专利名称：基因表达盒及含有该基因表达盒的重组表达载体的制作方法
基因表达盒及含有该基因表达盒的重组表达载体
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基因表达盒及含有该基因表达盒的重组表达载体。
背景技术：
传统的转基因方法主要采用病毒携带特异性的启动子来实现目的基因在靶细胞类型中的表达，其主要方法是克隆出在某一类群细胞中特异性表达的蛋白质的启动子序列，然后亚克隆到携带有目的基因的病毒转移载体上实现基因的特异性表达。该方法在某些情况下能够取得较好的效果，但是多数情况下却得不到理想的效果，主要是因为所采用的特异性启动子在多数情况下表达效率比较低，同时又很难找到其他可替代的特异性启动子，那么要提高目的基因的表达效率同时又兼顾细胞选择性成为急需解决的问题。
发明内容基于此，有必要提供一种表达效率较高且细胞特异性较强的基因表达盒。一种基因表达盒，包括依次相连的无细胞特异性的启动子、LoxP位点、终止子、细胞特异性启动子、Cre重组酶基因、终止子、LoxP位点、目的基因及终止子，其中，两个LoxP 位点是同向的。在优选的实施方式中，所述无细胞特异性的启动子为CMV启动子、EFl-a启动子或 PGK启动子。在优选的实施方式中，所述CMV启动子的基因序列为序列表中的SEQ ID NO :1。在优选的实施方式中，所述LoxP位点的基因序列为序列表中的SEQ ID NO :2。在优选的实施方式中，所述终止子为SV40 poly A终止子。在优选的实施方式中，所述SV40 poly A终止子的序列为序列表中的SEQ ID NO 3。在优选的实施方式中，所述Cre重组酶基因序列为序列表中的SEQ ID NO :4。
包含上述特征的基因表达盒可以用于构建重组表达载体，从而用于疾病的诊断或治疗等领域。优选的，使用的表达载体可以为质粒或病毒。 当该基因表达盒导入到活体动物的某个组织后，无细胞特异性的启动子的转录被下游终止子提前终止，具有细胞特异性的启动子会在靶细胞中表达Cre重组酶，非靶细胞中不表达，Cre重组酶会识别基因表达盒上的LoxP位点，将两同向LoxP位点之间的序列剪切掉，从而开启了无细胞特异性的启动子的转录，实现目的基因的高效表达。与传统技术相比，该基因表达盒无需使用转基因动物就能实现目的基因的高效表达，同时保证细胞的选择性；且无需使用多个表达载体，只要按要求将基因表达盒克隆到实验所需的表达载体就可以达到实验目的，节省了实验步骤和时间。
图1为一实施方式的基因表达盒的结构示意图；图2为具体实施例部分设计的基因表达盒的结构示意图；图3为pMD18T-CS载体构建的技术路线图；图4为pMD18T-CS载体的酶切鉴定结果图；图5为pMD18T-CCS载体构建的技术路线图；图6为pMD18T-CCS载体的酶切鉴定结果图；图7为pMD18T-CCST载体构建的技术路线图；图8为pMD18T-CCST载体的酶切鉴定结果图；图9为pShuttle-CCS载体构建的技术路线图；图10为pShuttle-CCS载体的酶切鉴定结果图；图11为pshuttle-CCS_ChR2载体构建的技术路线图；图12为pshuttle-CCS-ChR2载体的酶切鉴定结果图；图13为含有该基因表达盒的腺病毒在体内表达ChR2的检测结果图。
具体实施方式下面主要结合附图及具体实施例对基因表达盒及含有该基因表达盒的重组表达载体作进一步详细的说明。如图1所示，一实施方式的基因表达盒，包括依次连接的无细胞特异性的启动子 (Promoter 1)、LoxP位点、终止子(stop)、细胞特异性启动子(Promoter2)、Cre重组酶基因、终止子(stop)、LoxP位点、目的基因(Target gene)及终止子(stop)，其中，两个LoxP 位点是同向的。本实施方式的无细胞特异性的启动子优选强启动子，如CMV启动子、EFl-a启动子或PGK启动子等，其中CMV启动子的基因序列为序列表中的SEQ ID NO :1。该强启动子可以在众多类型的细胞(靶细胞或者非靶细胞)中启动目的基因的表达，用来高效的表达目的基因。具体实施过程中可以根据需求克隆相应的强启动子序列到该位置。Cre/LoxP位点重组酶系统是在体内外进行遗传表达的有力工具，Cre重组酶能够识别DNA序列上的LoxP位点，当DNA序列中有两个同向的LoxP位点时，Cre重组酶会将位于LoxP位点之间的DNA序列剪切掉，从而关闭或开启基因的表达。其中，LoxP位点的基因序列如序列表中的SEQ ID NO 2所示，Cre重组酶基因序列如序列表中的SEQ ID NO 4所不。终止子可以采用常用的SV40 polyA (简称pA)终止序列，其序列如序列表中的SEQ ID NO 3 所示。细胞特异性启动子只能在特定类型的细胞(简称靶细胞)中表达相应的目的基因，在非靶细胞中则没有启动目的基因表达的功能。一般情况下，其在特定细胞中启动效率较低，其对应的目的基因的表达效率也较低。两个启动子同时使用(即无细胞特异性的启动子和细胞特异性启动子)，并且结合Cre/LoxP系统，让细胞特异性的启动子在靶细胞内表达Cre重组酶，当Cre重组酶表达后，就会在靶细胞内将表达盒中的两个同向LoxP位点之间的序列剪切掉，从而开启了强启动子的转录，实现目的基因的高效表达。