专利名称：HBV特异性干涉靶位点基因及其siRNA和其在抗HBV感染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的基因治疗，具体涉及基因工程方法构建乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)特异性干涉靶位点基因、上述基因生成的siRNA(small interfering RNA，小干涉RNA)以及所述的基因和siRNA在制备用于抗HBV感染的治疗药物中的应用。
背景技术：
HBV属嗜肝DNA病毒，为含有部分双链的环状DNA病毒。病毒DNA的长链为负链，短链为正链。HBV基因组致密精巧，大小约3.2kb。HBV的持续感染是当前严重的全球健康问题之一，也是导致慢性肝病最常见的原因。目前全球约有3.5亿慢性HBV感染者，每年死于HBV感染有关的慢性肝病近100万人。我国是乙型肝炎的高发区，由HBV持续感染所引起的病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等严重危害我国人民的生命健康近10％的人口为HBV携带者，现症乙型肝炎患者3000多万人，每年有约30万人死于乙型肝炎及其相关并发症。因此，寻求乙型肝炎的有效治疗方法，已成当前医学界亟待解决的重大课题。目前已获批准的控制HBV持续感染的药物主要有干扰素-α和核苷类似物如拉米呋啶和阿德福韦，但迄今的抗病毒治疗手段疗效不够满意高剂量重组干扰素的持续应答率仅约30％左右，核苷类似物如拉米呋啶虽然抗病毒活性较强，但停药后病毒复制水平快速反跳及耐药病毒株的出现，使得临床抗病毒方案的实施面临极大的挑战。寻找高效、特异、低毒的抗HBV治疗新方案一直是人们不懈追求的目标。
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是双链RNA(dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默现象，广泛存在于多种生物体中。RNAi的本质是一种由RNA介导的序列特异的获得性免疫反应，是一种原始的基因组对抗外来基因表达的保护机制，是生物体在基因组水平上的免疫系统。RNAi的核心功能是抗病毒感染免疫，维持基因组中转座子的稳定性，清除异常RNA，同时参与基因表达的调控。当前，RNAi已发展成为一种新型的基因阻断技术，用于高效特异地关闭或降低特定基因的表达，广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定以及基因治疗等方面，在肿瘤、病毒感染等的治疗方面已取得积极进展，显示了非常广阔的应用前景。
现已证实，dsRNA诱发的RNAi作用机理是细胞中的dsRNA在Dicer-1酶的作用下降解产生siRNA，后者在其它活化酶的参与下识别与siRNA同源的mRNA并将其降解。在哺乳动物细胞中，21nt的siRNA的引入则成功地抑制了细胞中的靶基因的表达，同时避免了dsRNA激活干扰素系统而产生的非特异性作用。
与经典的抗HBV药物干扰素和核苷类似物相比，RNAi技术在抗HBV治疗方面具有诸多优势①特异性针对病毒转录产物从而阻断病毒复制，不会激活非特异性细胞反应，不良反应最小；②RNAi具有高效性，少量的siRNA就可达到抑制HBV mRNA，降低病毒表达产物的作用；③HBV基因组内存在许多潜在的RNAi靶位点，可提供数百个RNAi的作用靶位点，选择保守区域位点可有效防止病毒变异株的出现；④RNAi的作用不依赖于病毒的复制，siRNA可以在病毒非活跃复制的情况下发挥其抑制病毒基因转录及降低蛋白表达水平的作用，而拉米呋啶只对有复制活性的HBV有抑制作用，因此可以作为抗病毒药物拉米呋啶的辅助治疗。
发明内容
本发明的目的在于构建一种特异性强、活性高能持续抗HBV感染的新型分子，提供一种HBV特异性干涉靶位点基因、上述基因转录生成的siRNA及所述的基因和siRNA在制备用于抗HBV感染的治疗药物中的应用。
本发明的技术解决方案是HBV特异性干涉靶位点基因，其具有序列表<400>1-5之一的序列。
由上述基因转录生成的siRNA，其具有序列表<400>6-15之一的序列。
上述基因在制备用于抗HBV感染的治疗药物中的应用。
上述siRNA在制备用于抗HBV感染的治疗药物中的应用。
