专利名称：用d114拮抗剂抑制肿瘤生长的治疗方法
用D114拮抗剂抑制肿瘤生长的治疗方法 发明背景发明领域
本发明涉及用5样配体4(D114)拮抗剂抑制肺瘤生长的方 法。D114拮抗剂尤其可用于治疗对其它抗肿瘤剂无反应的肿瘤中的肿 瘤生长。相关技术的描述
Notch信号途径是各种真核生物在许多生物过程如分化、 增生和体内平衡中使用的细胞间交流的系统。5样4(D114)或5样配 体4(D114)(以下称"D114")是Notch配体的5族成员，其通过血管 内皮显示出高选择性表达(Shutter等，(2000) Genes Develop. 14: 1313-1318) 。Dl 14是一种Notch受体的配体，包括Notch 1和Notch 4。人和小鼠D114的核酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1-2和SEQ ID N0:3-4所示。已经产生了基因乾向的D114小鼠(Duarte等，(2004) Genes & Dev. 18: doi: 10. 1101/gad. 1239004; Krebs等，(2004) Genes & Dev. 18: doi: 10. 1101/gad. 1239204: Gale等,(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:15949-15954)。发明概述
下文中描述的实验表明D114拮抗剂在抑制肿瘤生长中是 有效的，尤其在对其它抗肿瘤治疗剂如血管内皮生长因子(VEGF)拮抗 剂不敏感的肿瘤中。
—方面，本发明特征在于能够抑制D114的D114拮抗剂。 在一实施方案中，D114拮抗剂为特异性结合D114和阻断D114与Notch 受体例如Notchl结合的抗体或抗体片段。在另一实施方案中，本发明的D114拮抗剂为包含与多聚化成分融合的D114胞外域或其片段的融 合蛋白。
用于本发明方法中的抗体或抗体片段可以是多克隆的或 单克隆的，并且可以是人源化的、嵌合的或完全人的。优选地该抗体 完全是人的单克隆抗体或单克隆抗体片段。抗体片段可以是例如单链 抗体、Fab、或F(ab02。
当D114拮抗剂为融合蛋白时，D114的胞外域或其片段或 经修饰的片段与多聚化成分融合。多聚化成分优选为免疫球蛋白功能 区，如Fc功能域，例如，人Fc(SEQ ID NO: 20)。融合蛋白任选地可 包含信号序列，其可以是细胞天生的、重组的或合成的。
在第二方面，本发明的特征为用于抑制血管生长或发展的 药物组合物，包含能够抑制D114活性的治疗剂和可药用载体。在一实 施方案中，治疗剂为阻断D114与Notch受体结合的抗体或抗体片段。 优选地，D114拮抗剂为能抑制D114与Notchl受体结合的完全人抗体 或其片段。在另一实施方案中，治疗剂为能结合其Notch受体的经修 饰的D114蛋白，但这种结合不导致受体的激活。
在第三方面，'本发明的特征为治疗D114介导的病症的方 法，包括施用能够抑制D114活性或表达的治疗剂。D114介导的病症 是一种需要抑制血管生长或发展的病症。本发明的D114拮抗剂可以尤 其用于治疗对其它治疗剂无反应的肿瘤或对其它治疗剂低于最佳敏感 的肿瘤。D114拮抗剂可阻断功能血管的产生和氧输送至肿瘤。在具体 的实施方案中，拮抗剂为抗D114抗体或抗体片段或融合蛋白。抗D114 抗体或抗体片段优选地抑制D114与Notchl受体的结合。本发明的融 合蛋白包含保留与Notch受体结合能力和缺少D114跨膜区和胞质尾区 的天然胞外区。在一实施方案中，本发明的D114拮抗剂在治疗上应用 以治疗对用VEGF拮抗剂治疗不敏感的肿瘤。
在其它方面，本发明的特征是能抑制5样配体4(D114)活 性的治疗剂为需要这种洽疗的患者抑制肺瘤发展或生长的用途。在一 实施方案中，治疗剂为抗体或抗体片段，或为多克隆或为单克隆。当治疗剂为抗体或抗体片段时，可以是人源化的、嵌合的或完全人抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段为单链抗体、Fab或F (ab') 2。 在一实施方案中，DU4拮抗剂为与多聚化成分融合的D114片段。一 方面，本发明的特征为如上定义的能抑制D114活性的治疗剂作为第一 治疗剂，与另 一种治疗剂f制备抑制肿瘤发展或生长的药物中的用途， 所述另一种治疗剂为血管'内皮生长因子(VEGF)抑制剂。优选地，VEGF 抑制剂为抗VEGF抗体或VEGF捕捉剂。当VEGF抑制剂为VEGF捕捉剂 时，治疗剂为具有如SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列的蛋白。 [OOll]其它目的和优点将在阅读详细的说明之后变得明了。附图概述
图l显示C6肿瘤细胞的D114-Fc过表达导致C6肿瘤变小。
图2显示全身给药的D114-Fc相对于受体型的VEGF拮抗 剂在减少HT1080肿瘤中是高效的。左侧在肺瘤植入时施予D114-Fc 或VEGF捕捉剂蛋白，在第25天采集肿瘤；右侧在植入后15天施予 D114-Fc或VEGF捕捉剂(Trap)蛋白，在第25天采集肿瘤。
图3显示纯&的D114-Fc蛋白或多克隆D114抗体抑制 HT1080肿瘤生长。
图4显示在表面胞质团共振(BiaCore逸)试验中，针对D114 的多克隆抗体对Dl 14与Notchl受体结合的抑制。详细说明
在描述本发明的方法之前，应当理解本发明不局限于所描 述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应当理 解本文中所用的术语只是为了描述特定的实施方案，而不是为了限制，因为本发明的范围将只受所附权利要求书的限制。
