用于微生物检测的方法及试剂盒的制作方法

用于微生物检测的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本申请涉及一种用于微生物检测的方法及试剂盒。将试验样品中微生物的活细胞与死细胞或损伤细胞相区别并借助以下步骤来检测：步骤(a)其中向所述试验样品中添加药物学制剂，当用具有波长50至700nm的光照射时所述药物学制剂与DNA或RNA共价结合；步骤(b)其中用具有波长350至700nm的光照射添加有交联剂的所述试验样品；步骤(c)其中在抑制核酸扩增抑制剂作用的药物学制剂的存在下，通过使用核酸扩增方法，在不从所述细胞中提取核酸的情况下扩增所述试验样品中的所述微生物的DNA或RNA的目标区域；以及步骤(d)其中分析由此获得的扩增产物。
【专利说明】用于微生物检测的方法及试剂盒
[0001]本申请是申请日为2010年7月23日、申请号为201080033156.X、发明名称为“用于微生物检测的方法及试剂盒”的中国发明申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及用于检测包含于食品、生物样品和环境样品如工业用水和自来水中的微生物的方法和试剂盒。更精确地，本发明涉及用于检测微生物的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒能够选择性检测包含于食品、生物样品、抽汲样品(swab sample)和环境样品如工业用水和自来水中的微生物的活细胞。
【背景技术】
[0003]平板培养法已通常用于食品、生物样品、抽汲样品或环境样品中的总活菌数的测定。然而，平板培养法需要约两天至一个月的时间来获得结果。
[0004]由于灭菌技术和食品加工技术的改进，甚至在细胞以极少量存在的情况下，对于存在于试验样品中的微生物活体状态与微生物死亡状态的识别的需求增加。在食品卫生检查和临床试验领域中，尤其是作为细菌快速检测法，尝试通过PCR将对细菌特异的基因扩增至能够视觉观察到基因的量，来测定细菌的存在与否或者定量细菌。然而，如果以细菌DNA为靶标，则也会检测到试验样品中原本包含的死细胞的背景，因而通过PCR获得的阳性结果不一定表明活细菌的存在。因此，食品卫生和临床试验领域的现状是，尽管PCR是高度敏感和快速的技术，但并未广泛应用。
[0005]近来，尝试 通过用作为靶标的mRNA的逆转录酶制备cDNA并用对各种细菌特异的引物进行PCR，来只检测和定量试验样品中的微生物的活细胞。然而，在该方法中，并未抑制死细胞自身mRNA的逆转录,并且当在试验样品中包含104cfu/ml或104cfu/g以上的死细胞时，会检测到死细胞的背景。因此，不能说该方法足以作为测定活体和死亡状态的方法。
[0006]具体地，作为使用PCR法区别微生物如细菌的活体状态与死亡状态的方法，已公开了专利文献I和2中记载的方法。然而，使用PCR法区分微生物如细菌的活体和死亡状态的这些方法存在以下问题。
[0007]对公开于专利文献I中的技术而言，提及实施例用于识别包含于在100°C下进行10至30分钟的高温长时间灭菌(sterilization)的煮沸食品中的死细胞和包含于进行乙醇灭菌或甲醛灭菌的食品的微生物。然而，特别是后一类型的处理，实际上并没有食品进行此类巴氏消毒法(pasteurization)处理。并且,并不认为存在:在目前食品工业中进行主流巴氏消毒法(低温长时间巴氏消毒法(LTLT巴氏消毒法)、高温短时间巴氏消毒法(HTST巴氏消毒法)或超高温巴氏消毒法(UHT巴氏消毒法))的食品中仅活体微生物的检测，和在施用抗生素的传染病 患者的临床试样中仅活体特定病原菌的检测。另外，在以IO4Cfu/ml以上的浓度包含死细胞背景的食品或临床试样的试验样品的情况中，源于死细胞的最终PCR扩增产物的量超过了专利文献I的技术的检测极限，因此不可能确定通过PCR获得的试验样品的阳性响应是源于活细胞还是源于死细胞。[0008]此外，作为专利文献2的技术，公开了通过利用与活细胞的RNA/DNA的摩尔比相t匕，死细胞RNA/DNA的摩尔比的相对减少来识别活细胞与死细胞的方法。在该方法中，提取总RNA，通过使用逆转录反应来制备互补DNA，然后进行PCR来计算其Ct值，通过使用单独制备的校准曲线(calibration curve)来获得RNA的摩尔浓度。分别地,通过PCR扩增与该RNA相对应的染色体DNA的区域从而获得其Ct值，基于校准曲线计算染色体DNA的摩尔浓度从而获得RNA/DNA摩尔比。即，上述方法需进行复杂的总RNA提取并使用逆转录反应和PCR两步。因此，该技术在定量性和快速性上次于靶向DNA的一般PCR。此外，在活细胞中连续不断地产生RNA，然而在初期源于死细胞的RNA随时间的流逝而被分解。因此，该技术缺乏稳定性。此外，在以高浓度包含死细胞的食品或临床试样中，可通过该技术检测到仅1/10该浓度的活细胞。因此，在需要快速性、高灵敏度和准确性的食品卫生检查和临床试验领域中难以应用该技术。
[0009]专利文献3中公开了一种通过区分微生物的活细胞(有生活力并可培养的细胞)和死细胞或损伤细胞(有生活力但不可培养的细胞(VNC细胞))，从而选择性检测微生物的活细胞的方法。专利文献3所公开的方法为包括以下步骤的方法:用拓扑异构酶阻害剂(poison)和/或DNA旋转酶阻害剂处理试验样品的步骤、从试验样品中提取DNA和通过PCR扩增所提取DNA的目标区域的步骤以及分析扩增产物的步骤，并且例举了单叠氮乙锭(ethidium monoazide)作为拓扑异构酶阻害剂或DNA旋转酶阻害剂。
[0010]非专利文献I还公开了一种其中使用单叠氮乙锭的方法。该方法为包括以下步骤的检测方法:向试验样品添加单叠氮乙锭并用光照射该样品的步骤、照射后从该样品中提取DNA的步骤以及使用所提取的DNA作为模板通过PCR扩增特定区域的步骤。此外，在非专利文献I中公开了一种通过结合微生物培养和实时PCR来定量活细胞数的半定量技术。
[0011]此外，作为用于更加清楚地区分微生物的活细胞和损伤细胞的方法，公开了专利文献4中记载的方法。该方法为包括以下步骤的方法:向试验样品添加交联剂的步骤，所述交联剂通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够交联DNA ;用具有350nm至700nm波长的光照射添加了交联剂的试验样品的步骤；移除在用光照射的试验样品中包含的交联剂的步骤；向除去交联剂的试验样品中添加培养基并温育试验样品的步骤；向温育的试验样品再次添加交联剂的步骤，所述交联剂`通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够交联DNA ;用具有350nm至700nm波长的光照射添加了交联剂的试验样品的步骤；从试验样品中提取DNA并通过核酸扩增法扩增所提取DNA的目标区域的步骤以及分析扩增产物的步骤。
[0012]其间，表明存在这样一种可能性，即:在通过PCR扩增核酸时，白蛋白可抑制PCR抑制剂的抑制活性，或促进PCR反应(非专利文献2)。此外，还表明钙抑制PCR反应，但通过添加镁离子可容许钙对PCR的抑制(非专利文献3)。
[0013]此外，公开了一种使用细菌DNA作为模板进行PCR反应的方法，其中在不从细菌中提取DNA的情况下进行PCR反应(非专利文献4、专利文献5)。在专利文献5中，公开了在DNA指纹法中在细菌中进行随机PCR，并提及将磷酸盐和十二烷基硫酸盐作为核酸合成的缓冲组合物的组分。
[0014]现有技术文献
[0015]专利文献
[0016]专利文献1:PCT申请(Κ0ΗΥ0)的日文译文的特表2003-530118号公报[0017]专利文献2:国际专利公布W02002/052034号
[0018]专利文献3:国际专利公布W02007/094077号
[0019]专利文献4:国际专利公布W02009/022558号
[0020]专利文献5:国际专利公布W02004/104196号
[0021]非专利文献:
[0022]非专利文献I:Rudi, K.等人，Letters in Applied Microbiology, 2005, Vol.40,pp.301-306
[0023]非专利文献2:Forbes，B.E.等人，Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34(9) ,pp.2125-2128
[0024]J.^AjLetter in Applied Microbiology，1996，22，pp.153—158
[0025]非专利文献4: Kimberly, A.等人，BioTechniquesj 31，2001，pp.598-607

【发明内容】

[0026]发明要解决 的问题
[0027]通过前述使用拓扑异构酶阻害剂和/或DNA旋转酶阻害剂或者交联剂的方法，可以高敏感度地选择性检测微生物的活细胞，特别是克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、李斯特菌属(Listeria)和沙门氏菌属(Salmonella)细菌等的活细胞。然而，期望进一步改进的方法，特别是用于高灵敏或高准确地检测埃希氏菌属(Escherichia)或沙门氏菌属细菌的活细胞的方法。
[0028]本发明的目的为提供用于同包含于食品或生物样品中的微生物的死细胞或损伤细胞相比，更加有选择地检测所述微生物的活细胞的新方法以及用于进行此方法的试剂盒。
[0029]用于解决问题的方案
[0030]本发明的发明人对识别微生物生存与死亡的方法(可应用于各种灭菌法并适用于高检测灵敏度的食品卫生检查)以及在医院或临床实践中检测传染病患者的特定病原体的方法进行了广泛的研究。结果，本发明人发现通过以下步骤可以高灵敏度地实现上述识别:向试验样品添加通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂；用具有350nm至700nm波长的光照射试验样品；添加用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂(镁盐和有机酸盐或磷酸盐)，并通过核酸扩增反应扩增溢出细胞的微生物的染色体DNA。由此，完成了本发明。