本发明基于siRNA能够高效、特异地关闭或降低特定基因的表达的原理，采用pSUPER载体(grummelkamp TR，et al.Science 2002；296550-553)产生的siRNA实现对HBV的高效、特异、持续抑制作用。本发明筛选所得到的HBV靶向基因，经载体表达后产生能特异性地识别和降解HBV的siRNA效应分子，无论是使用表达siRNA重组载体直接进行静脉注射，或将人工合成的siRNA注射入乙型肝炎患者体内，均能产生高效、特异的抗HBV作用。
本发明筛选所得到的HBV靶向基因具有以下特点①高度的特异性——RNAi是转录后水平的基因沉默机制，HBV靶向的siRNA能够非常特异地降解HBV转录的mRNA，而无关基因不受影响，实验中发现针对EGFP(绿色荧光蛋白)的siRNA并未对HBV基因的表达产生明显影响；②高效性——相对很少量的siRNA分子就能产生强烈的RNAi效应，抑制HBV mRNA的表达，降低病毒表达产物的作用，其水平可以达到缺失突变体表型的程度；③持续性——HBV特异性siRNA可经载体转染细胞后长期表达，实现对体内HBV的长期抑制作用；④安全性——由于使用的是21nt的siRNA，不会激活干扰素系统而产生非特异性作用，不良反应最小。
本发明可望为HBV感染的治疗提供一种新手段。
图1为pSUPER载体转录生成siRNA的示意图。
图2为HBV基因及其转录本的RNA干涉位点信息图。
图3为siRNA表达载体的双酶切鉴定结果图。
图4为稳定表达siRNA的细胞株的细胞周期分析结果图。
图5为稳定表达siRNA的细胞的生长曲线。
图6为siRNA对HBV基因mRNA的降解图。
图7为siRNA对HBV转录产物的降解图。
图8为siRNA对细胞分泌HBsAg(A)和HBeAg(B)的抑制作用图。
图9为siRNA抑制HBV抗原的表达的免疫荧光检测结果图(200×)。
图10为细胞裂解液的Western blot分析图。
图11为siRNA对培养上清(A)和细胞内(B)HBV DNA的抑制作用图。
图12为siRNA持久抑制HBsAg(A)和HBeAg(B)的表达图。
图13为siRNA对HBV转基因小鼠体内HBsAg的抑制作用图。
图14为HBV转基因小鼠(A)和C57BL小鼠(B)肝脏HE染色图。
图15为siRNA抑制转基因小鼠体肝脏中HBsAg的表达16为siRNA抑制转基因小鼠体内HBV DNA的复制图具体实施方式
1.HBV特异性siRNA表达载体的构建(1)由DNA转录生成siRNA的策略设计的寡核苷酸链每条均为64nt，5′端和3′端分别含BglII和HindIII酶切位点，便于与pSUPER载体连接。5′端19nt的编码序列与靶基因同源、另一段19nt的序列与其反向互补，其间由9nt的TTCAAGAGA间隔序列形成环状结构，末端加有转录终止信号TTTTT。具有上述结构特征的寡核苷酸链经退火、磷酸化后形成双链DNA，然后定向插入pSUPER载体(附图1)。具有上述结构的pSUPER载体能转录生成发夹状的RNA(shRNA)，后者经Dicer酶切后成为siRNA而发挥抑制基因表达的功能。
(2)针对HBV基因干涉位点的选择与寡核苷酸的设计根据GenBank中报道的HBV核苷酸序列(U95551)，在siRNA设计网站http//wwwl.qiagen.com/Products/GeneSilencing/CustomSiRna/SiRnaDesigner.asDx，选择基因编码区中以AA开头长度为21个碱基，G+C含量在50％左右的序列作为候选siRNA靶位点。设计出的siRNA序列进行BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源分析证实为HBV特异序列。选取HBV编码区1683-1701、1580-1598、671-689、413-431、2027-2045核苷酸序列，按照pSUPER载体的要求设计2条64nt能编码siRNA的寡核苷酸链，寡核苷酸序列两端包含BglII和HindIII酶切位点，能直接与经相同酶切的pSUPER载体连接。此外还设计了与HBV序列无关的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA表达载体pSUPER-EGFP作为对照。针对HBV基因及其转录本的RNA干涉位点信息如附图2所示。
(3)双链寡核苷酸克隆入pSUPER载体①寡核苷酸的退火和磷酸化合成的单链寡核苷酸溶解于H2O中，调整其浓度为3μg/μl。各取1μl相应的寡核苷酸合成片段，加入48μl退火缓冲液，95℃保温5min，70℃孵育10分钟，缓慢冷却至4℃得到退火双链DNA；取2μl退火的寡核苷酸，加1μl T4 PNK缓冲液、1μl 1mM ATP、1μl T4 PNK、5μl H2O，在37℃水浴进行30min磷酸化，70℃孵育10分钟灭活PNK。