如说明书和所附权利要求书所使用的，单数形式"一种U，an)"和"该(the)"包括所指代的复数，除非上下文中另有明确规定。因而，例如"一种方法"包括本文中所述类型的一种或多种方法、和/或步骤，它们是在阅读本发明内容以及诸如此类的内容之后对本领 域技术人员是明了的。
除非另有定义，本文中所有的工业和科学术语与本发明所 属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管任何与本文中描述 的相似或等效的方法和材料都可用于本发明的实施或试验，但本申请 描述了优选的方法和材料。定乂
术语"D114相关的"或"D114介导的"病症或疾病指受 D114活性调节直接或间接影响的病症。更具体而言，D114表现出与血 管生长和发展有关。因此，在一实施方案中，能通过本发明方法治疗 的D114相关病症是一种需要抑制或减少D114介导的血管生长或发展 或成熟例如为抑制肿瘤发展的病症。
术语"抑制剂"或"拮抗剂"指延迟或阻止化学或生理反 应或响应的物质。可以直接的，例如通过以封闭性抗体抑制受体激活， 或者是间接的，由干扰编码D114基因的表达，抑制的D114活性。常 见的抑制剂包括但不限于反义分子、抗体、可溶性受体以及它们的衍 生物、和结合其Notch受体但不能通过这种结合激活信号的经修饰的 D114配体。
"中和"或"阻断"抗体，用来指结合D114导致D114生 物活性的抑制的抗体。这种D114生物活性的抑制可通过测量D114生 物活性的一种或多种指示物来评价。这类D114生物活性的指示物可通 过本领域已知的若干标准'的体外或体内检测中的一种或多种检测来评 价(参见下面的实施例)。优选地，对抗体通过抑制D114结合Notch 受体如Notchl来中和D114活性的能力进行评价。一般描述
5样/Notch信号途径在发展期间对建立有组织的和分级 的脉管系统是必要的。各种5样/Notch基因包括D114的靶向缺失， 会导致小鼠在胚胎发育期间由于严重的血管缺损而死亡。利用#:阵列分析，我们在小鼠异种移植肿瘤模型中发现5样配体4(D114)是一种 VEGF-调节的基因。另外，在这类肺瘤模型中还发现，与相邻的正常皮 肤中的D1M表达相比在肝瘤血管中D1M表达显著较高。为了探究阻 断肺瘤中D114/Notch信号的作用，在小鼠中进行异种移植研究，其中 可溶性D114-Fc分子由肺瘤细胞中逆转录病毒介导的过表达局部释放 或釆用腺病毒方法或通过注射纯化蛋白全身释放。与对照相比所有释 放D114-Fc的方法都导致肿瘤生长减少。另外，D114-Fc治疗的肿瘤 血管比对照具有更多的多支，形成具有密集血管发展的精细网络，但 这类血管比对照肿瘤的血管的效力差。如阵列和TaqmanTM分析所表明 的，这类作用与Notch信号降低有关。采用全身地注入到小鼠体内的 多克隆抗体溶液也观测到对肿瘤生长的类似作用。还发现这类多克隆 抗体溶液抑制D114与Notchl受体的结合。另外，还发现D114-Fc比 受体型的VEGF阻断剂("VEGF捕捉剂"，美国专利7， 070, 959)在减少 某些肿瘤的生长方面更有效。这些发现表明D114在肿瘤生长中起关键 作用，并支持D114作为靶子用于抗血管生成治疗的发展。D114拮抗剂
D114抗体。本文中所用的术语"免疫球蛋白或抗体"指 哺乳动物包括人多的肽，其包含特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白 基因或其片段的框架区，就本发明而言，其为D114蛋白或其部分。如 果所期望的抗体或抗体样蛋白将作为哺乳动物治疗剂使用，免疫球蛋 白结合区应当由相应的哺乳动物免疫球蛋白衍化而来。若该分子打算 用于非治疗剂应用，如诊断和ELISA，则免疫球蛋白结合区可由人或 非人哺乳动物如小鼠衍化而来。人免疫球蛋白基因或基因片段包括K ， 入，oc, y， 5， e和iLi恒定区，以及种种免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为K或入。重链分类为Y， M， ct, 5或s，其依次分别定 义免疫球蛋白类型，IgG， IgM， IgA， IgD和IgE。在各IgG类中，存 在各种同型(例如IgGn IgG2， IgG3， IgG,)以及它们的异型。
示例性的人IgG的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚 体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每一多肽链对具有一条轻 链(约25 kD)和一条重链(约50-70kD)。每条链的N-末端定义约 100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语"可变轻链"(V,)和可变重链(VH)分别指这类轻链和重链。
抗体以完好的免疫球蛋白形式存在，或以许多充分表征的 通过各种肽酶消化产生的片段形式存在。例如，胃蛋白酶消化在绞链 区中的二硫键下的抗体产生F(ab)、 一种Fab的二聚体，它本身是通 过二硫键与VfCH连接的轻链。F(ab)、在温和的条件下可被还原以使 绞链区中的二硫键断裂，从而将F (ab) 、二聚体转化为FaV单体。Fab' 单体基本上是具有部分绞链区的Fab。尽管各种抗体片段根据完整抗 体的消化而定义，但技术人员更愿意这种片段可以从头化学合成或釆 用重组DNA方法合成。因此，本文中所用的术语抗体，还包括通过整 体抗体经修饰产生的抗体片段，或采用重组DNA方法从头合成的抗体 片段(例如，单链Fv (scFv)单可变域(Dabs))或采用显示库如噬菌体大 肠杆菌或酵母菌显示库鉴定的抗体片段(参见，例如，McCafferty等 (1990) Nature 348:552—554)。
