专利名称：一种通过脂肪酸合酶抑制剂抑制癌症发育的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过给予脂肪酸合酶(FAS)抑制剂抑制或预防癌症发育的方法。特别地，本发明阻止或延缓浸润性癌症从表达FAS的恶性前(非浸润性)病变的发育。本发明还提供含有FAS抑制剂的组合物，以及对需要它们的患者给予FAS抑制剂和组合物的方法。
背景技术：
脂肪酸在细胞的生理学中具有三个主要作用。首先，它们是生物膜的构件。其次，脂肪酸衍生物起激素和胞内信使的作用。第三，脂肪酸是燃料分子，其可以作为三酰甘油酯被储存在脂肪组织中，其也被称为中性脂肪。
在脂肪酸合成路径中有四种主要的酶，脂肪酸合酶(FAS)、乙酰CoA羧化酶(ACC)、苹果酸酶和柠檬酸裂解酶。主要的酶是FAS，它催化前体丙二酰基-CoA和乙酰-CoA的NADPH-依赖性缩合，产生脂肪酸。NADPH是一种还原性物质，它在脂肪酸合酶的两个还原酶步骤(烯酰还原酶和β-酮脂酰还原酶)中起主要电子供体的作用。其它三种酶(即，ACC、苹果酸酶和柠檬酸裂解酶)产生必需的前体。其它的酶，例如产生NADPH的酶，也涉及脂肪酸合成。
FAS具有一个酶学专门委员会(E.C.)号码2.3.1.85，也被称为脂肪酸合成酶、脂肪酸连接酶，以及它的系统名称酰基-CoA丙二酰基-CoAC-酰基转移酶(脱羧基化、氧酰基-和烯酰基-还原和硫酯-水解)。存在7种不同的涉及FAS催化的脂肪酸合成的酶乙酰转酰酶、丙二酰转酰酶、β-酮脂酰合成酶(缩合酶)、β-酮脂酰还原酶、β-羟酰脱水酶、烯酰还原酶和硫酯酶。(Wakil，S.，“Fatty acid synthase，aproficient multifunctional enzymes”.Biochemistry，284523-4530，1989)。所有这些7种酶共同组成(comprise)FAS。
在脂肪酸合成路径中的四种酶中，FAS是优选的抑制靶标，因为它仅在脂肪酸合成路径内起作用，而其它三种酶涉及其它细胞功能。因此，抑制其它三种酶中的一种更可能影响正常细胞。
FAS抑制剂可以通过化合物抑制纯化的FAS酶促活性的能力进行鉴别。FAS活性可以通过本领域中已知的许多方法，例如在丙二酰CoA的存在下测定NADPH的氧化，进行测定(Dils，R.和Carey，E.M.，″Fattyacid synthase from rabbit mammary gland，″Methods Enzymol，3574-83，1975)。与确定一种化合物是否为FAS抑制剂有关的其它信息可以在美国专利No.5,981,575中找到，通过参考将其内容并入在此。
在由FAS进行的7个酶促步骤中，由缩合酶(即，β-酮脂酰合成酶)催化的步骤是减少或停止脂肪酸合成的抑制剂的优选候选步骤。依据结构和功能，很好地表征了FAS复合体的缩合酶。缩合酶的活性中心含有一种关键的半胱氨酸硫醇，其是抗血脂药剂，例如抑制剂2，3-环氧-4-氧代-7，10-十二二烯酰基酰胺(下文称为浅蓝菌素)的靶标。
缩合酶的优选抑制剂包括宽范围的化学化合物，包括烷基化物质、氧化剂和能够进行二硫化物交换的物质。通过观察所述化合物对测定它们对纯化的人脂肪酸合酶活性的影响的试验的影响，或者对[14C]乙酸与总脂质结合的影响，可以证实这类化合物抑制活性的确认。(Pizer，E.S.，Thupari，J.，Han，W.F.，Pinn，M.L.，Chrest，F.J.，Frehywot，G.L.，Townsend，C.A.，and Kuhajda，F.P.，″Malonyl-coenzyme-Ais a potential mediator of cytotoxicity induced by fatty acidsynthase inhibition in human breast cancer cells and xenografts，″Cancer Research，60213-218，2000)。浅蓝菌素是这类抑制剂的一个例子。浅蓝菌素与FAS的缩合酶的活性部位中关键的半胱氨酸硫醇基团共价结合，使这种关键酶促步骤失活(Funabashi，H.，Kawaguchi，A.，Tomoda，H.，Omura，S.，Okuda，S.，and Iwasaki，S.Binding Siteof cerulenin in fatty acid synthetase.J.Biochem.，105751-755，1989)。