[0031]即，本发明提供通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测试验样品中微生物的活细胞的方法，其包括以下步骤:
[0032]a)向所述试验样品添加通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂；
[0033]b)用具有350nm至700nm波长的光照射添加了所述试剂的所述试验样品；
[0034]c)在抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的存在下，通过核酸扩增法，在不从所述细胞中提取核酸的情况下扩增包含于所述试验样品的所述微生物的DNA或RNA的目标区域；和
[0035]d)分析扩增产物。[0036]在本发明的优选实施方案中，所述目标区域的扩增在微生物细胞中进行。
[0037]在前述方法的优选实施方案中，在前述步骤c)中，在选自表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐中的一种或多种的存在下进行所述目标区域的扩增。
[0038]在前述方法的优选实施方案中，在所述步骤c)之前，重复进行所述步骤a)和b)。
[0039]在前述方法的优选实施方案中，在所述步骤a)之前，进行以下步骤e):
[0040]e)用具有分解存在于所述试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒(colloidal particle)、脂质或糖类的活性的酶处理所述试验样品。
[0041]在前述方法的优选实施方案中，所述酶选自蛋白酶、脂质降解酶和糖类降解酶。
[0042]在前述方法的优选实施方案中，所述试验样品为食品、生物样品、饮用水、工业用水、环境用水、废水、土壤和抽汲样品之一。
[0043]在前述方法的优选实施方案中，所述微生物为细菌或病毒。
[0044]在前述方法的优选实施方案中,所述细菌为革兰氏阴性菌。
[0045]在前述方法的优选实施方案中，其中通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭(ethidium diazide)、单叠氮丙锭(propidium monoazide)、补骨脂素、4，5’，8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。
[0046]在前述方法的 优选实施方案中，用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂由以下组成:选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白(T4gene32pix)tein)、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。
[0047]在前述方法的优选实施方案中，所述有机酸盐选自乙酸盐、丙酸盐和柠檬酸盐。
[0048]在前述方法的优选实施方案中，所述磷酸盐为焦磷酸盐。
[0049]在前述方法的优选实施方案中，所述目标区域为50至5，000个核苷酸的目标区域。
[0050]在前述方法的优选实施方案中，所述目标区域为相应于选自所述试验样品的DNA的5S rRNA基因、16S rRNA基因、23SrRNA基因和tRNA基因中的基因的目标区域。
[0051]在前述方法的优选实施方案中，所述核酸扩增法为PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA、TRC、HC或微阵列法。
[0052]在前述方法的优选实施方案中，PCR作为实时PCR来进行，从而同时进行PCR和所述扩增产物的分析。
[0053]在前述方法的优选实施方案中，通过使用标准曲线来进行所述扩增产物的分析，所述标准曲线表示所述微生物的量与所述扩增产物之间的关系，并通过使用所述微生物的标准样品来建立。
[0054]作为本发明的试剂盒，提供一种用于检测试验样品中微生物的活细胞的试剂盒，其通过核酸扩增法来识别所述活细胞与死细胞或损伤细胞，所述试剂盒包括以下组分:
[0055]I)通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂；
[0056]2)用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂；和
[0057]3) 一种或多种通过核酸扩增法扩增将要检测的微生物的DNA或RNA目标区域的引物。
[0058]在前述试剂盒的优选实施方案中，所述试剂盒进一步包括选自表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐的一种或多种。
[0059]在前述试剂盒的优选实施方案中，所述试剂盒进一步包括具有分解存在于所述试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶。
[0060]在前述试剂盒的优选实施方案中，所述核酸扩增法为PCR、RT-PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA, TRC, HC或微阵列法。
[0061]在前述试剂盒的优选实施方案中，通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、单叠氮丙锭、补骨脂素、4，5’，8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。
[0062]在前述试剂盒的优选实施方案中，用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂由以下组成:选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。
[0063]在前述试剂盒的优选实施方案中，所述有机酸盐选自乙酸盐、丙酸盐和柠檬酸盐。
[0064]在前述试剂盒的优选实施方案中，所述磷酸盐为焦磷酸盐。
[0065]在前述试剂盒的优选实施方案中，所述酶选自蛋白酶、脂质降解酶和糖类降解酶。
【专利附图】

【附图说明】
[0066][图1]在本发明的方法中获得的PCR扩增产物的电泳照片，“活”表示活细胞，“损伤”表示损伤细胞
[0067][图2]显示通过本发明的方法进行的微生物活细胞检测的结果的电泳照片
[0068][图3]显示通过常规方法进行的`微生物活细胞检测的结果的电泳照片，“活”表示活细胞，“损伤”表示损伤细胞
[0069][图4]阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)细菌的未加热生理盐水悬浮液的荧光显微照片和立体显微照片
[0070][图5]阪崎肠杆菌细菌的未加热生理盐水悬浮液的上清液的荧光显微照片和立体显微照片
[0071][图6]重复热循环后阪崎肠杆菌细菌的生理盐水悬浮液的荧光显微照片和立体显微照片
[0072][图7]重复热循环后阪崎肠杆菌细菌的生理盐水悬浮液的上清液的荧光显微照片和立体显微照片
[0073][图8]悬浮于未加热预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌的荧光显微照片和立体显微照片
[0074][图9]悬浮于未加热预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌的上清液的荧光显微照片和立体显微照片
[0075][图10]重复热循环后悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌的荧光显微照片和立体显微照片
[0076][图11]重复热循环后悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌的上清液的荧光显微照片和立体显微照片
[0077][图12]显示在未加热状态或重复热循环后阪崎肠杆菌细菌的生理盐水悬浮液或其上清液的流式细胞术结果的图
[0078][图13]显示在未加热状态或重复热循环后悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌或其上清液的流式细胞术结果的图
[0079][图14]16S_23SrRNA基因扩增产物的电泳照片，在本发明的方法中该扩增产物是使用各种固定液处理的阪崎肠杆菌细菌获得的。Ct值用平均值和SD表示，SD在括号内示出
[0080]L: IOObp DNA 梯带(DNA ladder)
[0081]A:固定液A
[0082]B:固定液B
[0083]C:固定液C
[0084]S:未固定
[0085][图15]ompA基因扩增产物的电泳照片，在本发明的方法中该扩增产物是使用各种固定液处理的阪崎肠杆菌细菌获得的。Ct值用平均值和SD表示，SD在括号内示出 [0086]A:固定液A
[0087]B:固定液B
[0088]L: IOObp DNA 梯带
[0089][图16]通过使用阪崎肠杆菌细菌的PCR(16S_23SrRNA基因扩增反应)前后获得的电泳照片
[0090]泳道2和3 =PCR反应混合物的上清液
[0091]泳道5和6 =PCR反应后从通过离心洗涤两次的沉淀物(pellet)中提取的DNA
[0092]泳道7和8:直接从细胞提取的DNA
[0093]泳道9和10:临PCR前从实际用于试验的细胞中提取的DNA
[0094]泳道13和14:从添加PCR产物后洗涤的细胞中提取的DNA
[0095]L: IOObp DNA 梯带
[0096]B:固定液B
[0097]S:未固定
[0098][图17]在生理盐水或预处理剂的存在下进行热处理的阪崎肠杆菌细菌的悬浮液及其离心的上清液的电泳照片
[0099]L: IOObp DNA 梯带
【具体实施方式】
[0100]在下文中，将详细描述本发明的优选实施方案。然而，本发明不限于以下优选实施方案，并可在本发明的范围内自由变化。除非特别说明，本说明书的百分比表示为质量百分比。
[0101]通过本发明的方法而待检测的靶标包括所有种类的核酸，具体地，包括单链DNA、双链DNA、单链RNA和双链RNA，只要靶标能够被最终扩增即可。其中，检测靶标优选DNA、特别优选双链DNA。
[0102]〈1>本发明的方法
