专利名称：一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法
技术领域：
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌 (Metarhizium anisopIiae)发酵生产脂肪酶的培养基及方法。
背景技术：
脂肪酶(Lipase，E. C. 3.1.1. 3，甘油三酯水解酶)，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸脂肪酶是一类分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不仅可以催化酯水解反应还可以催化酯合成反应和转酯反应。微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶解作用的PH和温度范围更宽，便于工业化生产获得高纯度酶制剂121。脂酶在微生物界分布很广，据不完全统计，目前已有65个属的微生物能够产生脂肪酶。随着对微生物脂肪酶研究的深入，已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。
就微生物脂肪酶而言，由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的来源不足等问题， 脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。发明内容
本发明的目的在于提供一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法，该培养基发酵生产的脂肪酶活力高，发酵方法的条件温和，易于控制，有利于工业化生产。
本发明首先提供了一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，所述培养基的原料含有橄榄油 50. O g / L, K2 HPO41. O g / L, CaCl2 O.1 g / L, NaCl O. 5 g / L, Mg2SO4 · 7H20 O.1 g / L, (MM)2SO4LO g / L，葡萄糖 10. O g / L。
其次，本发明还提供了一种绿僵菌发酵产脂肪酶的方法，所述方法包含以下步骤(a)将绿僵菌接种种子培养基，制得发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，IOOmL的三角瓶装液量为50mL，接种量10%，于25°C，转速150 r/min下培养。
所述种子培养基的原料含有按培养基重量计，马铃薯20%，蔗糖2%，。
本发明采用的绿僵菌为绿僵菌MaYTTR-04 (何学友等，金龟子绿僵菌MaYTTR-04菌株对松墨天牛成虫的致病力，昆虫学报，2008年I月)。
采用本发明优化后的培养基，发酵周期72h，发酵产生结果绿僵菌MaYTTR-04产脂肪酶为30U/mL以上。
本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶活力高(30U/mL)等优点。
图1为对硝基苯酚标准曲线。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1单因素实验确定培养基最优成分(I)种子培养基配制马铃薯200. O g / L，蔗糖20.0 g / L，其余为水，分装于250mL 的三角瓶，每个三角瓶含100mL。O.1MPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基杀菌预处理。
(2)发酵种子的制作将绿僵菌MaYTTR-04接种于马铃薯琼脂培养基上，于25°C 下培养7d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基， 25°C，转速150 r/min下培养48h，即为发酵液。
(3)酶液的制备取步骤(2)下的发酵液在4°C下，5000 r/min离心，5min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在波长410nm处的吸光值。换算成酶活单位U/mL。
(4)脂肪酶酶活测定在pH 8. 0、50 °C条件下，每min水解p-NPP释放I μ mol对硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量为I个脂肪酶活力单位(U)。
方法溶液A 150 mg p-NPP溶于50 mL异丙醇；溶液B 500 mL pH 8. O的 Tris-HCl缓冲液中加入2. 22 g Triton X-100和0. 56 g阿拉伯胶。
取2个试管(分别是对照管和样品管)，各加溶液B 2. 85 mL和底物溶液A 0.1 mL (缓慢混合，该溶液至少可稳定2 h)。50 °C水浴中预热5 min，然后在对照管中加入已灭活的酶液0.05 mL，样品管中加入酶液0.05 mL，立即混匀计时。在水浴中准确反应10 min时马上测定410 nm下酶水解产生的p-nitrophenol的吸光度值(OD41t!值)。酶活计算公式A = CtA1 - A0] XK + C0) XV1XN / (V2Xt)A——样品酶活(u/mL) A1——样品的吸光度值(OD41tl值)A0——对照的吸光度值(OD41tl值校准为0) K-p-nitrophenol标准曲线的斜率，C0-p-nitrophenol标准曲线的截距N-稀释倍数V1-反应液的体积(3 mL)V2——酶液的体积(0.05 mL) t——反应时间(10 min)。
(5)标准曲线的制作(底物缓冲液指pH7. 5磷酸缓冲液，A+B)
权利要求
1.一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料配方为橄榄油 O. 25-2 w%，蛋白胨 O. 05-0. 4 w%, ZnCl2 O. 0125-0.1 mo I / L,叶酸 O. 005-0. 04 w%, pH5. 0-6. 5，其余为水。
2.—种绿僵菌发酵产脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤(a)将绿僵菌接种种子培养基，制得发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液接种于权利要求1所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量10%，于25°C，转速150 r/min下培养。
3.如权利2所述绿僵菌发酵产脂肪酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料配方为按重量分数计，马铃薯20%，蔗糖2%，余量为水。
全文摘要
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法。所述培养基的原料配方为橄榄油0.25-2w%，蛋白胨0.05-0.4w%，ZnCl20.0125-0.1mol/L，叶酸0.005-0.04w%，pH5.0-6.5，其余为水。该方法通过将发酵种子液接种于培养基，100mL的三角瓶装液量为50mL，接种量10%，于25℃，转速150r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高等优点。
文档编号C12R1/645GK102994472SQ201210543900
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者邱君志, 林瑞珠, 苏礼超, 涂洁, 宋飞飞, 邱云锋, 李小霞, 郭庆丰, 何肖云, 毛丽慧 申请人:福建农林大学