各种其它化合物已被表明抑制FAS。表1，在下阐述，列出若干已知的FAS抑制剂。优选地，本发明的抑制剂通过显示低于LD50的FAS抑制IC50；更优选地LD50比IC50至少高一个数量级，将表现出合适的治疗指数、安全特征和功效。
FAS抑制剂作为诱导体重减少和抑制原始癌细胞生长的物质已经被公开。例如，美国专利No.5,981,575(″575专利″)公开了一种通过给予一类FAS抑制剂(γ-取代的-α-亚甲基-β-羧基-γ-丁内酯化合物)诱导体重减少的方法。′575专利还公开了这些化合物适用于抑制原始癌细胞的生长。美国专利No.5,759,837(″837专利″)公开了一种通过给予一定量的FAS抑制剂治疗原始癌症的方法，所述一定的量对癌细胞具有选择性地细胞毒性，但对其它类型的非转化(正常的)细胞没有细胞毒性。然而，′575专利和′837专利都没有公开在癌症发育前(即，癌细胞最初出现之前)给予这些化合物，更不用说涉及癌变前病变的任何方法。
最近，开发了许多检测患者中癌变前状态的技术，使治疗甚至在癌细胞最初出现前得以开始。这样的早期诊断使预防性治疗得以开始，它实质上减少了癌症发育的风险。用于早期筛选的已知技术包括，例如，使用光学、声谱学或放射学引导的针活组织检查，细针抽吸和表皮脱落细胞学，以检测各种组织型，例如乳房、气消化(aerodigestive)道、胰腺、前列腺和结肠中的癌变前病变。
在癌症发病率和癌症存活统计数值方面的改善主要是基于该疾病的早期检测，此时肿瘤尺寸小并且癌被限制于起源部位。在最近两年中乳腺癌死亡率的轻微降低可能部分是由于早期检测的结果(Ahmedin，J.，Thomas，A.，Murray，T.，and Thun，M.，″Cancer Statistics 2002，″CA Cancer J Clin，5223-47，2002)。然而，尽管在早期诊断中的最近进展，但是并没有显示许多癌症的死亡率伴随的改善。通过恶性前病变的有效治疗将产生进一步可能非常显著的癌症发病率和死亡率方面的改善，所述治疗将预防或延缓浸润性癌症的发育。
通过提供一种通过给予FAS抑制剂治疗受试者中癌变前状况(即，抑制癌症发育)的方法，本发明祝贺(compliments)在早期诊断方面的最近进展。
发明概述本发明提供一种通过给予FAS抑制剂抑制癌症发育的方法。本发明的方法在延缓或预防乳腺癌从表达FAS的恶性前病变的发育中特别有用。本发明还提供含有FAS抑制剂的组合物，以及对需要它们的患者给予FAS抑制剂和组合物的方法。
因此，在一种实施方案中，本发明提供一种抑制癌症发育的方法，该方法涉及给予需要它的受试者有效量的FAS抑制剂。
在另一种实施方案中，本发明提供一种癌症发育抑制性药物组合物，该药物组合物含有药学上可接受的添加剂和有效的癌症发育抑制量的FAS抑制剂。
附图的简要说明
图1说明NT5癌细胞中脂肪酸合成被浅蓝菌素和四氢-3-亚甲基-2-氧代-5-正辛基-4-呋喃甲酸(在下文中称为″C75″)的抑制。
图2说明FAS抑制剂可在体外抑制NT5癌细胞生长。
图3说明FAS抑制剂可减少小鼠中NT5癌细胞同种异体移植物的生长。
图4说明在HER-2/neu乳腺癌转基因小鼠模型中FAS抑制剂可以抑制癌症发育。
发明的详细说明本发明提供一种通过给予FAS抑制剂抑制癌症发育的方法。特别地，本发明提供一种抑制癌症发育的方法，该方法涉及给予需要它的受试者有效量的FAS抑制剂。
本发明还提供一种组合物，该组合物含有适用于抑制癌症发育的FAS抑制剂。特别地，本发明提供一种癌症发育抑制性药物组合物，该药物组合物含有药学上可接受的添加剂和有效的癌症发育抑制量的FAS抑制剂。
如在此所使用的，术语″抑制″被理解为是指例如通过刺激、诱导或触发癌变前细胞中的细胞编程性死亡(即，遗传决定的细胞死亡)，来预防、抑制、延迟、阻滞或延缓癌症发育。
如在此所使用的，术语″癌症发育″被理解为是指癌细胞的最初出现。对于″癌细胞″，我们是指具有自主增殖的性质并且侵染相邻组织的细胞。
如在此所使用的，术语″给药″被理解为是指在本领域中通常使用的许多可能给药方法中的任何一种，例如口服地、直肠地、鼻地或胃肠外地等等，其中肠胃外给药包括，例如，静脉内、肌内、腹膜内、胸膜内、囊内、鞘内、皮下以及局部给药。此外，″给药″包括通过本领域中通常使用的许多药物组合物形式中任何一种的给药。