[0103]本发明的方法为通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测试验样品中微生物的活细胞的方法，其包括以下步骤:
[0104]a)向所述试验样品添加通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂；
[0105]b)用具有350nm至700nm波长的光照射添加了所述试剂的试验样品；
[0106]c)在抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的存在下，通过核酸扩增法，在不从所述细胞中提取核酸的情况下扩增包含于所述试验样品的所述微生物的DNA或RNA的目标区域；和
[0107]d)分析扩增产物。
[0108]在本发明的说明书中，术语“试验样品”是指包含待检测微生物的活细胞的对象物。试验样品不特别限定，只要可通过核酸扩增法对染色体DNA或RNA的特定区域扩增来检测微生物的存在即可。优选的实例包括食品、生物样品、饮用水、工业用水、环境用水、废水、土壤和抽汲样品等。[0109]特别地,食品的优选实例包括:饮品如软饮料、碳酸软饮料、营养饮料(supplementdrink)、果汁饮料和乳酸菌饮料(包括这些饮料的浓缩物和粉末)；冰糖果类产品如冰淇淋、冰冻果子露(ice sherbets)和刨冰；乳制品如加工乳、乳饮料、发酵乳和黄油；肠内食品(enteral food)、流体饮食、婴儿用乳、运动饮料；以及功能性食品如特定保健用途的食品和健康辅助食品(dietary supplements)等。
[0110]生物样品的实例包括血样、尿样、脑脊液样品、滑液样品、胸膜渗液(pleuraleffusion)样品、痰样品、粪便样品、鼻腔粘膜样品、喉部粘膜样品、洗胃溶液样品、脓汁样品、皮肤粘膜样品、口腔粘膜样品、呼吸器官粘膜样品、消化器官粘膜样品、眼结膜样品、胎盘样品、生殖细胞样品、产道样品、母乳样品、唾液样品、呕吐物和水疱内容物等。
[0111]环境用水的实例包括自来水、地下水、江河水和雨水等。
[0112]在本发明中，试验样品可为任何如上所述的食品、生物样品、饮用水、工业用水、环境用水、废水、土壤和抽汲样品等本身，或可为任何其稀释或浓缩产物，或通过除本发明的方法以外的预处理所获得的任何产物。预处理的实例包括热处理、过滤和离心等。
[0113]进一步，异物如试验样品中除微生物以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质和糖类等可通过用具有降解它们的活性的酶处理等来除去或减少。在试验样品为任何乳、乳制品和由乳或乳制品生产的食品的情况下，试验样品中除微生物以外的细胞的实例包括牛白细胞和乳腺上皮细胞等。同时，在试验样品为任何生物样品如血样、尿样、脑脊液样品、滑液样品和胸膜渗液样品的情况下，所述细胞的实例包括红细胞、白细胞(如粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)和血小板等。
[0114]所述酶不特别限定，只要其可降解异物并不损害待检测微生物的活细胞即可，其实例包括，例如，脂质降解酶、蛋白质降解酶和糖类降解酶。其中，可使用一种酶或两种以上酶，但优选使用脂质降解酶和蛋白质降解酶二者，或脂质降解酶、蛋白质降解酶和糖类降解酶全部。
[0115]脂质降解酶的实例包括脂肪酶和磷酸酶等，蛋白质降解酶的实例包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶等，以及糖类降解酶的实例包括淀粉酶和纤维素酶等。
[0116]所述“微生物”是将要通过本发明的方法检测的对象物，并不特别限定，只要其可通过核酸扩增法检测，并且用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂以不同于在微生物的死细胞或损伤细胞的方式对所述微生物的活细胞起作用即可。优选的实例包括细菌、真菌、酵母和病毒等。细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌二者。革兰氏阳性菌的实例包括葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、链球菌属(Streptococcus)细菌如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、李斯特菌属(Listeria)细菌如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、芽抱杆菌属(Bacillus)细菌如腊状芽抱杆菌(Bacilluscereus)和炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、分支杆菌属(Mycobacterium)细菌如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)和鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)和梭菌属(Clostridium)细菌如肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)和产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)等。革兰氏阴性菌的实例包括肠细菌，其典型实例为埃希氏菌属(Escherichia)细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌属(Enterobacter)细菌如阪崎肠杆菌、柠檬酸杆菌属细菌如克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)和克雷伯氏菌属细菌如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)以及沙门氏菌属细菌、弧菌属(Vibrio)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌和军团菌属(Legionella)细菌等。病毒的实例包括具有包膜的病毒如流感病毒和不具有包膜而仅具有核壳体(nuleocapsids)的病毒如诺如病毒(noroviruses)、轮状病毒(rotaviruses)和腺病毒(adenoviruses)。
[0117]对于病毒而言，已知存在测量水中病毒的活化和失活的方法，其中使光反应性核酸交联剂(EMA)作用于试验样品，然后通过RT-PCR仅测定活化的病毒(http://www.recwet.t.u-toky0.ac.jp/furumailab/j/sotsuron/H21/H21sotsuron.html, Developmentof ethidium monoazide(EMA)-RT-PCR for selective detection of enteric viruses,关于健康相关的水微生物(water microbiology)的第15次国际研讨会(2009年5月31日-6月05日，Ursulines会议中心，Naxos,希腊))。即，表明EMA不渗入活化的病毒,但仅渗入具有严重物理损伤的核壳体的失活病毒，因此，活化病毒(活)和失活病毒(死)可由EMA区别。因此，认为本发`明不仅可应用于细菌、丝状真菌和酵母，还可应用于病毒。
[0118]在本发明中，“活细胞”是指当在通常优选的培养条件下培养时，处于细胞可增殖并显示微生物的代谢活性的状态(有生活力并可培养的状态)的细胞，并且基本上无细胞壁损伤的细胞。如上所述的代谢活性，可例举ATP活性、酯酶活性等。在本发明中，为了方便起见，病毒颗粒也称为“细胞”。对于病毒而言，“活细胞”是指处于可感染哺乳动物细胞并增殖的状态的病毒。
[0119]“死细胞”为处于即使其在最优培养条件下培养也不能增殖、也不显示代谢活性的状态(死亡状态)的细胞。此外，“死细胞”处于以下状态:尽管保持了细胞壁的结构，但细胞壁自身高度损伤，显示弱渗透性的核染色剂如碘化丙锭可渗入或透过细胞壁。对于病毒而言，“死细胞”是指处于不能感染哺乳动物细胞的状态的病毒。
[0120]“损伤细胞”(损伤细胞或有生活力但非可培养细胞)为处于以下状态的细胞:由于因人工压力或环境压力而损伤，即使当细胞在通常优选的培养条件下培养也难以增殖，其与活细胞相比显示较低水平的代谢活性，但与死亡细胞相比显示显著水平的代谢活性。对于病毒而言，“损伤细胞”是指处于即使感染哺乳动物细胞也不能在细胞内增殖的状态的病毒。
[0121]在本说明书中，除非特别说明，“活细胞”、“死细胞”和“损伤细胞”分别意指微生物的活细胞、死细胞和损伤细胞。
[0122]特别地，在食品卫生检查和临床试验领域中，由于温热处理或施用抗生素而显示损伤细胞状态的细菌的检测引起了注意，本发明提供用于检测微生物的方法，所述方法不仅能够检测活细胞，而且还能够识别活细胞与死细胞或损伤细胞。
[0123]对于所有活细胞、损伤细胞和死亡细胞，细胞数的单位通常为细胞数(细胞)/ml。在本说明书中，细胞数用对数表示，“1gltl细胞/ml”意指IOa个细胞/ml。
[0124]活细胞数可用形成菌落数(cfu/ml(菌落形成单元/ml))估算，形成菌落数通过在适当的平板培养基中在最优条件下培养获得。可通过例如将活细胞悬浮液进行热处理(例如沸水中的热处理)来制备微生物的损伤细胞的标准样品。在此样品中的损伤细胞数可用热处理前活细胞悬浮液中的cfu/ml估算。尽管用于制备损伤细胞的在沸水中热处理的时间依据微生物的类型而变化，但是在实施例中所述细菌的损伤细胞例如可通过约50秒的热处理来制备。此外，微生物的损伤细胞的标准样品还可通过用抗生素处理来制备。在此情况中，损伤细胞的细胞数可基于形成菌落数(cfu/ml)来估算，所述形成菌落数是当细胞在适当的平板培养基上在最优条件下培养时所观察到的形成菌落数，即，用抗生素处理活细胞悬浮液，然后除去抗生素，测量通过悬浮液的可见光(波长:600nm)的透光度，即，悬浮液的浊度，测量的浊度可与已知活细胞浓度的活细胞悬浮液相比较，从而计算用抗生素处理的损伤细胞数。