制备抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Kohler& Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.， Cold Spring Harbor, NY)。从非人的生物体如小鼠、大鼠、兔、奶牛分离 出的抗体，可通过嵌合或人源化使其更类似人。
非人(例如，鼠)抗体的"人源化"或嵌合的形式为由非人 免疫球蛋白衍化的含有结合抗原所需最小序列的免疫球蛋白、免疫球 蛋白链或其片段(如Fv， Fab, Fab'， F(ab')2或其它结合抗原的抗体 序列)。它们与小鼠或其它非人抗体具有相同或相似的结合特异性和亲8和性，其提供构建嵌合的或人源化的抗体的起始原料。嵌合抗体为其 轻链和重链基因已经典型地通过遗传工程由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建的抗体。例如，源自小鼠单克隆抗体的基因的可变(v)片段可与人恒定(C)片段如IgGl和IgG4连接。因此典型的嵌合抗体为 由小鼠抗体中的V或抗原结合区域和人抗体中的C或效应器功能域构 成的杂化蛋白。人源化的抗体具有基本上源自人抗体的可变区框架残 基(称为受体抗体)和基本上源自小鼠抗体的互补决定区(CDR区)(称 为供体免疫球蛋白)。参见，Queen等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:10029-10033 (1989)和WO 90/07861， U. S.专利5, 693, 762 、 5, 693, 761、 5, 585, 089、 5， 530， 101和5， 225, 539。恒定区，若存在， 也基本上或完全来自人免疫球蛋白。人可变域通常选自人抗体，其框 架序列显示出与获得CDR的鼠可变区功能域高度的序列同一性。重链 和轻链可变区框架残基可源自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列 可以是天然的人抗体序列或可以是若干人抗体的共有序列。参见WO 92/22653。基于其对CDR构建和/或对抗原结合的可能影响，选择源自 人可变区框架残基的某些氨基酸用以置换。这种可能影响的研究是通 过模拟、检验特定位点的氨基酸特性或者经验性观察特定氨基酸的置 换或突变的效应进行的。例如，当鼠可变区框架残基和经选择的人可 变区框架残基之间氨基酸不同时，通常人框架氨基酸将被来自小鼠抗 体的等效框架氨基酸置换，条件是合理预期氨基酸(l)非共价直接结 合抗原；(2)与CDR区邻接；(3)否则与CDR区(例如在约6A的CDR区 之内)相互作用，或(4)参与Vl-Vh界面。其它用于置换的候选者是在该 位置上对于人免疫球蛋白稀有的受体人框架氨基酸。这类氨基酸可被 来自小鼠供体抗体的等效位置或来自更典型的人免疫球蛋白等效位置 的氨基酸置换。其它用于置换的候选者是在该位置上对于人免疫球蛋 白稀有的受体人框架氨基酸。人源化的免疫球蛋白的可变区框架通常 显示与人可变区框架序列至少85%序列同一性或与这样的序列的一 致性。
产生人抗体的方法包括，例如，VelocImmuneTM(RegeneronPharmaceuticals), XenoMouseTM技术(Abgenix) ， "mini locus"方法 和噬菌体展示。VelocImmuneTM技术(US 6， 596， 541)包括产生对选定抗 原具有高特异性的完全人抗体的方法。该技术涉及具有包含可操作性 连接至内源性小鼠恒定区位点的人重链和轻链可变区的基因组的转基 因小鼠的产生，使得小鼠响应抗原刺激产生包含人可变区和小鼠恒定 区的抗体。编码该抗体的重链和轻链的可变区的DNA经分离并可操作 性连接至编码人重链和轻链恒定区的DNA。然后在能表达完全人抗体 的细胞中表达所述DNA。在具体的实施方案中，细胞为CH0细胞。
XenoMouse 技术(Green等(1994) Nature Genetics 7: 13-21)产生同时具有源自重链和K轻链位点的人可变区和恒定区的 小鼠。在另一方法中，其他人已经使用了 'minilocus"方法，其中通 过包含源自Ig位点的各个基因模拟外源性Ig位点(参见，例如，US 5， 5"， 80"。编码人重蜂和轻链恒定区的DNA可操作性连接或不连接 编码可变区的DNA地被分离。
或者，噬菌体展示或相关展示技术可用于鉴定特异性结合 D114的抗体、抗体片段，如可变域和异侧的(heteromeric)Fab片段。 (例如参见美国专利公开2003/0229023)。
优选免疫球蛋白(抗体)的筛析和选择可通过本领域已知 的各种方法进行。例如，对于特异性针对D114的单克隆抗体的存在的 初步筛选可通过使用基于ELISA的方法或噬菌体展示进行。优选地进 行第二道篩选以鉴定和选择所需的单克隆抗体。第二道篩选可用本领 域已知的任何适宜的方法进行。 一种优选的方法，称为"Biosensor Modification-Assisted Profiling" ( "BiaMAP")描述于美国专利 申请公开2004/101920。 BiaMAP可以迅速识别产生具有所需特性的单 克隆抗体的杂交瘤克隆。更具体而言，基于抗体抗原相互作用的评 价将单克隆抗体分类为性质不同的表位相关组。或者，基于ELISA型、 珠型或Biacore忠型的竟争分析可用于鉴定结合对，所述结合对结合不 同的D114表位并因此可能以高亲和性协作结合配体。[Q033]D114融合蛋白。当D114拮抗剂为融合蛋白时，多聚化成分可选自(i)免疫球蛋白功能区，(n)截断的多聚化成分，(iii)长度 为1-约500个氨基酸的氨基酸序列，任选地包含至少一个半胱氨酸残 基，(iv)亮氨酸拉链，(v)螺旋环基序和(vi)巻曲螺旋基序。在优选的 实施方案中，多聚化成分优选为免疫球蛋白功能区，优选为Fc功能域， 例如，人Fc(SEQ IDN0:20)。融合蛋白可任选地包含信号序列，它可 包括技术人员已知的有关细胞直接分泌多肽或蛋白质的任何序列，包 括天然的或合成的序列。通常，信号序列位于本发明融合蛋白的开始 或氨基末端。这种信号序列可以是细胞天生的、重组的或合成的。本 发明的融合蛋白的成分可相互直接连接或通过一个或多个间隔序列连 接。在一优选的实施方案中，这些成分相互直接融合。在另一优选的 实施方案中，这些成分与编码1-200个氨基酸的间隔区的核酸序列连 接。任何本领域已知的间隔区都可用来连接蛋白质成分。间隔区序列 也可包括用于增加融合蛋白表达的序列，提供限制位点，和允许成分 功能域形成最佳的三级和四级结构和/或增加成分与其受体相互作用。 在一实施方案中，本发明的融合蛋白包含一种或多种成分(在1-25个 氨基酸之间)之间的 一 个或多个肽序列。