优选的药物组合物包括口服组合物，例如固体形式(例如片剂、胶囊、粉剂、丸剂或颗粒剂)或液体形式(例如糖浆剂、乳剂或混悬剂)；直肠组合物，例如栓剂；以及肠胃外组合物，例如适合于注射或输注的组合物。
如在此所使用的，术语″需要它的受试者″被理解为包括已经被诊断为癌变前的受试者，或者可能具有发育所述疾病，遗传的或其它的诱因的受试者。在一种优选方式中，本发明不涉及为治疗癌变前状况以外的其它一些目的，例如为体重减少，正在服用FAS抑制剂的受试者的治疗。
优选地受试者没有发育寻求治疗的那类癌症。此外，所述受试者可能具有一种或多种癌变前病变。癌变前病变可以优选地表达FAS，或者同时表达FAS和neu蛋白质。虽然癌变前病变可以发生在任何组织中，但本发明特别提供用于表达FAS的乳腺、口腔、肺、胆管、胃、前列腺或其任何组合中病变的治疗。优选所述受试者是哺乳动物，更优选是人。
如在此所使用的，术语″有效的癌症发育抑制量″被理解为是指实现抑制癌症发育期望的结果所需要的FAS抑制剂的量。还可以理解，所述有效量将通常由处方医生决定，并且所述量将随个体受试者的年龄、体重和反应以及受试者症状的严重程度(如果患者具有癌变前病变的症状)和被给予的具体化合物的效价而改变。优选地，有效量在约60mg/kg至约7.5mg/kg每周的范围内，更优选在约30mg/kg至约7.5mg/kg每周的范围内，最优选在约15mg/kg至约7.5mg/kg每周的范围内。有效量可以以单一剂量或分份剂量的形式给予。
如在此所使用的，术语″FAS抑制剂″被理解为是指一种直接抑制FAS酶的化合物。直接抑制是指所述抑制剂通过对酶的直接作用，而不是作为化合物一些其它作用，例如所有细胞活性减少的继发性结果而降低FAS活性。FAS抑制作用可以用美国专利No.5,981,575中所述的方法进行测定。
优选地，所述FAS抑制剂是以下化合物中的一个C75(即，四氢-3-亚甲基-2-氧代-5-正辛基-4-呋喃甲酸)；浅蓝菌素(即，2，3-环氧-4-氧代-7，10-十二二烯酰基酰胺)；1，3-二溴丙酮；埃尔曼试剂(5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，DTNB)；4-(4′-氯苄氧基)苄基烟酸酯(KCD-232)；4-(4′-氯苄氧基)苯甲酸(MII)；2(5(4-氯苯基)戊基)环氧乙烷-2-羧酸酯(POCA)及其CoA衍生物；乙氧基甲酸酐；硫乳霉素；phenyocerulenin；米拉索普；碘醋酸盐；苯胂氧化物；锑酰葡糖酸钠；蜂毒肽；或甲基丙二酰CoA。一种优选的FAS抑制剂是C75。其它优选的FAS化合物是被公开在美国专利申请No.60/394,585(通过参考将其内容并入在此)中的那些。
其中R1＝H、C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、-CH2OR5、-C(O)R5、-CO(O)R5、-C(O)NR5R6、-CH2C(O)R5或-CH2C(O)NHR5，其中R5和R6每个独立地是H、C1-C10烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，任选含有一个或多个卤素原子。
R2＝-OH、-OR7、-OCH2C(O)R7、-OCH2C(O)NHR7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-OC(O)NR7R8，其中R7和R8每个独立地是H、C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，以及其中R7和R8每个可以任选含有卤素原子；R3和R4，彼此相同或不同，是C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。
另一组优选的FAS抑制剂是被公开在美国专利申请序列号60/392,809(通过参考将其内容并入在此)中的那些 R9＝H、或C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、＝CHR11、-C(O)OR11、-C(O)R11、-CH2C(O)OR11、-CH2C(O)NHR11，其中R11是H或C1-C10烷基、环烷基或链烯基；