[0125]对于病毒而言，细胞数的单位用卩遼斑形成单位(pfu或PFU, plaque-formingunit)表示。
[0126]本发明的方法用于微生物的活细胞的检测，并且不同于活细胞的微生物的细胞可为损伤细胞或死细胞。
`[0127]在本发明中，“活细胞的检测”包括试验样品中活细胞有无的测定以及试验样品中活细胞量的检测二者。活细胞量不限定至绝对量，并可为相对于对照样品中活细胞量的相对量。而且，“通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测活细胞”意指与死细胞或损伤细胞相比更加选择性地检测活细胞。此外，“识别活细胞与死细胞或损伤细胞”包括从死细胞与损伤细胞二者识别活细胞。
[0128]下文中，将针对各步骤解释本发明的方法。如上所述，本发明的方法在以下描述的步骤之前可包括用具有分解存在于试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶处理试验样品的步骤。
[0129](I)步骤 a)
[0130]将通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂添加到试验样品中。即，用该试剂处理试验样品中的微生物。
[0131]如下文所述，该试剂插入双链DNA或RNA并通过用光照射而共价结合至所述DNA或RNA从而交联分子。另外，推定通过用光照射使试剂共价结合至单链DNA或RNA，从而抑制PCR反应。下文中该试剂也可简称为“交联剂”。
[0132]与微生物的损伤或死细胞以及体细胞如牛白细胞、白细胞或血小板相比，交联剂优选对微生物的活细胞具有不同的作用。更具体地，与微生物的活细胞的细胞壁相比，交联剂优选为可更容易穿过微生物的损伤细胞或死细胞的细胞壁以及体细胞如牛白细胞、白细胞或血小板的细胞膜的交联剂。
[0133]交联剂的实例包括单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、补骨脂素、4，5’，8-三甲基补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素和单叠氮丙锭等。可单独使用这些交联剂的一种，或可组合使用其两种以上。
[0134]可适当地设定用交联剂处理的条件。例如，易于识别微生物的活细胞与微生物的死或损伤细胞的条件可通过以下测定:向待检测的微生物的活细胞和微生物的死或损伤细胞的悬浮液中添加各种浓度的交联剂；使悬浮液静置各种时间段；通过离心分离细胞；并通过核酸扩增法分析细胞。此外，易于从各种细胞中识别微生物的活细胞的条件可通过以下测定:向待检测的微生物的活细胞和体细胞如牛白细胞或血小板的悬浮液中添加各种浓度的交联剂；使悬浮液静置各种时间段；通过离心分离所述细胞和所述各种细胞；并通过核酸扩增法分析细胞。具体地:例举用单叠氮乙锭处理的条件为4至10°C、1至100 μ g/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用双叠氮乙锭处理的条件为4至10°C、1至100 μ g/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用单叠氮丙锭处理的条件为在4至10°C、1至100 μ g/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用补骨脂素处理的条件为在25至37°C、1X 10_5至10 μ g/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用4，5’，8-三甲基补骨脂素处理的条件在25至37°C、I X 10_5至10 μ g/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用8-甲氧基补骨脂素处理的条件为在25至37°C、I X Kr5至10 μ g/ml的终浓度下处理5分钟至48小时。
[0135](2)步骤 b)
[0136]接下来，用具有350nm至700nm波长的光照射包含交联剂的各试验样品。
[0137]与微生物的活 细胞的细胞壁相比，交联剂可容易地穿过死细胞和损伤细胞的细胞壁。因此，如果在上述时间段内进行处理，认为交联剂基本上不穿过微生物的活细胞的细胞壁，但穿过微生物的损伤或死细胞或死亡体细胞的细胞壁。结果，认为交联剂移入死亡体细胞、死亡和损伤的微生物细胞，并随后与染色体DNA或RNA形成氢键，然后用具有350nm至700nm波长的光照射的交联剂与DNA分子交联或与RNA共价结合，结果引发染色体DNA的变形或RNA被交联剂修饰，最终导致染色体DNA破坏(disruption)(片段化(fragmentation) /切割(cleavage)),或者RNA不行使核酸扩增反应模板的作用。
[0138]具有350nm至700nm波长的光可包括至少具有350nm至700nm波长的光，光可为单波长光或多波长光。此外，所有光组分可在350nm至700nm的范围内，或光可包括具有短于350nm波长的短波长光和/或具有长于700nm波长的长波长光。强度分布中的峰优选在350nm至700nm的范围内。优选地，所述光不包括仅由光照射就达到切割微生物的染色体DNA的程度的短波长组分。
[0139]当损伤或死细胞的染色体DNA比微生物的活细胞的染色体DNA更优选地破坏时，通过核酸扩增法扩增活细胞的染色体DNA的目标区域，而损伤或死细胞的目标区域破坏(切割)，导致抑制核酸扩增反应。结果，能够比损伤或死细胞更有选择性地检测微生物的活细胞。
[0140]此外，当损伤或死细胞的RNA比微生物活细胞的RNA更优选地被交联剂修饰时，通过核酸扩增法扩增活细胞的RNA的目标区域，而损伤或死细胞的RNA的目标区域被修饰，导致抑制核酸扩增反应。结果，能够比损伤或死细胞更有选择性地检测微生物的活细胞。[0141]在本发明的优选实施方案中，交联剂为单叠氮乙锭，所述方法包括用具有350nm至700nm波长的光照射添加了单叠氮乙锭的试验样品。与微生物活细胞的细胞壁相比，单叠氮乙锭(EMA)能够容易地穿过损伤或死细胞的细胞壁。因此，认为EMA基本上不穿过微生物的活细胞的细胞壁但穿过微生物的损伤或死细胞的细胞壁或者死亡体细胞的细胞膜。
[0142]注意，在血液中的白细胞和血小板为活细胞的情况下，EMA可更容易地穿过无菌水或低渗盐溶液中的细胞的细胞壁。
[0143]关于DNA，特别地，EMA移入死亡体细胞以及微生物的损伤和死细胞，并随机插入核DNA,插入的EMA通过用具有350nm至700nm波长的光照射,转换成氮宾(nitrene)并共价结合至核DNA从而交联DNA分子。然后，推定在多处共价结合至染色体DNA的碱基和脱氧核糖的EMA引起染色体DNA的大规模变形，导致染色体DNA的破坏(片段化)。
[0144]另外，关于双链RNA(包括部分双链RNA)，EMA移入死亡体细胞以及微生物的损伤和死细胞并随机插入RNA，然后插入的EMA通过用具有350nm至700nm波长的光照射，传换成氮宾并共价结合至RNA从而交联RNA分子。然后，推定在多处共价结合至RNA的碱基的EMA引起RNA的大规模变形，导致RNA的破坏(片段化)。
[0145]此外，关于单链DNA或RNA，推定EMA移入死亡体细胞以及微生物的损伤和死细胞，然后通过用具有350nm至700nm波长的光照射，插入的EMA转换成氮宾，共价结合至DNA或RNA。
[0146]只要与微生物的活细胞的细胞壁相比交联剂可更容易地穿过损伤或死细胞的细胞壁，且交联剂通过用具有350nm至700nm波长的光(长波长紫外光或可见光)照射可交联DNA或共价结合至RNA从而破坏染色体DNA或修饰RNA，则还可使用除单叠氮乙锭以外的交联剂。
[0147]可适当地设定EMA处`理的条件。例如，能够容易地识别微生物的活细胞与死细胞和损伤细胞的条件可通过以下来设定:向待检测微生物的活细胞以及损伤细胞或死细胞的悬浮液添加各种浓度的EMA，静置各种时间段，然后用可见光照射它们，如需要通过离心等除去细胞，并通过核酸扩增法进行分析。还可通过使用各种照射时间进行如上所述的实验来适当地设定光照射的优选条件。光照射条件的具体实例包括在距离试验样品10至50cm处用100至750W和前述波长的光的照射5分钟至2小时。光的照射优选在低温，例如用冰冷却样品下进行。
[0148]在前述步骤a)中交联剂的添加和步骤b)的光照射处理可重复2个以上的循环。在此情况下，优选使在第一次的步骤a)中交联剂的浓度与第二次或以后的步骤a)中的相比更高，并使第二次或以后的步骤a)中交联剂的浓度与第一次的步骤a)中的相比更低。
[0149]例如，如果使EMA在高浓度例如10 μ g/ml以上起作用，尽管死细胞的细胞壁或细胞膜的通透性变得更高，但活细胞的通透性也变高(Microbiology and Immunology, 2007,51,pp.763-775;Journal of Clinical Microbiology, 2008, 46, pp.2305-2313)? 另一方面，如果使EMA在低浓度例如低于10 μ g/ml起作用，尽管可避免渗透入活细胞，但进入死细胞的渗透率也降低，因此，死细胞也可通过核酸扩增反应检测。因此，优选在第一次的步骤a)中使用高浓度的交联剂，并在第二次和以后的步骤b)中调低交联剂的浓度。
[0150]具体地，第一次的步骤a)中交联剂的终浓度，例如，在单叠氮乙锭的情况下为10至100 μ g/ml、在双叠氮乙锭的情况下为10至100 μ g/ml、在单叠氮丙锭的情况下为10至100 μ g/ml、在补骨脂素的情况下为2X 10_5至10 μ g/ml、在4，5’，8-三甲基补骨脂素的情况下为2 X Kr5至10 μ g/ml或在8-甲氧基补骨脂素的情况下为2 X 10-5至10 μ g/ml。另外，在第二次和以后的步骤a)中的交联剂的终浓度，例如，在单叠氮乙锭的情况下为I至10 μ g/ml、在双叠氮乙锭的情况下为I至10 μ g/ml、在单叠氮丙锭的情况下为I至10 μ g/ml、在补骨脂素的情况下为I X 10_5至9 μ g/ml、在4，5’，8-三甲基补骨脂素的情况下为I X 10_5至
9μ g/ml或在8-甲氧基补骨脂素的情况下为1X10_5至9μ g/ml。