Dl 14的胞外域由5 /Serrate/Lag-2 (DSL)功能域和八个表 皮生长因子(EGF)样重复单元的串联体构成。通常，EGF功能域被认为 是出现在大约218-251 (功能域1)， 252-282 (功能域2), 284-322 (功 能域3), 324-360 (功能域4)，和362-400 (功能域5)的位置，DSL功 能域出现在大约173-217的位置，N-末端功能域出现在大约hD114 (SEQ ID NO: 2)的27-172的位置。在具体的实施方案中，能抑制D114 活性的hD114拮抗剂为与hFc(SEQ ID NO:20)融合的包含SEQ ID NO: 2 的约氨基酸27至约172的DSL-hFc(SEQ ID NO: 21)，与hFc融合的包 含SEQ ID NO: 2的约27-217的N-末端功能域-DSL-hFc (SEQ ID NO: 22)， 与hFc融合的包含约218-400的EGF功能域1-5-hFc (SEQ ID NO: 23)， 与hFc融合的包含约218-360的EGF功能域1-4-hFc (SEQ ID NO: 24)， 与hFc融合的包含约218-322的EGF功能域1-3-hFc (SEQ ID NO: 25)， 与hFc融合的包含约218-282的EGF功能域1-2-hFc (SEQ ID NO: 26)，或在功能域成分之间任选地包含连接子的其变体。融合蛋白的成分在保留其充当D114性能的同时还可以是各种构型排列。 给药方法
技术领域：
本发明提供治疗方法，包括给患者施用有效量的本发明的 治疗剂。优选地，治疗剂基本上被纯化(例如，基本上不含限制其作用 或产生不希望的副作用的物质)。患者优选为动物，例如，奶牛、猪、 马、小鸡、猫、狗等，且优选为哺乳动物，最优选为人。
各种给药系统是已知的且可用于施用本发明的治疗剂，例 如脂质体形式的包嚢、微粒、微囊、能表达化合物的重组细胞、受体 介导的胞吞(参见，例如，Wu and Wu， 1987， J. Biol. Chem. 262: 4429-4432)、作为逆转录病毒的一部分的核酸的构建或其它载体 等。引入的方法可以经肠道或肠胃外的，包括但不限于真皮内、肌内、 腹腔内、静脉内、表皮下、鼻内、硬膜外和口服的途径。化合物可通 过任何方便的途径给药，例如通过输注或快速推注、通过上皮或皮粘 膜的内膜层吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)，且可与其它生 物活性剂一起给药。施用可以是全身的或局部的。此外，将本发明的 药物组合物通过任何适宜的途径引入中枢神经系统可能是合乎需要 的，所述途径包括心室内和鞘内注射；心室内注射通过心室内导管变 得更为方便，例如连接储液器，如Ommaya储液器。也可以釆用肺部给 药，例如，通过利用吸入器或喷雾器和含雾化剂的制剂给药。
在具体的实施方案中，将本发明的药物组合物局部施用于 需要治疗的部位可能是合乎需要的；例如，这可非限制性地通过下述 方式实现在外科手术期间通过局部输注，局部施用，例如，通过注 射，借助导管，或通过植入，所述植入物为多孔的、无孔的、或凝胶 状的材料，包括膜，如sialastic膜，纤维，或商品化的皮肤替代物。
在另一实施方案中，活性剂可以以嚢泡(vesicle)、特别 是脂质体的形式递送(参见Langer (1990) Science 249:1527-1533)。 在另一实施方案中，活性剂可以以控释系统的形式递送。在一实施方案中，可以使用泵(参见Langer(1990)上文)。在另一实施方案中，可 以使用聚合材料(参见Howard等(1989) J. Neurosurg. 71:105)。在 另一实施方案中，其中本发明的活性剂为编码蛋白的核酸，核酸可体 内施用以促进其编码的蛋白的表达，通过将其构建为适宜的核酸表达 载体的一部分并将其施用使其成为细胞内，例如通过利用逆转录病毒载体(参见，例如，美国专利4, 980, 286)，或通过直接注射，或通过 利用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic， Dupont),或以脂质或细胞 表面受体或转染剂包衣，或通过以与已知会进入细胞核的同源异型框 样肽连接的形式将其施用(参见例如，Joliot等，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868)。作为选择，可通过同源重组将核酸 引入细胞内和并入宿主细胞DNA用于表达。药物组合物