R10＝C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；X＝-OR12或-NHR12，其中R12是H、C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，该R12基团任选含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，该R12基团进一步任选含有一个或多个卤素原子；条件是当R9是＝CH2时，那么X不是-OH。
如在此所使用的，术语″添加剂″被理解成是指在本领域中通常使用的许多可能的添加剂中的任何一种，例如载体、赋形剂、稀释剂、填料或其组合。添加剂的优选实例是水、醇、明胶、蔗糖、果胶、硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、动物或植物来源的各种油、乙二醇、淀粉及淀粉衍生物、硅石、乳糖、乳糖一水合物、纤维素及纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸钙、磷酸氢钙、PVP或聚维酮、甘露糖醇、山梨糖醇、明胶、糖醇、硬脂酸、丙烯酰基衍生物、褐藻酸、α-十八烷基-ω-羟基聚-(氧乙烯)-5-山梨酸-H2O、阿拉伯胶、调味物质、抗坏血酸、碳酸钙、磷酸氢钙、磷酸钙、硬脂酸钙、羧甲纤维素钠、纤维素、纤维素衍生物、二甲硅油(dimethicon)、着色剂、明胶、葡萄糖浆、高分散硅石、苯甲酸钾、乳糖一水合物、聚乙二醇、碳酸镁、氧化镁(轻质)、硬脂酸镁、玉米淀粉、玉米溶胀淀粉、甘露醇、甘露糖醇、食用脂肪酸的单-和二甘油酯、褐煤乙二醇蜡(montan glycol wax)、苯甲酸钠、(无水)碳酸钠、氯化钠、碳酸氢钠、聚(丁基甲基丙烯酸酯)-共-(2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚维酮K25、聚维酮、精炼蓖麻油、蔗糖、蔗糖单硬脂酸酯、虫胶、山梨糖醇、滑石、二氧化钛、酒石酸、丙二醇或聚乙二醇、稳定剂、抗氧化剂、各种天然或合成的乳化剂、分散剂或润湿剂、着色剂、芳香剂、缓冲剂、崩解剂、以及本领域已知促进活性物质生物利用度的其它物质。
许多研究证实了癌变前人乳房病变以及其它器官的癌变前病变中令人惊奇地高水平的FAS表达。下表2说明了在癌症前体病变中FAS表达的盛行以及它们进展成浸润性癌症或与浸润性癌症结合的比率。
由于癌变前病变的名称对于每种器官而言可能不同，术语的简要定义将有助于解释所述表。在乳腺中，存在两种不同的浸润前(癌变前)病变，它们被定义为原位癌管内癌和原位小叶癌(1 & 2排)。术语原位癌被用来描述一种其中癌变前细胞还没有浸润到周围组织中的病变。这些病变与浸润性癌发育的最高风险有关，并且还具有FAS免疫反应性的最高盛行。还存在癌症发育的中度风险的乳腺病变(第3排)。这些所谓的″非典型导管或小叶增生″不表现出原位癌的全部组织学特征。这些乳腺病变表明乳腺癌发育的风险为原位癌发育风险的约一半并且具有更低频率的FAS阳性。
在前列腺中，前列腺上皮内瘤形成(PIN)是一种与腺体中别处浸润性癌存在有关的病变。PIN被描述为低程度或高程度。虽然低程度病变与癌症没有明显的关系，但是在约三分之一病例中的浸润性前列腺癌中存在高程度PIN(第4排)。真正的天然史或未经治疗的PIN仍然是未知的。FAS通常在高程度PIN中被表达。
腺瘤是通常被接受的结肠直肠癌的前体病变(第5排)，因为已表明癌症通常发生在腺瘤内或与腺瘤有关。增加的尺寸、绒毛形态学和高程度发育异常的存在(如既通过组织学又通过细胞学特征定义)与癌症发育增加的风险有关。术语″发育异常″被用来表示在显示癌变前病变进展的组织中的组织学和细胞学变化。在一项研究中，FAS遍在地存在于结肠直肠腺瘤中；另一组发现FAS表达随腺瘤中发育异常程度的增加而增加。
在肺中，鳞状癌由发育异常的鳞状粘膜发育而来。对肺的慢性损害，例如烟草烟雾，首先导致从气道中纤毛腺粘膜至对损伤更耐受的鳞状粘膜的改变。这种过程被称为组织变形。随时间，烟雾中的致癌物引起被称为发育异常的组织学和细胞学变化，该变化表明癌变前病变的发育。一旦存在高程度的发育异常，就存在浸润性癌症发育的显著风险。现已发现在发育异常的支气管上皮细胞中FAS表达增加。
胃中的癌症前体病变是腺瘤-与结肠直肠腺瘤相似，但不相同。因为在结肠中，它们带有增加的癌症发育风险并且FAS通常被表达。