[0151]另外，优选使第一次的步骤a)的处理时间短于第二次和以后的步骤a)的处理时间。具体地，第一次的步骤a)的处理时间为，例如，在单叠氮乙锭的情况下为5分钟至I小时、在双叠氮乙锭的情况下为5分钟至I小时、在单叠氮丙锭的情况下为5分钟至I小时、在补骨脂素的情况下为5分钟至I小时、在4，5’，8-三甲基补骨脂素的情况下为5分钟至I小时或在8-甲氧基补骨脂素的情况下为5分钟至I小时。在第二次和以后的步骤a)的处理时间，例如，在单叠氮乙锭的情况下为6分钟至48小时、在双叠氮乙锭的情况下为6分钟至48小时、在单叠氮丙锭的情况下为6分钟至48小时、在补骨脂素的情况下为6分钟至48小时、在4，5’，8-三甲基补骨脂素的情况下为6分钟至48小时或在8-甲氧基补骨脂素的情况下为6分钟至48小时。
[0152]在前一循环的步骤b)和后一循环的步骤a)之间，可加入除去未反应的交联剂的步骤。此外，在步骤b)和以下描述的步骤c)之间，可添加除去交联剂的步骤。步骤a)中未反应的交联剂在步骤b)中通常基本上失活。因此，作为除去交联剂的方法，提及离心试验样品以便将包含微生物的沉淀与包含交联剂的上清液分离并除去上清液的方法。在该情况下，除去交联剂后，可任选地添加用洗涤剂洗涤微生物的步骤。
[0153]⑶步骤c)
[0154]然后，在用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的存在下，在不从细胞中提取核酸的情况下，通过核酸扩增法来扩增在光照射处理后包含于试验样品中的微生物的DNA或RNA的目标区域。
`[0155]具体地，向包含试验样品的核酸扩增反应溶液中添加用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂，并进行核酸扩增反应。
[0156]此外，除了用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂以外，可向扩增反应溶液中添加表面活性剂、镁盐或有机酸盐或磷酸盐。这些物质可独立使用或这些的任意两种以上作为组合物来使用。特别优选添加所有这些物质。不限定用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂、表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐的添加顺序，并且它们可同时添加。
[0157]核酸扩增抑制物是抑制核酸扩增反应或核酸延伸反应(extension reaction)的物质，其实例包括吸附到核酸(DNA或RNA)模板的正电性抑制物和吸附到核酸生物合成酶(DNA聚合酶等)的负电性抑制物等。正电性抑制物的实例包括钙离子、多胺和血红素等。负电性抑制物的实例包括苯酚、苯酚类化合物、肝素和具有外膜的革兰氏阴性菌细胞壁等。据说此类抑制核酸扩增反应的物质大量地存在于食品或临床试验样品中。
[0158]上述用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的实例包括选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。聚乙二醇的实例包括聚乙二醇400和聚乙二醇4000。甜菜碱的实例包括三甲基甘氨酸及其衍生物等。磷酸化酶和乳糖脱氢酶的实例包括兔肌糖原磷酸化酶和乳糖脱氢酶。作为糖原磷酸化酶，优选糖原磷酸化酶b。
[0159]特别优选使用白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白或溶菌酶。
[0160]作为降低包含于试验样品(假设为血液、粪便和肉类)中的核酸扩增抑制物的抑制作用的尝试，评价通过向PCR反应混合物中添加如上所述的物质的抑制作用的降低(AbuAl-Soud, W.等人，Journal of Clinical Microbiology, 38:4463-4470，2000)。
[0161]教导存在以下可能:典型实例为BSA(牛血清白蛋白)的白蛋白可通过结合至核酸扩增抑制物如血红素来降低核酸扩增的抑制(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，认为存在两种可能性，即，T4噬菌体基因32编码蛋白为单链DNA结合蛋白，其在核酸扩增过程中预先与充当模板的单链DNA结合以避免核酸酶对模板的降解，并且不抑制而是促进核酸扩增反应，或者其与核酸扩增抑制物如BSA结合从而不抑制而是促进核酸扩增反应(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，进一步教导以下可能性:BSA、T4噬菌体基因32编码蛋白和蛋白酶抑制剂与蛋白酶结合以减少蛋白水解活性，从而最大程度地显示核酸生物合成酶的作用。事实上，蛋白酶可保留在牛的乳或血液中，还报道了一个实例，在此情况下，通过添加BSA或蛋白酶抑制剂(如，大豆胰蛋白酶抑制剂和α2-巨球蛋白)避免了核酸生物合成酶的分解，核酸扩增反应有利地进行(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，葡聚糖通常为使用葡萄糖作为原料通过乳酸菌合成的多糖，也有报道称类似的多糖和称为粘蛋白的肽的复合体粘附到肠粘膜上(Ruas-Madiedo, P.，Applied and EnvironmentalMicrobiology, 74:1936-1940, 2008)。因此,可估计葡聚糖预先吸附到负电性抑制物(吸附到核酸生物合成酶)或正电性抑制物(吸附到核酸)，然后与这些抑制物结合。
[0162]此外，估计溶菌酶吸附到被认为在牛乳中大量存在的核酸扩增抑制物(如上所述的 Abu Al-Soud 等人)。
[0163]综上所述，如上所`述以白蛋白、T4噬菌体基因32编码蛋白、葡聚糖和溶菌酶为代表的此类物质为用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂。
[0164]白蛋白的实例包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、乳清蛋白和人血清白蛋白等。其中，优选牛血清白蛋白。白蛋白可为纯化产物，除非降低本发明的作用，否则白蛋白可包含其他组分如球蛋白。此外，白蛋白还可为分级产物(fractionation product)。试验样品(核酸扩增反应溶液)中白蛋白的浓度，例如，通常为0.0001至I质量％，优选0.01至I质量％，更优选0.2至0.6质量％。
[0165]葡聚糖的实例包括葡聚糖40和葡聚糖500等。其中，优选葡聚糖40。试验样品(核酸扩增反应溶液)中葡聚糖的浓度，例如，通常为I至8%，优选I至6%，更优选I至4%。
[0166]试验样品(核酸扩增反应溶液)中T4噬菌体基因32编码蛋白(如，由RochA.G.生产的T4噬菌体基因32编码蛋白，也称为gp32)的浓度通常为0.01至1%，优选0.01至0.1%，更优选0.01至0.02%。
[0167]溶菌酶的实例包括源于蛋清的溶菌酶。试验样品(核酸扩增反应溶液)中溶菌酶的浓度，例如，通常为I至20 μ g/ml,优选6至15 μ g/ml,更优选9至13 μ g/ml。
[0168]表面活性剂的实例包括非离子表面活性剂如曲拉通(Triton, Union Carbide注册商标)、诺乃(Nonidet, Shell)、吐温(Tween, ICI的注册商标)和玻雷吉(Bri j, ICI的注册商标)系列的那些，阴离子表面活性剂如SDS (十二烷基磺酸钠)，以及阳离子表面活性剂如十八烷基二甲基苄基氯化铵。曲拉通系列表面活性剂的实例包括曲拉通X-1OO等，诺乃系列表面活性剂的实例包括诺乃P-40等，吐温系列表面活性剂的实例包括吐温20、吐温40、吐温60、吐温80等，玻雷吉系列表面活性剂的实例包括Bri j56等。
[0169]核酸扩增反应溶液中表面活性剂的类型和浓度不特别限定，只要促进PCR试剂渗入微生物细胞并且基本上不抑制核酸扩增反应即可。具体地，SDS的浓度，例如，通常为
0.0005 至 0.01%、优选 0.001 至 0.01%、更优选 0.001 至 0.005%，还更优选 0.001 至 0.002%。对于其他表面活性剂，例如，在诺乃P-40的情况下，浓度通常为0.001至1.5%、优选0.002至1.2%、更优选0.9至1.1%。在吐温20的情况下，浓度通常为0.001至1.5%、优选0.002至
1.2%、更优选0.9至1.1%。在Brij56的情况下，浓度通常为0.1至1.5%、优选0.4至1.2%、更优选0.7至1.1%。
[0170]当表面活性剂包含在用于核酸扩增反应的酶溶液中时，表面活性剂可仅由源于酶溶液的表面活性剂组成，或可进一步添加相同类型或不同类型的表面活性剂。
[0171]镁盐的实例包括氯化镁、硫酸镁和碳酸镁等。试验样品(核酸扩增反应溶液)中镁盐的浓度，例如，通常为I至10mM、优选2至6mM、更优选2至5mM。
[0172]有机酸盐的实例包括柠檬酸、酒石酸、丙酸和丁酸等的盐。盐的种类的实例包括钠盐和钾盐等。此外，磷酸盐的实例包括焦磷酸等的盐。这些可独立使用或其两种或三种以上作为混合物使用。试验样品(核酸扩增反应溶液)中有机酸盐或磷酸盐的浓度，例如，依据总量通常为0.1至20mM、优选I至10mM、更优选I至5mM。
[0173]常规方法中，在核酸扩增反应前进行从细胞的核酸提取，而在本发明中不进行此类核酸提取。从细胞的核酸提取意指，例如，从由酶学或物理方法破坏或溶解的细胞中收集或纯化核酸。在本发明中，不进行从细胞提取核酸的此类处理，例如，通过酶学或物理方法破坏或溶解细胞来收集或纯化核酸的处理。
`[0174]在用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂以及如果需要的其他组分的存在下，通过核酸扩增法扩增已存在于细胞中的DNA或RNA的目标区域。作为用于核酸扩增的模板，使用微生物细胞悬浮液或用蛋白质降解酶、脂质降解酶、糖类降解酶等处理的微生物细胞悬浮液，不进行用于制备模板的核酸的提取。核酸扩增法优选包括在高温例如90至95°C、优选93至95°C、更优选94至95°C下热变性核酸的步骤。