②双链寡核苷酸与载体的连接退火并磷酸化的寡核苷酸与经BglII和HindIII双酶切的pSUPER载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取克隆、摇菌培养后提取质粒，EcoR I和Hind III双酶切进行鉴定，阳性质粒切出约300bp的条带，而空质粒的大小为240bp(附图3)。序列测定证实重组质粒序列与所设计序列完全一致，分别命名为pSUPER-HBV1、pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV3、pSUPER-HBV4、pSUPER-HBV5以及pSUPER-EGFP。
2.siRNA抑制细胞内HBV的基因表达和复制将序列正确的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒按摩尔比10∶1共转染稳定表达HBV的HepG2 2.2.15细胞，经200μg/ml潮霉素抗性筛选获得稳定的单克隆细胞株，观察导入的siRNA对细胞周期和细胞生长速度的影响；在mRNA水平上用RT-PCR和Northern blot检测HBV mRNA的抑制情况；在蛋白质水平上用微粒子酶免疫测定法(MEIA)定量检测培养上清中的HBsAg和HBeAg含量，免疫荧光染色和Western blot检测细胞中相应抗原的表达；荧光定量PCR(FQ-PCR)检测细胞内外HBV DNA的复制情况；并动态观察siRNA对HBV的长期抑制作用。
(1)siRNA对细胞周期无明显影响筛选出的单克隆细胞消化、洗涤制成单细胞悬液，经固定、染色，检测细胞周期并计算细胞增殖指数。流式细胞分析结果结果显示(附图4，表1)稳定表达siRNA单克隆细胞株，细胞周期和增殖指数与对照HBV-pSUPER相比并无显著差异，表明导入HBV特异性siRNA表达载体对HepG2 2.2.15细胞的生长无明显影响。
表1 稳定表达siRNA的细胞株的细胞周期及增殖指数(PI)
(2)siRNA对细胞生长曲线无明显影响按照3×103/100μl/孔接种筛选出的单克隆细胞于7块96孔板，培养1、2、3、4、5、6、7天时，各取1块96孔板，吸弃培养液，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT，继续培养4h后吸掉培养液，每孔加入150μl DMSO，震荡10min溶解结晶，酶联免疫检测仪测定490nm吸光值。以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制各细胞生长曲线。结果发现，稳定表达siRNA的细胞生长速度与对照细胞的生长速度相似，各组间无明显差别(附图5)(3)siRNA对HepG2 2.2.15细胞中HBV mRNA的降解根据HBV的基因序列，设计用于扩增HBV 356-714位置的RT-PCR引物P1和P2，用于扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因的引物G1和G2。提取筛选出的单克隆细胞总RNA，反转录生成cDNA，用相应的引物按如下参数进行HBV mRNA的PCR扩增94℃预变性4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，共25个循环；72℃延伸5min。结果显示干涉组细胞的RT-PCR产物在358bp位置处的条带明显暗于对照条带，转染pSUPER-EGFP、pSUPER细胞的HBV mRNA表达产物与HepG2 2.2.15细胞相比无明显变化，提示HBV mRNA的表达被明显抑制；而内参照GAPDH mRNA在各细胞均能经RT-PCR扩增产生250bp片段，各组之间的表达无明显差异(附图6)，表明siRNA对HepG2 2.2.15细胞中HBV mRNA的降解作用是高效、特异的。
P1 5’-CAA CTT GTC CTG GTT ATC GC-3’
P2 5’-AAG CCC TAC GAA CCA CTG AA-3’G1 5’-CAA CGG ATT TGG TCG TAT TGG G-3’G2 5’-CCT GGA AGA TGG TGA TGG GAT T-3’(4)siRNA对HBV转录产物的降解作用提取筛选出的单克隆细胞总RNA，经变性凝胶电泳、转膜，与α-32P标记的探针杂交，放射自显影结果显示转染pSUPER、pSUPER-EGFP细胞HBV 3.5kb、2.4kb、2.1kb的转录产物条带清晰，而干涉组细胞相应的条带明显减弱，抑制效果明显的细胞内的HBV转录产物条带基本看不到(附图7)，表明siRNA对HepG22.2.15细胞中HBV RNA的降解作用是高效、特异的。