口腔中浸润性癌症的前体是口腔内衬鳞状粘膜的发育异常-与导致肺癌的支气管鳞状发育异常相似。在这些发育异常的病变中，FAS表达也增加。
胆管癌通常由发育异常的腺粘膜引起。在此组织中，上皮细胞不发生如在支气管中的从腺性至鳞状的改变。但是，FAS表达遍在地存在于胆管发育异常中。
表2癌症前体病变中的FAS表达
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为了表明FAS抑制剂将抑制癌症发育，使用了HER-2/neu乳腺癌转基因小鼠模型。来源于FVB/N品系，neu-N转基因小鼠在乳房特异性启动子的控制下表达非转化大鼠neu cDNA。结果，小鼠从约125天开始发育自发性乳房腺癌，到300天为止几乎所有的小鼠都怀有肿瘤(Guy，C.，Webster，M.，Schaller，M.，Parsons，T.，Cardiff，R.和Muller，W.，″Expression of the neu protooncogene in the mammary epitheliumof transgenic mice induces metastatic disease，″Proc.Natl.AcadSci.USA，8910578-10582，1992)。此模型没有激活(突变)的neu基因。虽然激活的neu模型具有更迅速的肿瘤发育的优点(Guy，C.，Cardiff，R.和Muller，W.，″Activated neu induces rapid tumorprogression，″Journal of Biological Chemistry，2717673-7678，1996)，但是这种点突变在人乳腺癌中没有被鉴别(Lofts，F.和Gullick，W.，″C-erbB2 amplification and overexpression in humantumors，″Cancer Treat Res.，61161-179，1992)。因此，HER-2/neu乳腺癌转基因小鼠模型与其中neu过度被表达，没有突变的人类疾病更密切类似。此外，neu在25％的人类管内癌(DCIS)中被表达(Glockner，S.，Lehmann，U.，Wilke，N.，Kleeberger，W.，Langer，F.和Kriepe，H.，″Amplification of growth regulatory genes in intraductalbreast cancer is associated with higher nuclear grade but not withprogression to invasiveness，″Laboratory Investigation，81565-571，2001)，证实neu过度表达是人类癌发生中的早期事件，因此进一步证明了neuN模型。由于FAS(Milgraum，L.Z.，Witters，L.A.，Pasternack，G.R.和Kuhajda，F.P.，″Enzymes of the fatty acidsynthesis pathway are highly expressed in in situ breastcarcinoma″，Clin Cancer Res，32115-2120，1997)和neu二者都已在人乳腺组织原位癌中被鉴别，并且FAS抑制导致neu过度表达的乳腺癌细胞的细胞编程性死亡，所以使用所述neu-N模型来显示FAS抑制剂可以抑制癌症发育。
作为代表性FAS抑制剂，C75被使用。C75的合成和作为FAS抑制剂的功效在美国专利No.5,981,575中被证实。
实施例4和图4说明，HER-2/neu乳腺癌转基因小鼠用FAS抑制剂C75的治疗显著抑制了癌症的发育，在将近1.5年的时间内(它们的生命周期)，三只动物仍然没有肿瘤。可预料其它FAS抑制剂以与C75类似的方式发挥作用。
提供下面的实施例以进一步说明本发明的方法和组合物。这些实施例仅仅是说明性的，并不想以任何方式限制本发明。
实施例1NT5细胞中脂肪酸合成被2，3-环氧-4-氧代-7，10-十二二烯酰基酰胺(即，浅蓝菌素)和四氢-3-亚甲基-2-氧代-5-正辛基-4-呋喃甲酸(即，C75)的抑制。