[0175]优选在微生物细胞中进行目标区域的扩增。在本发明中，如实施例所示，在微生物细胞中极有可能获得扩增。即，推定在核酸扩增反应中通过高温处理来维持细胞形态，并且在优选的实施方案中，前述组分的作用，从而染色体DNA保留在细胞内，但由于在微生物的细胞膜或细胞壁中形成孔或空隙，因此核酸扩增等所需的引物、酶流入细胞，在细胞内发生扩增反应，然后取决于扩增产物的基因长度，一部分扩增产物保留在细胞中或流出细胞外。然而，也不能否认染色体DNA或RNA的极小部分通过细胞膜或细胞壁的孔或空隙流出细胞外的可能性。
[0176]在任何情况下，在基本上无细胞的破坏或溶解的情况下，核酸扩增所需的组分如引物流入细胞、一部分扩增产物保留在细胞中或从细胞流出，以及染色体DNA或RNA从细胞流出不包括在“核酸提取”中。此外，尽管不能否定除上述以外的机制的存在，但是即使在此情况下，所述方法也遵守“不进行核酸提取”的定义，只要不进行通过例如酶学或物理方法破坏或溶解细胞收集或纯化核酸的处理即可。[0177]此外，即使当从细胞流出的染色体DNA或RNA充当模板，并且在细胞外发生核酸扩增反应时，如果主要的扩增产物形成于细胞内，则可以说核酸扩增反应“在微生物细胞内进行”。具体地，例如，如果80%以上、优选90%以上、更优选99%以上的扩增产物形成于微生物细胞内，可判断核酸扩增反应在微生物细胞内进行。
[0178]核酸扩增法的实例包括PCR法(White,T.J.等人，Trends Genet.，5，185(1989))、LAMP 法(环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification): Principaland application of novel gene amplification method(LAMP method), TsugunoriNotomi, Toru Nagatani, BIO INDUSTRY, Vol.18，N0.2，15-23，2001)、SDA 法(链置换扩增(Strand Displacement Amplification):Edward L.Chan 等人,Arch.Pathol.Lab.Med.，124:1649-1652，2000)、LCR 法(连接酶链反应(Ligase Chain Reaction):Barany, F., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.88, p.189-193，1991)、TMA 法(转录介导的扩增(Transcription-Mediated-Amplification):Sarrazin C.等人，J.Clin.Microbiol.,vol.39:pp.2850-2855 (2001))、TRC 法(转录-反转录协同法(Transcription-ReverseTranscription-Concerted method):Nakaguchi Y.et al., J.Clin.Microbiol., vol.42:pp.4248-4292 (2004))、HC 法(杂交捕获法(Hybrid Capture):Nazarenko 1., KobayashiL.et al., J.Virol.Methods, vol.154:pp.76-81，2008)和微阵列法(Richard P.Spence 等人，J.Clin.Microbiol.，Vol.46，N0.5，pp.1620-1627，2008)等。在本发明中，尽管 PCR 法是特别优选使用的，但核酸扩增法不限定于此。
[0179]在本发明中，“目标区域”不特别限定，只要选择可通过使用本发明的引物的PCR来扩增并使待检测的微生物能够检测的染色体DNA或RNA的区域即可，其可取决于目的而适当地选择 。例如，当不同于待检测微生物细胞的类型的细胞包含于试验样品中时，目标区域优选包含对待检测微生物特异的序列。进一步，取决于目的，目标区域可为包含多种微生物的共有序列的一种目标区域。此外，目标区域可由单一区域或两个以上区域组成。如果使用适于特异于待检测微生物的目标区域的引物对(primer set)和适于众多种微生物的染色体DNA的引物对，则可同时测量作为监测对象的微生物的活细胞量和众多种微生物的活细胞量。目标区域的长度，例如，通常为50至5000个核苷酸。
[0180]用于核酸扩增的引物可基于各种核酸扩增法的原理来选择，并不特别限定，只要该引物可特异性扩增上述目标区域即可。
[0181]目标区域的优选实例包括各种特异性基因如5S rRNA基因、16S rRNA基因、23SrRNA基因、tRNA基因和致病基因。可以将这些基因的任一或这些基因的任一的一部分作为靶标，或可以将延伸至两种以上基因的区域作为靶标。例如，对于大肠菌(coliformbacteria)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌而言，可通过使用SEQ ID N0S:1和2所示的引物对来扩增16SrRNA基因的一部分。进一步，可通过使用SEQ ID N0S:3和4所示的引物对来扩增延伸至16S rRNA基因的一部分、tRNA基因和23S rRNA基因的一部分的区域。
[0182]在检测的目标微生物为病原菌时，目标区域可以是致病基因。致病基因的实例包括:李斯特菌属细菌的李斯特菌素0(hlyA)基因；沙门氏菌属细菌的肠毒素基因和侵袭基因(invA);病原性大肠杆菌0-157、0-26、0-111等的veix)细胞毒素基因；肠杆菌属细菌的外膜蛋白A(ompA)基因(阪崎肠杆菌)和大分子合成(MMS)操纵子(阪崎肠杆菌)；军团菌属细菌的巨卩遼-侵入蛋白(mip)基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐热溶血素基因和耐热类溶血素毒素基因；痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)和肠侵袭性大肠杆菌的ipa基因(invasion plasmid antigen gene,侵袭质粒抗原基因)和invE基因(侵袭基因)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的肠毒素基因；腊状芽孢杆菌的呕吐毒素(cereulide)基因和肠毒素基因和肉毒梭状芽孢杆菌的各种毒素基因等。此外，致病基因的引物的实例包括，例如，对于李斯特菌属细菌的hlyA基因为SEQ ID NOS:5和6所示的引物对；对于阪崎肠杆菌的ompA基因为SEQ ID N0S: 7和8所示的引物对；以及对于阪崎肠杆菌的丽S操纵子为SEQ ID N0S:9和10所示的引物对。
[0183]此外，在具有包膜的流感病毒的情况下，目标区域的实例包括血凝素(H蛋白)基因和神经氨酸酶(N蛋白)基因,杯状病毒(Calicivirus)科病毒(其典型实例包括诺如病毒(noroviruses))的RNA聚合酶基因，和编码各种衣壳蛋白的基因区域等。作为食物中毒病毒，除了诺如病毒以外，还有轮状病毒和腺病毒，在诺如病毒的情况下，作为目的基因，其RNA聚合酶基因和编码各种衣壳蛋白的基因区域可用作目标区域。
[0184]如果使用适于两种以上微生物的引物，可检测试验样品中两种以上微生物的活细胞。此外，如果使用特异于特定细菌的一种引物或多种引物，可检测试验样品中特定细菌的活细胞。
[0185]核酸扩增反应的条件不特别限定，只要基于各种核酸扩增法(如PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA、TRC、HC、微阵列法等)的原理可特异性地扩增核酸即可，并且条件可适当地设置。
[0186](4)步骤 d)
[0187]随后，分析通过核酸 扩增法所获得的扩增产物。扩增产物的分析在步骤c)后进行，或与步骤c)同时进行，取决于步骤c)中所采用的核酸扩增法。例如，在使用实时PCR的情况下，步骤d)可与步骤c)同时进行。
[0188]分析方法不特别限定，只要该方法可检测或定量核酸扩增产物即可，其实例包括电泳。注意，对于核酸扩增法在使用PCR法的情况下,可使用实时PCR法(ogva等人，Appl.Environ.Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271; Nogva 等人,App1.Environ.Microbiol? , vol.66, 2000, pp.4029-4036)。
[0189]电泳能够评价核酸扩增产物的量和大小。此外，实时PCR能够快速定量PCR扩增产物。
[0190]在采用实时PCR的情况下，如果扩增的循环数在I至10的范围内，则荧光强度的变化通常为噪音级(noise level)并在零左右。因此，所述强度被认为是不包含扩增产物的空白样品。计算变化的标准差(SD)，通过将SD值乘以10所获得的值定义为阈值。将第一次实现大于阈值的值的PCR循环数称为“循环阈值(Ct值)”。因此，在PCR反应液中DNA模板的起始量越大，Ct值越小，而模板DNA的量越小，Ct值越大。即使模板DNA的量相等，在对于该区域的PCR反应中，PCR的目标区域已切割的模板比例越高，Ct值越大。
[0191]此外，扩增产物的有无还可通过分析扩增产物的解链温度(TM)谱(meltingtemperature pattern)来石角定。
[0192]所有前述方法还可用于优化本发明方法的各种条件。
[0193]当通过本发明的方法检测微生物的活细胞时，在PCR扩增产物的分析中确定微生物活细胞有无及其定量的精度可通过使用标准曲线来增加，所述标准曲线表示微生物的量和扩增产物之间的关系并通过使用微生物标准样品(其中微生物已鉴定)来制备。尽管可使用初步制备的标准曲线，但优选对标准样品与试验样品同时通过进行本发明方法的步骤来制备的标准曲线。此外，如果事先已确定了微生物的量与DNA或RNA的量之间的关系，则从微生物中分离的DNA或RNA也可用作标准样品。
[0194]<2>本发明的试剂盒
[0195]本发明的试剂盒为利用核酸扩增法通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测试验样品中微生物的活细胞的试剂盒，所述试剂盒包括通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合DNA或RNA的试剂、用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂以及通过核酸扩增法扩增待检测微生物的DNA或RNA的目标区域的一种或多种引物。本发明的试剂盒可用于实现本发明的方法。