(5)siRNA对细胞培养上清中分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用筛选出的细胞3×105在双抗性条件下48h、72h的培养上清用微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBsAg和HBeAg含量。结果表明培养上清中HBsAg、HBeAg均受到明显抑制，以pSUPER-HBV2抑制作用最强，它对培养48h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为97％和87％，培养72h对相应抗原的抑制率为98％和88％；pSUPER-HBV5作用次之，它对培养48h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为87.4％和77％，培养72h对相应抗原的抑制率为90％和80.8％；其它载体对HBsAg和HBeAg的分泌也有很好的抑制作用，对HBsAg抑制效率为60.2％(pSUPER-HBV3，72h)到91.7％(pSUPER-HBV1，72h)，对HBeAg抑制效率由53.8％到64.4％不等。上述结果与相应的pSUPER对照组比较差异非常显著(P＜0.05)，相比之下pSUPER-EGFP与对照组无明显差异(附图8)。提示siRNA的抑制作用是高效、特异的。
(6)siRNA抑制细胞内HBsAg和HBcAg的表达将筛选出的单克隆细胞进行免疫荧光染色，结果显示细胞中红色荧光标记的病毒抗原明显减少，pSUPER-HBV2和pSUPER-HBV5转染组细胞已基本检测不到HBsAg和HBcAg的表达，而pSUPER-EGFP与对照组中抗原的表达无明显降低(附图9)，表明siRNA能高效、特异地抑制细胞内HBV抗原的合成。
(7)细胞内HBsAg的Western blot检测对细胞裂解液所进行的Western blot检测结果显示，表达HBV特异性siRNA的细胞中HBsAg的表达明显下调，而pSUPER-EGFP与对照组中抗原的表达无明显降低(附图10)，表明siRNA确实能够高效、特异地抑制细胞内HBV抗原的合成。
(8)siRNA对HBV DNA的抑制作用取3×105细胞培养72h上清和浓度为1.0ng/μl细胞基因组DNA各5μl分别加入已配制好的PCR反应管中，同时设立阴性对照和阳性定量梯度对照，混匀后置于PE7700自动荧光检测仪，按下列条件扩增93℃预变性2min，93℃45s，55℃60s，先做10个循环，再按93℃30s，55℃45s做30个循环。反应结束后，由电脑自动分析计算出HBV的拷贝数。荧光定量PCR(fluorogenicquantitative PCR，FQ-PCR)结果显示，siRNA能降低细胞内外HBV DNA的拷贝数，其中pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV5均使培养上清中的HBV DNA下降2个数量级，抑制率高达99.7％和98.5％，其余pSUPER-HBV1、pSUPER-HBV4和pSUPER-HBV3对培养上清中HBV DNA的抑制率分别为95.7％、92.3％和62.9％(附图11A)。对细胞基因组DNA进行的FQ-PCR检测结果与培养上清中所得到的结果类似，pSUPER-HBV(1-5)对对细胞内HBV DNA的抑制率分别为81.1％、82.8％、63.8％、74.5％和82.1％(附图11B)。上述FQ-PCR结果说明siRNA能抑制细胞内HBV DNA的复制。
(9)siRNA持续抑制HBV抗原的表达筛选出的单克隆细胞在含10％FBS、200μg/ml G418和200μg/ml潮霉素的MEM培养基中持续传代培养，定期接种细胞3×105于6孔板，共3个复孔，用含相同浓度G418和潮霉素的DMEM培养基于同等条件下培养72h，收集各时段的培养上清用于HBsAg和HBeAg的检测。对HBV抗原表达的持久、动态观察结果发现，载体转录的siRNA能够持续、高效地抑制HBV基因的表达抑制效果较好的pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV5在长达10个月的培养过程中HBsAg几乎维持不变，仅HBeAg有轻微的上升；pSUPER-HBV1、pSUPER-HBV4结果与之相似(附图12)，pSUPER-HBV3的结果变化幅度较大，这可能与在挑取单克隆细胞时克隆不纯有关。