在NT5癌细胞中证实了FAS抑制剂浅蓝菌素和C75抑制发育性肿瘤中脂肪酸合成的能力，该NT5癌细胞由在转基因小鼠中已发育的肿瘤建立。(参见图1)。将5×104NT5细胞置于24孔板中。过夜附着后，细胞用稀释在DMSO中的5mg/ml浅蓝菌素和C75处理4h，对照细胞仅仅接受载体。在药物处理的最后2小时期间，细胞用1μCi[14C]乙酸处理。然后，提取总脂质并计数。结果表示在图1中。结果的统计学分析(即，两因素拖尾t检验)如下对照-C75 5μg/ml，p＝0.116；对照-C7510μg/ml，p＝0.018；对照-浅蓝菌素5μg/ml，p＝0.002；对照-浅蓝菌素1Oμg/ml，p＝0.002。
图1表示NT5癌细胞中脂肪酸合成被浅蓝菌素和C75抑制。由在转基因小鼠中发育的肿瘤建立了NT细胞系(Reilly，R.，Gottlieb，M.，Ercolini，A.，Machiels，J.，Kane，C.，Okoye，F.，Muller，W.，Dixon，K.和Jaffee，E.，″HER-2neu Is a Tumor Rejection Target inTolerized HER-2/neu Transgenic Mice，″Cancer Research，603569-3576，2000；Reilly，R.，Machiels，J.，Emens，L.，Ercolini，A.，Okoye，F.，Lei，R.，Weintraub，D.和Jaffee，E.，″TheCollaboration of Both Humoral and Cellular HER-2/neu-targetedImmune Responses Is Required for the Complete Eradication ofHER-2/neu-expressing Tumors，″Cancer Research，61880-883，2001)，并且提供一个测试FAS抑制剂C75和浅蓝菌素的体外模型。可以看出，浅蓝菌素和C75二者都以与以前用人细胞系的研究相似的水平抑制NT5细胞中脂肪酸合成。(Pizer，E.S.，Thupari，J.，Han，W.F.，Pinn，M.L.，Chrest，F.J.，Frehywot，G.L.，Townsend，C.A.和Kuhajda，F.P.，″Ma lonyl-coenzyme-A is a potential mediatorof cytotoxicity induced by fatty acid synthase inhibition inhuman breast cancer cells and xenografts，″Cancer Research，60213-218，2000；Pizer，E.，Pflug，B.，Bova，G.，Han，W.，Udan，M.和Nelson，J.，″Increased fatty acid synthase as a therapeutictarget in androgen-independent prostate cancer progression，″Prostate，47102-110，2001)。此外，图1还证实这些细胞具有活泼的脂肪酸合成，由此表达FAS，这些抑制剂的靶酶。
实施例2NT5癌细胞生长体外被FAS抑制剂的抑制体外证实了FAS抑制剂抑制NT5癌细胞生长的能力。(参见图2)。将1×104细胞置于24孔板中。过夜附着后，细胞用稀释在DMSO中的5mg/ml C75或浅蓝菌素处理，对照细胞仅仅接受载体。72小时后，细胞用结晶紫(0.2％，在10％的甲醇中)染色，溶解在1％的SDS中，并且在490nm处测定O.D.。两因素拖尾t检验对照-C75 5μg/ml，p＝0.0003；对照-C75 10μg/ml，p＜0.0001；对照-浅蓝菌素5μg/ml，p＜0.0001；对照-浅蓝菌素10μg/ml，p＜0.0001。
图2表示NT5癌细胞生长体外被FAS抑制剂的抑制。可以看出，用FAS抑制剂浅蓝菌素和C75的治疗显著地减少了癌细胞的生长(如由减少的O.D.490nm所显示的)。
实施例3小鼠中NT5癌细胞同种异体移植物的生长被FAS抑制剂的减少使用FVB/N小鼠证明了FAS抑制剂抑制小鼠中NT5癌细胞同种异体移植物生长的能力。(参见图3)。十四只动物在胁腹接受0.1ml压紧培养NT5细胞。当出现可测量的肿瘤时，七只动物每6天用C75(30mg/kg，在0.1ml RPMI中，腹膜内注射)处理，七只动物接受载体对照。图3中的误差线表示平均值的标准误差。
