斜带石斑鱼ctrp9基因、编码蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体公开了一种斜带石斑鱼ctrp9基因、编码蛋白及其应用。本发明首次克隆获得斜带石斑鱼gctrp9基因，并将该基因构建表达载体和重组酵母菌株，利用重组酵母菌种在体外获得大量表达的斜带石斑鱼gctrp9蛋白，该蛋白可以用于制备适合海水鱼类使用的促生长剂或添加剂。
【专利说明】斜带石斑鱼基因、编码蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及一种斜带石斑鱼基因、编码蛋白 及其应用，所述应用为在制备促生长剂或饲料添加剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪作为动物贮存能量的组织，在调节和控制机体的代谢中起着重要的作用，它 能分泌多种具有生物活性的细胞因子。在哺乳类动物中脂联素（Adiponectin)是一种由脂 肪细胞分泌的细胞因子蛋白，主要参与调节葡萄糖水平和脂肪的降解，其次还包括抗炎、抗 动脉粥样硬化、促血管形成因子和抗血管形成因子的特性。是与同源性 最近的CTRP家族的成员，由四个区域，第一个区域为信号肽；第二个区域为可变区；第三个 区域为胶原蛋白的相似区；最后一个区域为球状区，也为功能区。最近研究表明，与 有相同的功能，参与调节葡萄糖水平和脂肪的降解，还有参与摄食、抗炎作用、 免疫反应的功能，并且有实验证明CTRP9可能通过与结合，增加 AMPK/Akt/eNOS磷 酸化，增加血管活性。
[0003] 石斑鱼属鯧科，石斑鱼属（你，为暖水性的大中型海产 鱼类。石斑鱼营养丰富，肉质细嫩洁白，类似鸡肉，素有"海鸡肉"之称。石斑鱼又是一种低 脂肪、高蛋白的上等食用鱼，被港澳地区推为我国四大名鱼之一，是高档筵席必备之佳肴。 目前石斑鱼的饲料还是以动植物蛋白作为主要添加剂，然而动植物蛋白成本较高，如果能 够提高石斑鱼对糖脂的利用，对生产成本会有很大的降低，但目前在石斑鱼人工养殖中还 没有一种能有效促进糖脂利用的饵料添加剂。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种斜带石斑鱼基因，其核苷 酸序列如SEQ IDN0 :1所示。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种含有斜带石斑鱼狀基因的表达载体； 本发明的另一目的在于提供上述载体转化的酵母菌株； 本发明的另一目的在于提供了利用上述酵母重组酵母菌株得到重组斜带石斑鱼 gCTRP9的方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述基因在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应 用。
[0007] 本发明克隆了斜带石斑鱼的基因，并得到了 3'UTR和部分5'UTR。克隆的方 法是常规的基因克隆方法，利用同源物种的基因比对设计简并引物，经过PCR后得到中间 片段，然后根据中间片段的序列分别设计两个5' RACE的下游引物和两个3' RACE的上游引 物，在利用通用引物AAP和AUAP进行5 '和3 '嵌套PCR得到了 c 的0RF、5 ' UTR和3 ' UTR。 最后设计克隆0RF的引物，PCR后把得到目的基因连接到PCR2. 1载体为PCR2.