3.siRNA对转基因小鼠体内HBV的抑制作用(1)HBV转基因小鼠的处理清洁级C57BL/6J-HBV转基因小鼠(6-8周龄，体重15-20g)从北京大学医学部实验动物科学部购买，每只HBV转基因小鼠均经过严格检测，体内均有HBV的表达。24只HBV转基因小鼠随机分为3组pSUPER-HBV2组、pSUPER-HBV5组和pSUPER组，每组8只。
水压转染法(hydrodynamics-based transfection)给药按照HBV转基因小鼠体重的10％准备生理盐水溶液(1.5-2.0ml)，取40μg不同组别的质粒DNA溶于相应体积的生理盐水溶液中。将固定在捕鼠器外的小鼠尾消毒，用最小号头皮针穿刺尾静脉，回血后快速(＜5秒)将液体注射入小鼠体内。注射后第4、7天，各组分别处理4只小鼠，收集血样用于实验指标的检测，取肝组织制片，HE或免疫组织化学染色。
(2)siRNA对HBV转基因小鼠体内HBsAg的抑制作用抗HBV效果较好的pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV5和对照载体pSUPER经水压转染法注射入小鼠体内，血清中HBsAg测定结果显示，注入第4、7天时，pSUPER-HBV2对小鼠体内HBsAg的抑制率分别为59.3％和60.3％，pSUPER-HBV5的抑制率为26％、40％。表明pSUPER-HBV2在体内的抗HBV效果优于pSUPER-HBV5，第7天的结果比第4天的结果稍好(附图13)。
(3)siRNA抑制转基因小鼠体肝脏中HBsAg的表达C57BL/6J-HBV转基因小鼠各组织器官未见明显肉眼可见病变。光镜下C57BL/6J-HBV转基因小鼠肝细胞弥漫性肿胀，肝细胞胞质呈伊红均染(毛玻璃样变性)，局部可见巨核肝细胞，散在的单个肝细胞胞质固缩深染伴核固缩深染，部分肝细胞质中可见嗜酸性小体，胆管上皮细胞排列不整，胞质内嗜酸性物质增多(附图14)。C57BL小鼠肝组织未见明显病理改变。
将导入siRNA的HBV转基因小鼠肝脏固定，石蜡包埋，切片经脱蜡水化后进行免疫组织化学染色，结果观察到对照组(注射pSUPER质粒)HBV转基因小鼠肝细胞浆内有大量棕褐色颗粒(HBsAg)，而注射了40μg重组质粒7d的HBV转基因小鼠肝细胞内的棕褐色颗粒明显减少，染色阳性细胞所占比例降低。其中pSUPER-HBV2处理组HBV转基因小鼠的肝组织中HBsAg表达水平已接近正常的C57BL小鼠染色结果(图15)。
(4)siRNA抑制转基因小鼠体内HBV DNA的复制取转基因小鼠血清进行FQ-PCR检测HBV DNA，FQ-PCR结果表明pSUPER-HBV2在第4、7天时对小鼠体内HBV DNA的抑制率分别为67.6％和78.3％，pSUPER-HBV5的抑制率为60.3％、73％(图16)。说明载体转录的s iRNA能抑制转基因小鼠体内HBV DNA的复制。
(5)siRNA对转基因小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的影响肝脏中富含丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)，肝脏受损时ALT可释放到血清中，导致ALT生高，故检测血清ALT能反映肝脏的损害。
注射siRNA表达载体后，用速率法于7070自动生化分析仪上测定小鼠血清中ALT含量，结果显示注入pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV5第4、7d，小鼠体内ALT水平与对照组相比无明显差异(表2)。说明载体转录的siRNA体内应用时不会对肝脏造成损害。
表2 siRNA对转基因小鼠血清ALT的影响(x±s，n＝4)
序列表<110>杨安钢<120>HBV特异性干涉靶位点基因及其siRNA和其在抗HBV感染中的应用<160>15<210>1<211>19<212>DNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>1tgtcaacgac cgaccttga 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>2
tgtgcactt cgcttcacct 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>3ggctcagttt actagtgcc 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>4tagagtctc cggaacattg 19<210>5<211>19<212>DNA
