，用手摇晃混匀后，用震荡仪震荡约30秒后冰上放置5分钟；加入O. 2ml的氯仿，盖紧离心管，4°C下13000rpm离心8分钟， 取上层水相于一新的离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置5分钟，4°C下12000rpm离心 10分钟；弃去上清液，加入Iml的75%乙醇漂洗RNA中混合的杂质，4°C下7500g离心5分钟；小心弃去上清液,瞬时尚心后小心倒置EP管用移液枪引导管内液体流出，尽量吸干，加入适量的DEPC水；琼脂糖凝胶检测RNA的质量，将效果好的RNA立即反转录成cDNA。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤A3包括以下步骤a.将60μ1PCR产物于I %的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手术刀割下所要回收的 DNA的琼脂块，放入I. 5ml离心管称取重量。b.按每O.I克胶块加入200 μ I溶胶液；于50°C水浴放置，并不断温和地上下翻转EP 管，凝胶完全溶解为止；c.溶解后的凝胶溶液全部加入到有吸附柱的收集管中，12000r/min离心30sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；d.向吸附柱加入700μ I漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；e.向吸附柱加入500μ I漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液；将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一步的试验；f.将吸附柱置于另一个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30uL洗脱液，室温放置2min，12000r/min离心Imin收集DNA溶液；g.取2uL回收产物于I.O %的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤A3包括以下步骤(I)目的片段与载体连接将回收、检测后的目的片段与PMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD_18T载体试剂盒使用说明书，操作连接体系为PMD-18T Vector0.5 μ L纯化回后的PCR片段5ULSolution I4.5 μ LTotal10.0 μ L 以上操作在冰上进行，稍离心混匀，16°C 在PCR仪中连接12h，_20°C保存备用； (2)大肠杆菌感受态细胞的制备 a.从无抗生素平板上挑取新鲜的E.coli JM109单菌落结种于IOml LB液体培养基中，370C，250r/min摇菌培养过夜； b.取2ml活化过夜的菌液接种于含50mlLB液体培养基的锥形瓶中，37°C，250r/min摇菌培养至OD600 = O. 3 ； c.将细菌培养物无菌操作下转移至50mlEP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min离心IOmin,弃上清,收集菌体沉淀； d.加入20ml冰预冷的0.lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次40C 4000r/min离心IOmin,弃上清,收集菌体沉淀； e.加入2ml冰预冷的0.lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置过夜； f.按200ul/份加入15%冰预冷甘油，混匀分装，_70°C冻存备用； (3)连接产物的转化 a.吸取IOul连接物介入冰预冷的I.5ml EP管中，再取出_70°C冻存的E. coli感受态细胞置于冰上融化，轻弹管壁使细胞混匀； b.小心吸取100μ I细胞悬液加入到含有连接产物的EP管中，轻弹管壁，混匀后冰浴30min ； c.42°C水浴热激90sec,立即冰浴3min ； d.加入500μ I预热至37°C的LB液体培养基，37°C，250r/min摇菌培养45min ； e.吸取200μ I菌液,用灭菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固体培养基平板上,室温温浴至完全吸收，37°C培养箱中倒置过夜培养； (4)阳性菌落的筛选 随机挑选菌落接种于LB氨节培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，用于相应基因PCR扩增相同的引物及反应条件进行扩增。扩增产物用I. O %琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为所克隆基因后，取20 μ I交送北京六合华大工程技术有限公司完成测序。
全文摘要
本发明公开了一种克隆山羊PID1基因编码区全序列的方法，包括以下步骤A1、提取山羊背最长肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；A2、引物的设计及PCR反应以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物上游引物P15′-CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3′下游引物P25′-TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3′。A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。提供一种简单、快捷的获取山羊PID1基因的完整编码区序列的方法，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。
文档编号C12N15/70GK102618550SQ20111044545
公开日2012年8月1日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者万璐, 徐刚毅, 徐洪刚, 汪代华, 郑程莉, 马基斯 申请人:四川农业大学