本发明还提供药物组合物。这种组合物包含治疗有效量的 活性剂和可药用载体。术语"可药用的"指经联邦或州政府管理机构 批准的或者列在美国药典或其它公认的药典上的供动物尤其是人用 的。术语"负载剂，，指与治疗剂一起给药的稀释剂、辅助剂、赋形剂 或载体。这类药用负载剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动 物、植物或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。适 宜的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦酒、大米、 面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、 脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还 可以含少量的湿润剂或乳化剂或pH緩冲剂。这类组合物可采取溶液、 混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶嚢、粉剂、緩释制剂等形式。组合物 可与常规的粘合剂和负载剂如甘油三酯一起配制成栓剂。口服制剂可 包括标准的负载剂如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精 钠、纤维素、碳酸镁等。适宜的药物负载剂的实例描述于E.W. Martin 的 "Remington's Pharmaceutical Sciences"。
在优选的实施方案中，组合物按常规方法配制成适合于静脉给药于人的药物组合物。必要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻 醉剂如利多卡因以在注射部位镇痛。在组合物要输注给药的情况下， 它可省去装有无菌药用级水或盐水的输液瓶。在组合物注射给药的情 况下，可提供一安瓿的灭菌注射水或盐水以便在给药之前各成分可以 混合。
本发明的活性剂可以中性或盐的形式配制。可药用盐包括 与游离氨基形成的盐，如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等获得 的盐。以及与自由羧基形成的盐，如由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化 铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、 普鲁卡因等获得的盐。
本发明的活性剂在治疗D114介导的病症中有效的量可基 于本申请的说明通过标准的临床技术来确定。此外，体外试验可任选 地运用以帮助确定最佳的剂量范围。用于制剂中的精确剂量还将取决 于给药途径和病症的严重程度，并根据医师的判断和每个患者的情况 来决定。不过，静脉给药的适宜剂量范围通常为每公斤体重约0. 5至 20毫克的活性化合物。鼻内给药适宜的剂量范围通常为约0. 01 pg/kg 体重至1 mg/kg体重。有效剂量可由从体外或动物模型试验系统获得 的剂量-反应曲线来外推。联合治疗
在许多实施方案中，本发明的D114可与一种或多种另外 的化合物或治疗联合应用。例如，多重融合蛋白或抗D114抗体可共同 给药或与连同一种或多种治疗化合物一起给药。在优选的实施方案中， 本发明的D114抑制剂与,VEGF拮抗剂，如抗VEGF抗体或VEGF捕捉剂 一起给药。VEGF捕捉剂的优选实施方式(按照WO 00/75319中的描述) 为VEGFR1R2 - FcACl(a)。
本文中所用的术语"细胞毒剂"指抑制或阻止细胞的功能 和/或导致细胞破坏的物质。该术语是指包括放射性同位素(例如I131、 I125、 Y"和Re186)、化疗剂、以及毒素如细菌、霉菌、植物或动物来源的酶活性毒素、或其片段。
联合治疗包括含本发明的D114拮抗剂和一种或多种VEGF 拮抗剂的单一药物剂量配制剂的给药；以及D114拮抗剂和一种或多种 另外的治疗剂以其各自独立的药物剂量配制剂的给药。例如，D114拮 抗剂和细胞毒剂、化疗剂或生长抑制剂可以单一剂量组合物如联合配 制剂 一起施用于患者，或者每种治疗剂可以独立的剂量配制剂施用。 在应用独立的剂量配制剂的情况下，本发明的融合蛋白和一种或多种 另外的治疗剂可同时给药、或在错开的时间给药即顺次给药。
"化疗剂"为用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括 烷化剂如塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN );烷基磺酸酯类如白消安、英 丙舒凡和旅泊舒凡；氛丙咬:ft口 benzodopa、卡S皮酉昆、meturedopa和 uredopa ; 亚乙基亚胺类 (ethylenimines )和甲基蜜胺类 (methylamelamines )包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺 (trietylenephosphoramide )、 三亚乙基硫代磷酰胺和 trimethylolomelamine;氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺、 雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氧化氮芥盐酸化物、美法仑、新氮芥、 苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲类如卡莫司 汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；如 aclaci誦ysins、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、 放线菌素C、 calicheamicin、 carabicin、洋红霉素、嗜癌素、色霉 素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨 酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂 霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、 