当具有图1结构的基因表达盒的表达载体进入动物特定组织后，位于LoxP位点中的细胞特异性启动子就会选择性的在靶细胞类群中表达Cre重组酶，而其它细胞类群中则不表达Cre重组酶。尽管在细胞特异性启动子前设有无细胞特异性的启动子，在一般情况下其会启动下游序列的转录，但在该启动子后面的目的基因前设计有终止子，从而提前终止了它的转录，只有这段终止序列被剔除后，无细胞特异性的启动子才能发挥作用。当靶细胞中表达Cre重组酶后，基因表达盒中的两个同向LoxP位点被Cre酶识别，从而将其间的 DNA序列剪切掉，被剪切的基因表达盒在DNA序列上发生重大变化，无细胞特异性的启动子转录被提前终止的结构被解除，开始下游目的基因的高效表达。包含上述特征的基因表达盒可以用于构建重组表达载体，从而用于疾病的诊断或治疗等领域。优选的，使用的表达载体可以为质粒或病毒。下面以具体的实施例来说明如何实现目的基因在靶细胞中高效表达通常在五羟色胺能神经元细胞内表达光敏蛋白ChR2(Channelrh0d0pSinD是选取色氨酸羟化酶的启动子作为表达光敏蛋白ChR2的启动子，因为只有这种酶特异性的表达在五羟色胺能神经元细胞中，但是使用该启动子后，目的基因的表达十分微弱，很难检测至IJ，对于实验几乎是没有意义。研究发现色氨酸羟化酶在五羟色胺能神经元细胞中的表达水平本身很低，即是色氨酸羟化酶启动子是一个弱启动子，自然表达效率很低。本实施例的无细胞特性的启动子选用巨细胞病毒启动子(CMV promoter)，细胞特异性启动子选用色氨酸羟化酶启动子(TPH promoter)。其具体构建方法如下一、实验材料1.质粒和菌株pMD 18T-simple 及连接酶 solution I 购自 takara 公司；pshuttle载体及腺病毒包装系统购自Mratagene公司；大肠杆菌感受态(Escherichia coli)DH5a 购自 takara 公司。2.分子克隆主要相关试剂限制性内切酶 Bgl II、EcoR V、Kpn I、Not I、Xba I 禾口 Sac I 购自 takara 公司， Pac I、Pme I、Xma I 购自 NEB 公司。3.细胞株及实验动物人胚胎肾细胞HEK293购自于美国ATCC细胞公司；C57小鼠购自于广东省医学实验动物中心。4.腺病毒包转所需试剂DMEM,购自于 GIBCO 公司；胎牛血清(FBS)，购自于GIBCO公司；胰酶，购自于GIBCO公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，购自于Hyclone公司；转染试剂(FuGENE HD transfection reagent)、细胞培养皿及移液管购自coming 公司。二、实验方法及数据1. LoxP, stop、SV40 ρIoyA及Cre重组酶基因的DNA序列合成及克隆利用基因合成技术合成如图2所示的DNA序列，将该序列插入到pMD18T-Simple 载体上，经酶切鉴定该序列确实插入到载体中，并将该载体命名为PMD18T-CS。
pMD18T-CS载体构建的技术路线图如图3所示。pMD18T_CS酶切鉴定Bgl II和 EcoR V，酶切鉴定结果如图4所示，得到大约1. 7kb左右的片段和2. 6kb的片段，证明构建成功，其中，鉴定过程中使用的Marker为1Kb DNA ladder。2. CMV promoter 的克隆利用PCR技术，以ρ⑶NA3. 1载体为模板，扩增CMV promoter,将扩增后的片段插入到pMD18T-CS载体的Bgl II与&icl之间，并将构建的载体命名为pMD18T_CCS，构建过程如图5所示。pMD18T-CCS酶切鉴定结果如图6所示，经Bgl II和I酶切，得到约4. 3Kb和 600bp左右(即CMV promoter片段的长度)的片段，经测序证实该序列正确，其中，鉴定过程中使用的 Marker 为 1Kb DNA ladder。3. TPH promoter 的克隆提取小鼠神经元细胞的基因组DNA，以该基因组DNA为模板利用PCR技术扩增TPH promoter,并将该序列插入到pMD18T_CCS载体的Sbf I与Xma I之间，构建过程如图7所示，将构建的载体命名为PMD18T-CCST。pMD18T-CCST酶切鉴定结果如图8所示，经Xma I和Sbf I酶切，得到约4. 9Kb和 IKbTPH启动子左右的片段，测序证实该片段正确插入，其中，鉴定过程中使用的Marker为 1Kb DNA ladder。4.将含有TPH promoter的表达盒(即pMD18T_CCST)克隆到pshuttle载体上利用PCR的方法以pMD18T为模板，扩增含有TPH promoter的表达盒，将该片段插入到pshuttle载体的Kpn I与Not I之间，构建过程如图9所示，并将构建的载体命名为 pshuttle-CCS。pshuttle-CCS酶切鉴定结果如图10所示，经Kpn I和Not I酶切，得到约3.2Kb 和6. 