图3表示小鼠中NT5癌细胞同种异体移植物的生长被FAS抑制剂C75的降低。可以看出，用C75的治疗显著减少了FVB/N小鼠中NT5肿瘤细胞同种异体移植物的生长。
实施例4癌症发育被FAS抑制剂的抑制使用HER-2/neu乳腺癌转基因小鼠模型证实了FAS抑制剂抑制癌症发育的能力。(参见图4)使用三十只HER-2/neu乳腺癌转基因小鼠进行本研究。十五(15)只小鼠从5周龄开始每周接受C75的剂量(30mg/kg，在0.1ml RPMI中)达三个月，并且十五只小鼠仅仅接受载体。每天观察小鼠并记录乳腺肿瘤的首次出现。在研究期间，对照组中的两(2)只小鼠和处理组中的6只小鼠死亡。数据的对数排列(Log-rank)分析表明，在C75处理的动物中肿瘤发育被显著地延迟了。50％的对照小鼠在约200天后发育了肿瘤，相比C75处理的动物300天。此外，在将近18个月的时间内三只处理的动物仍然没有出现肿瘤。
实施例5作用机理的研究用30mg/kg的C75每周腹膜内(ip)处理十五只8-10周龄，neu-N转基因小鼠，伴以十五只载体对照(RPMI)。在第二周(在8-10周龄时第一次C75处理后的两周)开始，以两周间隔，通过二氧化碳窒息处死来自处理组和对照组中的三只小鼠。所有动物在处死前两小时都被注射1mg的BrdU。与粗略可鉴别的乳房内淋巴结一道摘除整个腹股沟乳腺。此外，从每只动物中收集肾、肝和皮肤样品。将一侧的乳房肝以及肾、肝和皮肤样品固定在中性缓冲的福尔马林中，将另一侧固定在卡诺依氏固定液中进行整装制片。此外，摘除非转基因的年龄匹配的FVB/N对照小鼠的乳腺，在第10周(18-20周龄)进行类似的分析。
在10％的中性缓冲的福尔马林中固定24小时后，将乳腺包埋在石蜡中。由每一组织块制备6块4微米的载玻片，第一块载玻片用苏木精和曙红染色。利用其余未染色的切片用下面的抗体进行肿瘤前病变和周围乳腺组织的免疫组织化学分析FAS，BrdU和p21/Waf-1(Dako，Carpinteria，CA)，Akt和Phospho-Akt(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)和neu(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)细胞编程性死亡(ApopTag Peroxidase In Situ Oligo Ligation Kit，Serologicals Corporation，Temecula，CA)。在400x下，通过对导管和小叶结构中每500总细胞中阳性细胞的数目进行计数，评价染色。在Prism 3软件上使用t-检验进行统计学分析。卡诺依氏固定的组织用胭脂红如所述进行染色并整装在玻璃载玻片上。
C75处理8-10周后，与载体对照和FVB/N动物相比，在neu-N动物中乳导管结构的数目、它们的厚度以及出芽上皮结构的数目存在明显减少。
图5表示用C75处理的N-neu转基因小鼠中的异常乳腺发育(照片A、B和F)，相比对照(照片C、D和E)。照片A表示C75处理的动物的整装样品，其表现出导管的数目和管径显著减小，以及上皮结构的数目减少。该照片的扩大版本表示在照片B中。可将照片A和B分别与照片C和D比较，它们显示具有导管结构的正常数目、管径和出芽的对照样品。在照片E和F中反映了组织切片中的这些变化。A、C、E和F中的黑箭头表示淋巴结，表示在两种样品类型中类似的图像截获区。
如图6和6中所示，细胞凋亡变化增加，DNA合成减少，以及与对照和FVB/N小鼠相比，FAS、neu、Akt、Phospho-Akt和p21/Waf1表达全部降低。图8表示在C75处理的neu-N转基因小鼠中以及在FVB/N对照小鼠的载体对照中对FAS和neu(苏木精复染)的免疫组织化学染色。在载体对照动物中，在具有强弥散着色的导管和脂肪组织中都存在高水平的FAS表达(照片A)(在图5中的所有照片都是200X放大)。C75处理的动物在具有弱和局部染色的乳腺管和脂肪组织中都具有显著更低的FAS表达(照片B)。在FVB/N对照动物中的FAS表达是稀少和弱的(照片C)。与载体对照动物(照片D)相比，C75动物(照片E)中的neu免疫组织化学染色降低。在FVB/N对照动物中，neu表达是局部的和弱的(照片F)。