噪罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、 乌苯美司、净司他丁、佐乘比星,；抗代谢物如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶 (5-FU);叶酸类似物如三甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌 呤类似物如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物 如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷卡莫氟、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱 氧脲苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上 腺素类如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如frolinic酸； 醋葡醛内酯；醛磷酰胺；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil;比生 群；依达曲沙；def of amine;秋7jc仙胺；地吖醌；elf orni thine;依 利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍 腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔 比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；锗 螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2， 2、 2"-三氯三乙胺；氨基曱酸 乙酯；长春地辛；达卡巴溱；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇； 哌泊溴烷；gacytosine;阿糖胞苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替派； 紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)和多西紫杉醇(TAXOTERE ; Aventis Antony, France);苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-疏鸟嘌呤；巯噪呤；曱氨蝶呤； 铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16);异环磷酰 胺；丝裂霉素C;米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵； 替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11;拓 朴异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟甲基鸟氨酸(DMF0);视黄酸； esperamicins;卡培他滨；以及上述任何药物的可药用盐、酸或矛汙生 物。在该定义中还包括起作用调节或抑制胂瘤活动的抗激素剂如抗雌 激素，例如包括他莫昔芬，雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑，4-羟泰米芬，曲沃昔芬，keoxifene， LY 117018，奥那司酮和托瑞米芬 (Fareston);以及抗雄激素如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞 林和戈舍瑞林；以及上述任何药物的可药用盐、酸或衍生物。
"生长抑制剂"在本文中使用时指在体外或在体内抑制细 胞、尤其是癌细胞生长的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻 断细胞周期进展的治疗剂(在非S期的位置)，如诱导Gl停止和M-相 停止的治疗剂。典型的M-相阻断剂包括长春胺(长春新碱和长春碱)、 TAX0I^，和topo II抑制剂如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊 苷和博来霉素。那些停止G1的治疗剂还过剩进入S相停止，例如DNA烷化剂如他莫昔芬，泼尼松，达卡巴溱，氮芥，顺铂，曱氨蝶呤，5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。实施例
给出以下实施例是为给本领域普通技术人员就如何制备 和应用本发明的方法和组合物提供完全的公开和说明，而不旨在限制 发明人对其发明考虑的范围。已经努力地确保所用数字(例如，量，温 度等)的正确性，但应说明存在一些实验误差和偏差。除非另有说明， 份数为重量份数，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，压力为大气 压或接近大气压。实施例1:在小鼠中靶向D114基因。