6Kb左右的片段，经测序证实该序列插入正确，其中，鉴定过程中使用的Marker为1Kb DNA ladder。5. ChR2 及 SV40polyA 克隆到 pshuttle-CCS 载体上利用PCR技术或者基因合成的方式获得ChR2与SV40polyA序列，将该序列插入到 pshuttle-CCS的)(ba I和EcoRV之间，并将构建的载体命名为pshuttle-CCS_ChR2构建过程如图11所示。pshuttle-CCS-ChR2酶切鉴定结果如图12所示，经Xba I和EcoR V酶切，得到约1. 3Kb和9. 8Kb左右的片段，测序证实该序列正确的插入其中，鉴定过程中使用的Marker 为 1Kb DNA ladder。6.将上面构建好的载体利用腺病毒包装技术，制备腺病毒，将包装好的病毒利用立体定位仪注射到小鼠的实验脑区，腺病毒会感染注射位点周围的部分区域，在五羟色胺能神经元细胞类群中，色氨酸羟化酶启动子会启动Cre重组酶的低效率转录，Cre重组酶会表达在五羟色胺能神经元中，非五羟色胺能神经元中则不能表达Cre重组酶，Cre重组酶表达后会识别表达盒结构上的LoxP位点，LoxP位点中间的DNA序列被剪切，同时CMV promoter下游的终止序列也被剪切，从而实现了光敏蛋白ChR2在强启动子下的高效表达。将具有该基因表达盒并携带有ChR2基因的腺病毒载体构建好之后，利用该载体包装腺病毒，将包装好的腺病毒利用立体定位注射方式，注射C57小鼠的大脑的中缝核(DRN)区域，四天后，取出该中缝核区域的组织提取蛋白，免疫印迹检测ChR2的表达情况。 以不具有该基因表达盒的腺病毒载体为对照。检测结果如图13所示，其中，Lanel 未注射病毒C57，lane 2 注射含有基因表达盒的病毒，lane3 注射只含有ChR2基因的病毒，证明 ChR2基因在小鼠体内成功表达，且lane 2条带亮度明显强于lane 1和lane 3，说明ChR2 基因在小鼠体内高效表达。当该基因表达盒导入到活体动物的某个组织后，无细胞特异性的启动子的转录被下游终止子提前终止，具有细胞特异性的启动子会在靶细胞中表达Cre重组酶，非靶细胞中不表达，Cre重组酶会识别基因表达盒上的LoxP位点，将两同向LoxP位点之间的序列剪切掉，从而开启了无细胞特异性的启动子的转录，实现目的基因的高效表达。与传统技术相比，该基因表达盒无需使用转基因动物就能实现目的基因的高效表达，同时保证细胞的选择性；且无需使用多个表达载体，只要按要求将基因表达盒克隆到实验所需的表达载体就可以达到实验目的，节省了实验步骤和时间。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种基因表达盒，其特征在于，包括依次相连的无细胞特异性的启动子、LoxP位点、 终止子、细胞特异性启动子、Cre重组酶基因、终止子、LoxP位点、目的基因及终止子，其中， 两个LoxP位点同向设计。
2.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述无细胞特异性的启动子为CMV启动子、EFl-a启动子或PGK启动子。
3.如权利要求2所述的基因表达盒，其特征在于，所述CMV启动子的基因序列为序列表中的 SEQ ID NO :1ο
4.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述LoxP位点的基因序列为序列表中的 SEQ ID NO :2ο
5.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述终止子为SV40poly A终止子。
6.如权利要求5所述的基因表达盒，其特征在于，所述SV40poly A终止子的序列为序列表中的SEQ ID NO :3ο
7.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述Cre重组酶基因序列为序列表中的 SEQ ID NO :4ο
8.含有权利要求1-7中任一项所述基因表达盒的重组表达载体。
9.如权利要求8所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体为质粒或病毒。
全文摘要
本发明涉及一种基因表达盒及其应用，该基因表达盒包括依次连接的无细胞特异性的启动子、LoxP位点、终止子、细胞特异性启动子、Cre重组酶基因、终止子、LoxP位点、目的基因及终止子，其中，两个LoxP位点是同向的。与传统技术相比，该基因表达盒无需使用转基因动物就能实现目的基因的高效表达，同时保证细胞的选择性；且无需使用多个表达载体，只要按要求将基因表达盒克隆到实验所需的表达载体就可以达到实验目的，节省了实验步骤和时间。
文档编号C12N15/63GK102533744SQ20111045171
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日 公开号201110451711.发明者潘建青, 王立平, 罗振 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院