[0008] 本发明构建了含有斜带石斑鱼gCTRP9的毕赤酵母表达载体。这个载体的构建方 法是按常规方法，利用自己所构建的载体PCR2. 1- 为模板，通过PCR方法合成带有酶 切接头的斜带石斑鱼#基因，经酶切和分离纯化后，接入到已有的载体pPICZaA的相 应酶切位点（即EcoRI-HF和Notl)之间，即构建成所需的含有斜带石斑鱼狀基因的表 达载体pPICZaA-
[0009] 本发明还用上述含有斜带石斑鱼gcir/W基因的相应表达载体构建了能高效表达 斜带石斑鱼#基因的酵母重组株。
[0010] 本发明的上述能表达斜带石斑鱼gCTRP9酵母重组菌株优先由含有斜带石斑 鱼％基因的表达载体pPICZaA- 转化毕赤酵母X33而得到的菌株，命名为 pPICZaA- gctrp9~ X33〇
[0011] 本发明还提供了利用上述毕赤酵母重组株生产斜带石斑鱼gCTRP9的方法。先将 菌种接种在含有BMGY的液体培养基中，28°C，200转/分培养18-24小时，然后离心收集菌 体并重悬菌体于BMMY液体培养基中，并加入吐温-80,使其终浓度为0. 4%，28°C，200转/ 分培养，18-24小时后向培养液中加入甲醇，使终浓度为0. 5%，然后28°C，200转/分培养， 18-24小时后收集上清，经分离纯化得到重组斜带石斑鱼gCTRP9产品 斜带石斑鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的石斑鱼 gcir/W基因重组株pPICZaA- X33,生产重组斜带石斑鱼gCTRP9蛋白，并可进一步 用作制备适合海水鱼类使用的促生长剂或添加剂。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明首次克隆获得斜带石斑鱼#基因，并将该基因构建表达载体和重组酵母 菌株，利用重组酵母菌种在体外获得大量表达的斜带石斑鱼gCTRP9蛋白，该蛋白可以用于 制备适合海水鱼类使用的促生长剂或添加剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1.以斜带石斑鱼肝脏的反转录CDNA为模板进行PCR扩增中间片段产物 的凝胶电泳分析图，其中，M :Marker ;1 :PCR扩增产物；NC :阴性对照。
[0014] 图2. 5' RACE和3' RACE的PCR电泳图；A是5' RACE第一轮产物的凝胶电泳图，其 中M :Marker ;1、2、3 :PCR扩增产物；NC :阴性对照；B是5' RACE第二轮产物的凝胶电泳图， 其中M :Marker ;1、2、3 :PCR扩增产物；NC :阴性对照；C是3' RACE第一轮产物的凝胶电泳 图，其中M :Marker ;1、2、3 :PCR扩增产物；NC :阴性对照；D是3' RACE第二轮产物的凝胶电 泳图，其中M :Marker ;1、2、3 :PCR扩增产物；NC :阴性对照；E是克隆0RF的产物的凝 胶电泳图，其中M :Marker ;1、2、3 :PCR扩增产物；NC :阴性对照。
[0015] 图3 ;A是带酶切位点的PCR扩增凝胶电泳分析图，其中，M :Marker ;1、2、 3 :PCR扩增产物；NC :阴性对照；B是重组质粒pPICZaA-gcir/^的酶切鉴定凝胶电泳分析 图，其中，M :Marker ;1 :pPICZaA-gcir/^EcoRI-HF 和 Notl 双酶切；2 :pPICZaA-gcir/^ 未酶 切。
[0016] 图4 ;A是重组株pPICZaA-狀ir/^-X33表达产物gCTRP9的SDS-PAGE电泳分析图， 其中：Μ :蛋白Marker ; NC :阴性对照；1 :重组株pPICZaA-狀ir/^-X33表达产物；B和C是 重组株pPICZaA-狀ir/^-X33表达产物gCTRP9纯化产物的SDS-PAGE电泳分析图及Western blot鉴定图谱；其中，Μ :蛋白Marker ;1、2、3、4 :SDS-PAGE ;5、6、7、8 Western blot ; NC :阴 性对照。
[0017] 图5是重组斜带石斑鱼gCTRP9对斜带石斑鱼原代肝细胞葡萄糖产出的影响；其中 表示与对照组相比有显著性差异，P < 0. 01。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
[0019] 实施例1 ^基因中间片段的克隆 对已报道的红鳍东方飩（青斑河豚（ieiraot/o/? 三刺鱼(gasierosieiAs acWeates)，青鎌中所获得的 序列进行 比对，找到相对保守区域，设计克隆斜带石斑鱼cir/79序列中间片段的一对简并引物，上 游引物为 5' CCHGGRAAAATGGGVCCCCA 3'，下游引物为 5' AAGACRGTGATGTGRTAGGTRAAG 3' ;以 斜带石斑鱼肝脏RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR条件为：94 °C 3 min;94 °C 15 s，60 °C 15s，72 °C 40 s，35个循环；72 °C 5 min;4 Oc^PCR反应后的凝胶电泳图见图 1〇