基因导向。使用VelocigeneTM技术(Valenzuela等(20(J3) Nat. Biotechnol. 21: 652-9)产生精确的DIM编码区的缺失和交换， 从开始到终止密码子(相当于包含所有编码外显子和插入内含子的 8.1 kB区)延伸，含b-半乳糖苷酶指示基因以及新霉素选择盒 (selection cassette)。简单地说，对含8. 1 kb Dl 14编码区和140Kb 的侧翼序列(源自由Incyte基因组获得的129/SvJ BAC库的克隆475d4) 的细菌人工染色体(BAC)进行修饰以产生BAC型的把栽体，然后将其线 化并用作靶载体以置换F1H4 (C57BL/6: 129杂交种)小鼠胚胎干(ES)细 胞中的Dl 14基因。采用天然等位基因损失(LONA)分析法鉴定正确耙向 的胚胎干细胞(Valenzuela等(2003)上文)。使用两个独立的正确把向 ES系产生嵌合的雄性小鼠，它是ES-产生的精子的完整传递者。然后 将嵌合体繁殖成C57BL/6和/或ICR雌性以产生F1小鼠或胚胎，通过 LONA分析法和p-半乳糖苷酶组织化学分析法对其进行基因型分析。 两者均由ES系获得的小鼠表现相同，由两者克隆的合并(pooled )数 据用于统计。
结果。在小鼠中靶向D114基因导致胚胎致死现象和严重 的血管缺损，甚至在以单个等位基因靶向的小鼠中也会出现(参见Gale等(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:15949-15954)。
肿瘤植入。将Lewis肺癌细胞(ATCC)皮下植入D114嵌合的小鼠肋部，16天之后采集，切成80微米切片，并按照描述对CD31/PECAM或P-半乳糖苷酶染色(Holash等(2002) Proc Natl. Acad.Sci. USA 99:11393-8)。
PECAM和报道分子染色。对整体装载的胚胎、以及源自胚胎和成体的组织切片，按照前述用于CD31/PECAM的方法进行染色以界定血管内皮，用于P-半乳糖苷酶的方法染色以使D114指示基因产物显像(Gale等(2004) PNAS 101:15949-54)。实施例2. D114-Fc构建和小鼠异种移植研究。
D114-Fc (-TM)构建。构建具有2297个核苷酸的核酸序列， 其相应于人D114的胞外域(SEQ IDNO: 1)，不含跨膜(-TM)功能域，含 人Fc功能域。该编码的氨基酸序列具有D114蛋白的765个氨基酸(SEQ ID NO: 18)，分子量为大约85kDa。
图1显示C6肿瘤细胞的D114-Fc过表达导致C6肿瘤变小 (平均值土SD)。
肿瘤细胞过表达D114-Fc的逆转录病毒工程。使C6大鼠 胶质瘤肿瘤细胞(ATCC)感染逆转录病毒以过表达绿荧光蛋白(GFP)和 可溶性D114-Fc;感染上GFP的细胞单独用作对照。将细胞进行FACS 分选用于GFP荧光两次。
逆转录病毒释放的D114-Fc。用GFP或D114-Fc逆转录病 毒工程的C6细胞以106个细胞/小鼠皮下植入剃光的雄性SCID/CB17 小鼠(8-10wk大)右肋。
肿瘤体积测量在肿瘤变得明显之后，记录每三天一次使 用游尺的尺寸测量(尺寸- (长度x宽度72)。 一处死动物，就用游尺 得到离体测量并利用公式长度x宽度x高度)计算体积。
肿瘤组织学。在肿瘤细胞植入12至16天以后，采集肿瘤 并处理以进行组织或表达分析。将胂瘤切成80 um切片，以抗体染至CD31/Pecam-1之后进行DAB-过氧化物酶反应，并用派洛宁Y复染。利 用NIH Image 1. 62分析程序进行血管形态测定分析。
Northern印迹和实时-PCR。使用Trizol试剂(Life Technologies, Grand Island, NY)由肿瘤组织制备总RNA。在1.2% 琼脂糖凝胶上分离RNA(IO mg)，转入尼龙膜上并通过UV交联固定。 在预杂交之后，加入32P标记的Dl 14或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) -特异性探针，并将滤料在42'C杂交过夜。以标准方案进行严格洗涤(一 次洗涤0.5 X SSPE緩沖液之后用0.2 X SSPE緩沖液洗涤两次，每次 在55。C进行30分钟)。在暴露于带有增感屏(intensifying screens ) 的X光胶片48 h之后获得自动射线照相。此外，使用Taqman (Applied Biosystems， Foster City, California)实时PCR化学和检测系统在 分开的反应中分析组织特异性表达，所述系统具有引物对和对D114、 notch受体1和4和notch下游耙向、Hesl、 Hey2、 HeyL和Nrarp特 异的标记探针。获得达到cDM扩增阈值(或CT值)所必需的循环数目， 标准化为内操作参照(housekeeping reference) (GAPDH) ( = 2-DCT)。 将结果标准化为基线，实验的媒介物对照，得到相对的mRNA丰度变化 (- 2DDCT)并用至少4个分开的样品重复三次的平均值± s. e. m.来表示 (Livak and Schmittgen (2001) Methods. Dec; 25 (4): 402-8)。
对D114、 HeyL Nrarp和Hesl进行定量的RT-PCR分析。 按照描述进行RT-PCR分析(Livak等(200D Methods 24: 402-8)。结 果用目标RM量与对照RM (GAPDH)量之比来表示，其中所述的量按照 描述(Daly等，(2004) Genes Dev. 18: 1060-71)在Applied Biosystems 7900HT上使用如下的特异性引物和探针获得D114引物 D114-1574F(SEQ ID NO: 9)和Dl 14-1644R(SEQ ID NO: IO)和D114探针 D1 14-1594T(SEQ ID NO: 11); HeyL引物:mHeyL-135F(SEQ ID NO: 12) 和mHeyL-216R(SEQ ID N0:13)和HeyLProbe: mHeyL-154T(SEQ ID NO: 14); Nrarp引物mNrarp-350F( SEQ ID NO: 15 )和mNrarp-418R (SEQ ID NO: 16)和Nrarp探针mNrarp-373T: (SEQ ID NO: 17)和mHes 1 (ID Mm00468601 ml, Hesl) (ABI, Assay on demand services)。 cDNA从C6-D114-Fc和C6-D114肿瘤中获得。