重要地是，这些作用限于过度表达neu的乳腺上皮细胞，而不限于皮肤、肝或肾中的其它正常导管结构。在FVB/N动物中，在C75处理的动物和对照之间的乳房结构中不存在显著的形态学差异。这可以从图9中看出，该图表示用C75处理的FVB/N对照小鼠中正常的乳腺发育(照片B和D)，相比对照(照片A和C)。在乳房结构中明显没有显著的形态学差异。
权利要求
1.一种抑制癌症发育的方法，该方法包括给予需要它的受试者有效量的脂肪酸合酶抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
3.权利要求1的方法，其中所述受试者是人。
4.权利要求1的方法，其中所述受试者具有癌变前病变。
5.权利要求5的方法，其中所述癌变前病变表达脂肪酸合酶。
6.权利要求5的方法，其中所述癌变前病变表达neu蛋白质。
7.权利要求5的方法，其中所述癌变前病变表达脂肪酸合酶和neu蛋白质。
8.权利要求5的方法，其中所述癌变前病变存在于选自乳腺、前列腺、结肠、肺、胃、口和胆管的组织型中。
9.权利要求8的方法，其中所述的组织型是乳腺。
10.权利要求8的方法，其中所述组织型是前列腺。
11.权利要求8的方法，其中所述组织型是结肠。
12.权利要求8的方法，其中所述组织型是肺。
13.权利要求8的方法，其中所述组织型是胃。
14.权利要求8的方法，其中所述组织型是口。
15.权利要求8的方法，其中所述组织型是胆管。
16.权利要求1的方法，其中所述有效量是在约60mg/kg至约7.5mg/kg每天的范围内。
17.权利要求1的方法，其中所述脂肪酸合酶抑制剂是一种直接抑制脂肪酸合酶的化合物。
18.权利要求1的方法，其中所述脂肪酸合酶抑制剂是一种具有下式的化合物 其中R1＝H、C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、-CH2OR5、-C(O)R5、-CO(O)R5、-C(O)NR5R6、-CH2C(O)R5或-CH2C(O)NHR5，其中R5和R6每个独立地是H、C1-C10烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，任选含有一个或多个卤素原子。R2＝-OH、-OR7、-OCH2C(O)R7、-OCH2C(O)NHR7、-OC(O)R7、-OC(O)OR7、-OC(O)NR7R8，其中R7和R8每个独立地是H、C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，以及其中R7和R8每个可以任选含有卤素原子；R3和R4，彼此相同或不同，是C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基。
19.权利要求1的方法，其中所述脂肪酸合酶抑制剂是一种具有下式的化合物 R9＝H、或C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基、或烷芳基、＝CHR11、-C(O)OR11、-C(O)R11、-CH2C(O)OR11、-CH2C(O)NHR11，其中R11是H或C1-C10烷基、环烷基或链烯基；R10＝C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基；X＝-OR12或-NHR12，其中R12是H、C1-C20烷基、环烷基、链烯基、芳基、芳烷基或烷芳基，该R12基团任选含有羰基、羧基、羧基酰胺基、醇基或醚基，该R12基团进一步任选含有一个或多个卤素原子；条件是当R9是＝CH2时，那么X不是-OH。
20.权利要求1的方法，其中所述脂肪酸合酶抑制剂是四氢-3-亚甲基-2-氧代-5-正辛基-4-呋喃甲酸。
全文摘要
一种通过给予脂肪酸合酶(FAS)抑制剂抑制或预防癌症发育的方法。特别地，本发明阻止或延缓浸润性癌症从表达FAS的癌变前(非浸润性)病变的发育。本发明还提供含有FAS抑制剂的组合物，以及对需要它们的患者给予FAS抑制剂和组合物的方法。
文档编号A61K31/00GK1728994SQ200380102537
公开日2006年2月1日 申请日期2003年10月31日 优先权日2002年10月31日
发明者F·P·库豪伊道, E·M·杰夫, C·A·汤森 申请人:法斯根有限责任公司, 约翰斯霍普金斯大学