[0020] 实施例 2 9 基因 5' RACE 和 3' RACE 根据已经获得的中间片段序列分别设计5' RACE和3' RACE各两条引物并利用通用引 物 AUAP 和 AAP。
[0021] 5' RACE上游引物为： AAP :5， GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG 3,、 下游引物分别为： R1 :5' TAGGGAGTTTACTTTGTGCTGTGAG 3' ； R2:5'ATATTGCCTTTGTGACCTGGAAC3' ； 3' RACE上游引物分别为： F1 :5' GAAGTTGGCCTTAGAGGTGACAGA 3' ； F2 :5' CTCACAGCACAAAGTAAACTCCCTA 3' ； 下游引物为 AUAP :5' GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3'。
[0022] 以斜带石斑鱼肾脏RNA反转录后的cDNA为模板做PCILPCR条件为：94 °C 3 min ; 94 °C 15 s，65 °C 15s，72 °C 90 s，35个循环；72 °C 5 min;4 °C ⑴。PCR反应后的凝胶 电泳图见图2中的A、B、C、D。
[0023] 实施例3 9 0RF的克隆 根据实施例1和实施例2的结果，设计一对克隆0RF的引物，上游引物 F-0RF的核苷酸序列为5' TTTTGCATTGTTGATAGATAGG3'、下游引物R-0RF的核苷酸序列为 5' AGACAGGCTGATTTCTTATGAC3'，以斜带石斑鱼肾脏RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR 条件为：94 °C 3 min;94 °C 15 s，59 °C 15s，72 °C 80 s，35 个循环；72 °C 10 min;4 °C °〇。经过PCR后把得到的产物与PCR2. 1载体连接在一起为PCR2. PCR反应后 的凝胶电泳图见图2中的E。
[0024] 实施例4 :带酶切位点的斜带石斑鱼基因合成 根据自己克隆到的斜带石斑鱼基因的序列及限制性内切酶EcoRI-HF和Notl 的识别序列以及保护碱基，设计合成一对特异性引物，上游引物F为5' CGGAATTCCATCATCA TCATCATCATCTTGTTATCTCTAAAAGCG3'是在狀基因的成熟肽序列前添加了 EcoRI-HF酶 切识别位点和 6Xhis 标签，下游引物 R 为 5' ATAGITTAGCGGCCGCCTAAGCCCCAAAGATTA3' 是 在#基因成熟肽序列后添加了终止密码子及Notl酶切识别位点。利用自己构建的 PCR2.1-cir/^ 为模板进行 PCR 反应，PCR 反应条件为：94 °C 2 min;94 °C 15 s，64 °C 30s，72 °C 40 s，35个循环；72 °C 10 min;4 扩增产物的电泳鉴定图见图3中 A〇
[0025] 实施例5 :含斜带石斑鱼基因的毕赤酵母表达载体pPICZaA- 的构 建 PCR产物用限制性内切酶EcoRI-HF和Notl双酶切后，酶切产物用E. Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化斜带石斑鱼狀斤/沿基因片段；载体 质粒pPICZaA经限制性内切酶EcoRI-HF和Notl双酶切后分离纯化，与分离纯化斜带石斑 鱼狀基因片段混合，用Τ0Υ0Β0 Ligtion High连接酶16°C连接过夜后用标准氯化钙转 化法转入大肠杆菌DH5a中，用低盐LB平板筛选具Zeocin抗性的转化子，以标准方法提取 质粒，用限制性内切酶EcoRI-HF和Notl双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别 与斜带石斑鱼基因和表达载体pPICZaA大小相同，证明斜带石斑鱼基因已 克隆入毕赤酵母表达载体PPICZaA中，重组质粒命名为pPICZaA-狀酶切分析图分别 见图3中的B。
[0026] 实施例6 :能高效表达斜带石斑鱼gCTRP9的毕赤酵母重组株pPICZaA-狀ir/^-X33 的构建 按照 invitrogen 公司的 The EasyselectTM Pichia Expression Kit 说明书制备毕赤 酵母X33感受态细胞，重组质粒pPICZaA- gcir/W用Pmel线形化后凝胶回收，用标准方法 电击转化毕赤酵母X33感受态细胞，在含Zeocin 500ug/ml的YPDS平板上28°C进行培养。 约3d后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达斜带石斑鱼gCTRP9 的毕赤酵母重组株pPICZaA-gctTjC^-JGS。