体外分析测定C6细胞中表达分泌的D114-Fc是否激活 HUVEC中的Notch信号。将4 x 105 HUVEC细胞平铺在60 mm平皿上 在随后的几天得到~ 50%铺满培养物。第二天，将8 x 105 C6细胞铺 在HUVECs的上层。在24小时的共培养之后，将细胞破碎入1 ml的 Tri试剂中并按照前述方法制备总RNA。使用人特异性Hesl、 HeyL和 Nrarp探针以Taqman②分析样品。实施例3. D114-Fc全身给药的作用。[Q062]D114-Fc蛋白。将上述编码D114-Fc cDNA构建体的质粒 转染到CHO细胞中，并将分泌性蛋白从上清液中纯化。将D114-Fc蛋 白纯化并用于经皮下注射(IO mg/kg,每周3x)治疗有胂瘤的小鼠。
结果。进行实验，其中将HT1080肿瘤按上述方法在第0 天植入小鼠。在第O天或第15天(以100腿s的尺寸)，用纯化的D114-Fc 蛋白(10mg/kg，每周3x)或对照蛋白治疗小鼠。用VEGF拮抗剂(VEGF 捕捉剂，SEQ ID N0:19)以25 mg/kg的剂量，每周三次治疗其它组。 结果如图2所示。在第O天开始治疗的肿瘤中(左侧)，VEGF拮抗剂和 D114-Fc都能有效控制肿瘤生长。在尺寸为100 mi^的肿瘤中(右边)， D114-Fc也有效地控制肺瘤生长，事实上比VEGF拮抗剂更有效。
循环性D114-Fc和hFc的定量。通过ELISA分析法对从 GFP或D114-Fc治疗的有肿瘤的小鼠中获得的血清样品进行分析。通 过以hFc作为俘获抗体覆盖平皿进行ELISA，用0.2% I-阻断溶液 (Tropix)阻断，并使用与过氧化物酶缀合的hFc作为报道抗体。将纯 化的hFc和Dl 14-Fc蛋白包括在标准曲线内。
VEGF-抑制剂治疗。将VEGF捕捉剂(R1R2) (Regeneron Pharmaceuticals) (SEQ ID NO: 19)或空白对照剂(5 % v/v PBS /甘 油)以25 mg/kg的剂量每A天一次皮下施用于具有100 mm3肿瘤的小 鼠，直到研究结束。
D114-Fc的腺病毒递送。没有给出的其它实验应用腺病毒全身递送D114-Fc。将C6、 HT1080或MMT肿瘤细胞皮下植入剃光的雄 性SCID/CB17小鼠(8-10wk大)右肋。24小时之后，将lxl(fpfu的 腺-hFc或腺D114-Fc注入到小鼠的颈静脉内。用腺-D 114-Fc观察到与 用D114-Fc蛋白全身治疗相似的结果。实施例4. D114-Fc的多克隆抗体对HT1080肿瘤的作用。
进行实验，其中将HT1080肿瘤按上述方法在第0天时植 入小鼠。当肿瘤达到100 111013时(大约在15天)，用Dl 14-Fc单独(25 mg/kg)、对照抗体(兔Ig)、或去除(depleted)结合人Fc的抗D114多 克隆抗体每周三次治疗小鼠(IO mg/kg)。结果显示各治疗组中的肿瘤 尺寸土S.D.(图3)。 D114抗体对抗HT1080肿瘤生长是高效的，具有与 D114-Fc所观察到的相似效力。这些结果表明D114特异性阻断剂是有 效的抗肿瘤剂。
进行表面胞质团共振(81&(:016 )分析以证实D114抗体能 阻断D114与Notch受体结合。将Notch 1覆盖在碎片(chip)表面上并 将DU4-Fc用递增量的兔多克隆抗D114抗体(如上所述)温育。图4 中的结果表明递增量的D114抗体增加地阻断D114-Fc与Notchl结合 (对照-Dl 14-Fc +非特并性兔多克隆抗体)。
权利要求
1.能抑制δ样配体4(D114)活性的治疗剂的用途，用于在需要其的患者中抑制肿瘤的发展或生长。
2. 按照权利要求1的用途，其中能够抑制D114的治疗剂为抗体或 抗体片段。
3. 按照权利要求2的用途，其中D1M抗体或抗体片段为多克隆的 或单克隆的。
4. 按照权利要求3的用途，其中抗体或抗体片段为人源化的、嵌 合的或完全人抗体或抗体片段。
5. 按照权利要求4的用途，其中抗体片段为单链抗体、Fab或 F(ab02。
6. 按照权利要求1的用途，其中D114拮抗剂为与多聚化成分融合 的D114的片段。
7. 权利要求1至6中定义的能抑制D114活性的治疗剂作为第一治 疗剂，与另一种治疗剂在制备抑制肿瘤发展或生长的药物中的用途，所 述另 一种治疗剂为血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂。
8. 按照权利要求7的用途，其中VEGF抑制剂为抗VEGF抗体或VEGF 捕捉剂。
9. 按照权利要求8的用途，其中VEGF捕捉剂为SEQ ID NO: 19。
全文摘要
抑制肿瘤发展或生长的治疗方法，包括给需要这种治疗的患者施用能抑制人δ样配体4(D114)活性的治疗剂。在一实施方案中，治疗剂为能抑制D114与Notch受体结合的抗D114抗体或抗体片段。在另一实施方案中，治疗剂为包含与多聚化成分如Fc功能域融合的D114胞外域或其片段的融合蛋白。本发明的方法用于抑制肿瘤生长，尤其用于对其它治疗剂不敏感的肿瘤。
文档编号A61K39/00GK101330925SQ200680047372
公开日2008年12月24日 申请日期2006年12月15日 优先权日2005年12月16日
发明者E·史密斯, G·瑟斯顿, I·诺格拉, N·盖尔 申请人:瑞泽恩制药公司