<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>5tcctgctgct atgcctcat 19<210>6<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>6UGUCAACGACCGACCUUGAdTdTdTdTACAGUUGCUGGCUGGAACU<210>7<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)...(21)<400>7UGUCAACGACCGACCUUGAUUUUACAGUUGCUGGCUGGAACU<210>8<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>8UGUGCACUUCGCUUCACCUdTdTdTdTACACGUGAAGCGAAGUGGA<210>9<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>9
UGUGCACUUCGCUUCACCUUUUUACACGUGAAGCGAAGUGGA<210>10<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>10GGCUCAGUUUACUAGUGCCdTdTdTdTCCGAGUCAAAUGAUCACGG<210>11<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>11GGCUCAGUUUACUAGUGCCUUUUCCGAGUCAAAUGAUCACGG
<210>12<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>12UAGAGUCUCCGGAACAUUGdTdTdTdTAUCUCAGAGGCCUUGUAAC<210>13<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>13UAGAGUCUCCGGAACAUUGUUUUAUCUCAGAGGCCUUGUAAC<210>14<211>21<212>RNA
<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>14UCCUGCUGCUAUGCCUCAUdTdTdTdTAGGACGACGAUACGGAGUA<210>15<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B vifus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>15UCCUGCUGCUAUGCCUCAUUUUUAGGACGACGAUACGGAGUA。
权利要求
1.HBV特异性干涉靶位点基因，其具有序列表<400>1-5之一的序列。
2.由权利要求1所述的基因经人工合成或载体产生的siRNA，其具有序列表<400>6-15之一的序列。
3.如权利要求1所述的基因在制备用于抗HBV感染的治疗药物中的应用。
4.如权利要求2所述的siRNA在制备用于抗HBV感染的治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种乙型肝炎病毒(HBV)特异性干涉靶位点基因、上述基因生成的siRNA以及所述的基因和siRNA在制备用于抗HBV感染的治疗药物中的应用。本发明筛选所得到的HBV靶向基因，经载体表达后产生能特异性地识别和降解HBV的siRNA效应分子，无论是使用表达siRNA重组载体直接进行静脉注射，或将人工合成的siRNA注射入乙型肝炎患者体内，均能产生高效、特异的抗HBV作用。本发明筛选所得到的HBV靶向siRNA具有以下特点高度的特异性、高效性、持续性和安全性，本发明可望为HBV感染的治疗提供一种新手段。
文档编号A61P1/00GK1793359SQ20051009634
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月15日 优先权日2005年11月15日
发明者杨安钢, 刘家云, 李庆霞, 马龙洋, 黄红艳, 许彦鸣, 温伟红, 贾林涛, 孟艳玲, 王成济 申请人:杨安钢