[0027] 实施例7 :利用毕赤酵母基因工程菌pPICZaA-gcir/^-X33生产重组斜带石斑鱼 gCTRP9 挑取毕赤酵母工程菌pPICZaA-狀ir/^-X33单菌落接种在10ml BMGY液体培养基中， 28°C，200转/分培养18-24小时，然后离心收集菌体并重悬菌体于lOOmlBMGY液体培养基 中，28°C，200转/分培养18-24小时，然后离心收集菌体并重悬菌体于lOOmlBMMY液体培养 基中，并加入吐温-80,使其终浓度为0. 4%，28°C，200转/分培养，18-24小时后向培养液 中加入甲醇，使终浓度为〇. 5%，然后28°C，200转/分培养，18-24小时后收集上清，经分离 纯化得到重组斜带石斑鱼gCTRP9产品。取lml上清用D0C-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加2 X 电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样 方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒PPICZaA转化X33后长出的单克隆培养后的上清蛋 白。结果见图4中的A。pPICZaA-gctTjC^-JGS表达上清用Novagen公司的His-bind Resin 进行纯化处理，结果见图4中的B。
[0028] 将重组斜带石斑鱼gCTRP9蛋白采用免疫印迹（Western blot)方法进行鉴定。一 抗为s鼠抗HIS单克隆抗体(购自Novagen公司），二抗为羊抗鼠 IgG-HRP (购自博士德生物 工程有限公司）。结果见图4中的C。
[0029] 实施例8 :重组斜带石斑鱼gCTRP9的功能研究-对斜带石斑鱼原代肝细胞葡萄糖 产出的影响 分离斜带石斑鱼原代肝细胞后，用加入10%FBS的含有酚红的L15培养基把细胞浓度调 成5 X 105细胞/mL，然后在24孔板中每孔加入lmL，放在25°C的生化培养箱中，培养4h后， 换成900 μ L的无 FBS和酚红的L15培养基过夜，第二天向处理组中每孔加入100 μ L的浓 度为100 μ g/mL的分离纯化后的重组斜带石斑鱼gCTRP9,对照组加入等体积的PBS，分别在 6和12h收取培养上清并用细胞裂解液(购自ThermoFisher Scientific公司）裂解细胞后 完全收取裂解细胞后的裂解液。用BCA (购自碧云天公司）法测量裂解液中的总蛋白浓度， 培养上清浓缩(冻干再溶水）后用葡萄糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所）测量葡萄 糖浓度。以每孔中的总蛋白浓度作为内参，比较对照组和处理组之间葡萄糖浓度的变化情 况。结果显示，在6h时，处理组葡萄糖浓度比对照组有下降趋势，但在12h后处理组葡萄糖 浓度明显低于对照组。结果如图5。
【权利要求】
1. 斜带石斑鱼基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 斜带石斑鱼ctrp9蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. -种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的斜带石斑鱼gcir/W基因。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体为毕赤酵母表达载体 pPICZak-gc trp9〇
5. -种重组株，其特征在于，是由权利要求4所述的表达载体pPICZaA-gcir/W转入毕 赤酵母X-33中所形成的毕赤酵母重组株pPICZaA-gci/779- X-33。
6. 利用权利要求5所述毕赤酵母重组株生产斜带石斑鱼gCTRP9蛋白的方法，其特征在 于，包括如下步骤：将该菌种接种在BMGY液体培养基中，28°C，200转/分培养18~24小时， 然后离心收集菌体并重悬菌体于BMMY液体培养基中，并加入吐温-80,使其终浓度为0. 4%， 28°C，200转/分培养，18?24小时后向培养液中加入甲醇，使终浓度为0. 5%，然后28°C，200 转/分培养，18~24小时后收集上清，经分离纯化得到重组斜带石斑鱼gCTRP9蛋白。
7. 权利要求6所述方法制备得到的重组斜带石斑鱼gCTRP9蛋白。
8. 权利要求2所述的斜带石斑鱼ctrp9蛋白或权利要求7所述的石斑鱼gCTRP9重组 蛋白在制备促生长剂或添加剂中的应用。
【文档编号】C12R1/84GK104152461SQ201410380895
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月5日 优先权日:2014年8月5日
【发明者】李文笙, 杨国坤, 秦超彬 申请人:中山大学