[0196]此外，本发明的试剂盒可进一步包括选自表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐中的任何一种或多种。
[0197]此外，本发明的试剂盒可进一步包括具有分解存在于试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶。
[0198]酶、能够共价结合DNA或RNA的试剂和用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂，以及如需要时的表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐，可为包含所有这些组分的单一组合物的形式，或包含任意组合的组分的两种或多种溶液或组合物的形式。
[0199]核酸扩增反应优选PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA, TRC, HC或微阵列法。试剂盒中的交联剂和培养基与本发明的方法所述的交联剂和培养基相同。
[0200]在本发明的试剂盒`的优选实施方案中，能够共价结合DNA或RNA的试剂优选选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、单`叠氮丙锭、补骨脂素、4，5’，8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。特别优选使用单叠氮乙锭。
[0201]此外，用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的实例包括选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。
[0202]此外，镁盐的实例包括氯化镁、硫酸镁和碳酸镁等。
[0203]此外，有机酸盐的实例包括柠檬酸、酒石酸、丙酸和丁酸等的盐。盐的种类的实例包括钠盐和钾盐等。此外，磷酸盐的实例包括焦磷酸的盐等。这些可独立使用或以其两种或三种以上的混合物使用。
[0204]此外，所述酶不特别限定，只要其可降解存在于试验样品中的异物如除微生物以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质和糖类，并且不损害待检测微生物的活细胞即可，所述酶的实例包括脂质降解酶、蛋白质降解酶和糖类降解酶。其中，可使用一种酶或两种以上酶，但优选使用脂质降解酶和蛋白质降解酶二者，或脂质降解酶、蛋白质降解酶和糖类降解酶全部。
[0205]脂质降解酶的实例包括脂肪酶和磷酸酶等，蛋白质降解酶的实例包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶等，以及糖类降解酶的实例包括淀粉酶和纤维素酶等。
[0206]本发明的试剂盒可进一步包括稀释液、能够共价结合DNA或RNA的试剂的反应用反应液、核酸扩增用酶和反应液以及描述本发明的方法的说明书等。
[0207]实施例[0208]在下文中，参考以下实施例更具体地描述本发明。然而，本发明不受限于这些实施例。
[0209][实施例1]
[0210]通过使用阪崎肠杆菌作为大肠菌的典型细菌，检测用于明确识别活细胞和死细胞的条件。
[0211]1.试验材料和培养方法
[0212]1-1)使用菌株和培养方法
[0213]在37°C下通过使用脑心浸液肉汤(Brain Heart Infusion Broth) (BHI肉汤:Eiken Chemical C0., Ltd., Tokyo, Japan)培养阪崎肠杆菌 ATCC5132916 个小时。将 5ml 体积培养肉汤(culture broth)放入 15ml falcon 管(Becton Dickinson Labware, NJ)中，并在4°C和3，000XG下进行冷冻离心10分钟，除去上清液，然后向沉淀物添加5ml生理盐水从而制备阪崎肠杆菌的活细胞悬浮液原液(stock) (8.95±0.01log10细胞/ml, n=2)。进一步，用生理盐水将该活细胞悬浮液稀释10倍从而制备阪崎肠杆菌的活细胞悬浮液(7.95±0.01log10 细胞 /ml, n=2)。
[0214]进一步,将Iml前述活细胞悬浮液原液放入1.5ml体积的小离心管(microtube)(Eppendorf, Hamburg, Germany),将管浸入沸水50秒并急冷(quench),证实此后的细菌在标准琼脂培养基(Eiken, Tokyo, Japan)上不形成任何菌落,从而制备阪崎肠杆菌的损伤细胞悬浮液原液。在标准琼脂培养基上对活细胞悬浮液中阪崎肠杆菌的活细胞数计数，同时通过使用分光光度计U-2800A (Hitachi, Japan)在600nm波长下进行比池法从而计算出活细胞数与浊度间的关系 。
[0215]进一步，用市售巴氏消毒牛乳将活细胞悬浮液原液稀释10倍从而制备阪崎肠杆菌的活细胞乳悬液(7.95 + 0.01log10细胞/ml, n=2)。
[0216]此外，用市售巴氏消毒牛乳将损伤细胞悬浮液原液稀释10倍从而制备阪崎肠杆菌的损伤细胞乳悬液(7.95 + 0.01log10细胞/ml, n=2)。
[0217]1-2)单叠氮乙锭(EMA)处理和光照处理
[0218]用无菌水将单叠氮乙锭(EMA, Sigma, St.Louis, MO)溶解为1000 μ g/ml,并用0.20 μ m 的过滤器(Minisart-plus, Sartorius AG, Gottingen, Germany)进行过滤灭菌从而制备原液，该原液在-20°C下避光保存。
[0219]将体积为10 μ I的EMA溶液(1000 μ g/ml)加入阪崎肠杆菌的活细胞和损伤细胞的悬浮液(Iml)中，将悬浮液于4°C下避光静置10分钟。然后，悬浮液置于距可见光源(100VPRF500W Flood eye, Iwasaki Electric C0., Ltd., Tokyo, Japan) 20cm 的位置，并在冰上用光照射5分钟。在4°C和15，000XG下将各EMA处理的样品进行冷冻离心10分钟，除去上清液，然后加入Iml生理盐水洗涤沉淀物，向沉淀(细胞)加入10 μ I无菌水以在无菌水中悬浮细胞，使用5μ I悬浮液作为PCR扩增用样品。
[0220]通过以下方法使阪崎肠杆菌的活细胞和损伤细胞乳悬液(Iml)进行EMA处理和光照射处理。首先，在4°C和15，000XG下使各阪崎肠杆菌的活细胞和损伤细胞乳悬液(Iml)进行冷冻离心10分钟，除去上清液，然后加入Iml生理盐水。添加体积为3μ I的蛋白酶(源于芽孢杆菌属细菌，Sigma)从而在37°C下用蛋白酶处理细胞I小时，然后使悬浮液进行冷冻离心(4°C，15，000XG, 10分钟)，除去上清液，添加Iml生理盐水，然后避光添加10μ IEMA溶液(1000 μ g/ml)。此后所使用的方法与前述“阪崎肠杆菌的活细胞和损伤细胞悬浮液(1ml)”所描述的方法相同。
[0221]1-3) PCR 扩增
[0222]向5 μ I PCR扩增用样品中添加包括二水合柠檬酸三钠(TSC，Kanto, Kagaku)和六水氯化镁(Nakara1-Tesque)的试剂和进一步包含选自牛血清白蛋白(BSA, Sigma)、葡聚糖(低分子，M.W.:50,000至70，000，Nakara1-Tesque)、T4噬菌体基因32编码蛋白(gp32,Nippon Gene)、十二烷基硫酸钠(SDS, Nakara1-Tesque)、Bri j56 (Sigma)和蛋清溶菌酶(Wako pure chemical Industries)中的一种或多种的试剂。添加到PCR扩增用样品并具有各组成的各试剂还可称为预处理剂。以下示出预处理剂的组成。[0223]组成1:
[0224]2%BSA:5y I
[0225]50mM TSC:1 μ I
[0226]IOOmM MgCl2:1.5 μ I
[0227]0.05%SDS:ly I
[0228]组成2:
[0229]2%BSA:5y I
[0230]50mM TSC:1 μ I
[0231]IOOmM MgCl2:1.5 μ I
[0232]组成3:
[0233]20%葡聚糖:2.5μ I
[0234]50mM TSC:1 μ I
[0235]IOOmM MgCl2:1.5 μ I
[0236]组成4:
[0237]0.1%gp32:5 μ I
[0238]50mM TSC:1 μ I
[0239]IOOmM MgCl2:1.5 μ I
[0240]组成5:
[0241]2%BSA:5y I
[0242]50mM TSC:1 μ I
[0243]IOOmM MgCl2:1.5 μ I
[0244]4%Bri j56:12.6 μ I
[0245]组成6:
[0246]2%BSA:5y I
[0247]50mM TSC:1 μ I
[0248]IOOmM MgCl2:1.5 μ I
[0249]500 μ g/ml 蛋清溶菌酶:1.0 μ I
[0250]组成7:
[0251]2%BSA:5y I
[0252]50mM TSC:1 μ I[0253]IOOmM MgCl2:1.5 μ I
[0254]0.05%SDS:ly I
[0255]4%Brij56:12.6μ I
[0256]500 μ g/ml 蛋清溶菌酶:1.0 μ I
[0257]组成8:
[0258]2%BSA:5y I
[0259]50mM TSC:1 μ I
[0260]IOOmM MgCl2:1.5 μ I
[0261]4%Brij56:12.6μ I
[0262]500 μ g/ml 蛋清溶菌酶:1.0 μ I
[0263]组成9:
[0264]2%BSA:5y I
[0265]组成10:
[0266]仅由下述组分a)至g)组成的PCR缓冲液，不包含组成I至9的组分
[0267]对于PCR扩增，使用引物F:用于16S rRNA基因检测的正向引物16S_10F (5’-AGTTTGATCCTGGCTC-3’，SEQ ID NO:1)`和引物 R:用于 16S rRNA 基因检测的反向引物 16S_1500R(5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’，SEQ ID NO:2)作为 PCR 引物。
[0268]进一步,为了在实时PCR后的扩增产物解链分析(melt analysis)中使取决于温度的荧光物质量的变化最大化(引物微分峰)从而进行高灵敏度检测，制备了由以下组分a)至g)组成的PCR缓冲液，并通过向PCR扩增用样品和预处理剂的混合物中添加该PCR缓冲液来进行PCR扩增。
[0269]前述引物的靶标为包括16S rRNA基因的第10至第1500位核苷酸的长DNA(1491bp)。
[0270]a)引物 F(10pmol/μ I):4 μ I
[0271]b)引物 R(10pmol/y I):4μ I
[0272]c) Ex-Taq (5U/ μ I, Takara-Biο): 0.5 μ I
[0273](包含0.5%吐温20、0.5%诺乃P-40和50%甘油)
[0274]d) IOXEx-Taq 缓冲液(Takara-Bio): 5 μ I
[0275]e) dNTP 混合物(Takara-Bio): 4 μ I
[0276]f) 10 X SYBR Green I (BMA): 8 μ I
[0277]g)无菌水:为获得包括PCR扩增用样品5 μ I和预处理剂的55 μ I总体积所需的体积
[0278]通过使用实时PCR 装置(iCycler iQ，Bio-Rad，Hercules, CA)根据以下 PCR 热循环条件进行实时PCR。
[0279]1)4°C 3分钟(I个循环)
[0280]2) 940C 30 秒(I 个循环)
[0281]3) 940C 20 秒；55°C 30 秒；72°C I 分钟 30 秒(50 个循环)
[0282]4) 950C 3 分钟(I 个循环)
[0283]然后，根据PCR扩增产物的解链分析方案(每隔0.1°C从60°C升高温度，各温度维持8秒并重复该过程总计350次，至最终温度95°C度)，测定PCR扩增产物的解链温度。
[0284]作为阳性对照，使用阪崎肠杆菌的Slogltl细胞/ml活细胞悬浮液。进一步，作为空白样品，将无任何添加的PCR缓冲液本身用于PCR。
[0285]2.结果
[0286]实时PCR的结果示于表1。
[0287]表1中使用的符号a)至f)表示以下内容。此外，用于预处理剂的“Lyso”意指蛋清溶菌酶。
[0288]a)阪崎肠杆菌的活细胞数和损伤细胞数:7.95±0.01log10细胞/ml (生理盐水和市售巴氏消毒牛乳中)
[0289]b)通过将活细胞浸入沸水50秒制备的损伤细胞
[0290]c)意指无EMA处理
[0291]d)EMA处理(10 μ g/ml、10分钟、4°C避光)+可见光照射(5分钟)
[0292]e)用平均值土 SD (n=2)表示的实时PCR的Ct值
[0293]f)nd意指通过实时PCR未获得目标基因的扩增
[0294]表1
【权利要求】
1.一种通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测试验样品中微生物的活细胞的方法，所述方法为非诊断用途的方法并包括以下步骤: a)向所述试验样品添加通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂； b)用具有350nm至700nm波长的光照射添加了所述试剂的所述试验样品； c)在用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂、镁盐、和有机酸盐或磷酸盐的存在下，通过核酸扩增法，在不从所述细胞提取核酸的情况下扩增包含于所述试验样品的所述微生物的DNA或RNA的目标区域；和 d)分析扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在微生物细胞中进行所述目标区域的扩增。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤c)之前，重复进行步骤a)和b)。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤a)之前，进行以下步骤e): e)用具有分解存在于所述试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶处理所述试验样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述酶选自蛋白质降解酶、脂质降解酶和糖类降解酶。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述试验样品为食品、生物样品、饮用水、工业用水、环境用水、废水、土·壤和抽汲样品的任一种。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物为细菌或病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细菌为革兰氏阴性菌。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的所述试剂选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、单叠氮丙锭、补骨脂素、4，5’，8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂为选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述有机酸盐选自乙酸盐、丙酸盐和柠檬酸盐。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述磷酸盐为焦磷酸盐。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂至少包含溶菌酶。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤c)中，在表面活性剂的存在下进行所述目标区域的利用核酸扩增法的扩增。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目标区域为50至5，000个碱基的目标区域。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述目标区域为相应于选自所述试验样品的DNA的5S rRNA基因、16S rRNA基因、23S rRNA基因和tRNA基因中的基因的目标区域。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸扩增法为PCR、RT-PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA, TRC, HC或微阵列法。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述PCR作为实时PCR来进行，从而同时进行PCR和所述扩增产物的分析。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过使用表示所述微生物的量和所述扩增产物之间的关系的标准曲线来进行所述扩增产物的分析，所述标准曲线通过使用所述微生物的标准样品建立。
20.一种试剂盒，所述试剂盒在根据权利要求1或2所述的方法中使用并包括以下组分: 1)通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂； 2)用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂、镁盐、和有机酸盐或磷酸盐；和 3)用于通过核酸扩增法扩增待检测的微生物的DNA或RNA的目标区域的引物。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其进一步包括具有分解存在于所述试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶。
22.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述核酸扩增法为PCR、RT-PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA, TRC, HC或微阵列法。
23.根据权利要求20所述的试剂盒，其中通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的所述试剂选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、单叠氮丙锭、补骨脂素、4，5’，8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。
24.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂为选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。
25.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述有机酸盐选自乙酸盐、丙酸盐和柠檬酸盐。
26.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述磷酸盐为焦磷酸盐。
27.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂至少包含溶菌酶。
28.根据权利要求20所述的试剂盒，其进一步包括表面活性剂。
29.根据权利要 求21所述的试剂盒，其中所述酶选自蛋白质降解酶、脂质降解酶和糖类降解酶。
【文档编号】C12Q1/70GK103820578SQ201410067344
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2010年7月23日 优先权日:2009年7月24日
【发明者】副岛隆志, 弗兰克·施利特-迪特里希 申请人:森永乳业株式会社