专利名称：抑制miR-130b基因表达的siRNA和表达载体及其在制备提高肝癌治疗效果的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制miR-130b基因表达的siRNA和表达载体及其在制备提高肝癌治疗效果的药物中的应用。
背景技术：
发明人前期的实验研究已证明了膜表面蛋白CD133可以作为肝癌肿瘤干细胞 (cancer stem cell，CSC)的分子标记物，用来分选肝癌CSC(Ma et al. ,Gastroenterology 132 :2542-2556,2007)。最近，比较了 CD133阳性和阴性肝癌细胞间micro-RNA的表达谱，发现了 miR-130b是表达差异最大的micro-RNA。进一步研究发现miR_130b的表达与肝癌CSC 呈正相关，miR-130b可以通过抑制TP53INP1蛋白的表达而增加细胞的自我更新能力，而自我更新能力是肿瘤干细胞的标志之一(Ma et al. ,Cell Stem Cell 7 :694-707,2010) DCSC 是目前肿瘤研究的热点之一，因为CSC具有比其它肿瘤细胞对化疗药物更强的耐药性(Ma et al.，Oncogene 27 :1749-1758,2008)。
发明内容
本发明提供了一种特异性抑制miR-130b基因表达的siRNA，其中，所述miR_130b 的序列如 SEQ ID NO :1 所示,具体如下cagugcaaugaugaaagggcau。所述 siRNA 的序列如 SEQ ID NO 2 所示，具体如下atgccctttcatcattgcactg，作用部位是互补结合区域。本发明还提供了一种特异性针对miR_130b基因的表达载体，所述表达载体含有上述序列的siRNA。上述序列的siRNA或/和上述的表达载体可应用在制备提高肝癌治疗效果的药物中。该药物以靶向抑制miR-130b基因的药物为有效成分。本发明通过设计特异性抑制miR_130b基因表达的siRNA及载有miR-130b反义链核苷酸的表达载体，通过其与miR-130b特异性结合而阻断miR-130b的功能，进而阻断肝癌 CSC的自我更新能力，提高其对化疗药物的敏感性。下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是异种移植的肝细胞癌(HCC)临床标本中细胞表面抗原标记(⑶133)的表达与高肿瘤分期和不良预后有关的一系列实验结果图；图IA是从NT组织或HCC组织标本中分解得到的单个细胞或其相应的在蜡包埋甲醛固定组织切片，对其进得CD133染色后的流式细胞结果图；图IB是从NT组织或HCC组织标本中分解得到的单个细胞或其相应的在蜡包埋甲醛固定组织切片，对其进得CD133染色后的免疫组化结果图IC是⑶133的高表达与高复发率相关的分析图；图ID是⑶133的高表达与低完全生存率相关分析图；图2是从HCC患者的临床标本中分离到的CD133+细胞的成瘤性和干细胞样特性一系列相关实验的结果图；图2A是HCC临床标本中⑶133+细胞的流式细胞点图；图2B是肿瘤异种种植实验结果图；图2C是⑶133+TICs和⑶133_细胞连续第一代和第二代体外培养结果图；图2D是CD133+细胞在不同的培养液中培养得到未分化和分化的球状肿瘤，分别将肿瘤溶解分离得到单个细胞的流式直方图分析结果图；图2E是对未分化和分化的⑶133+细胞的干细胞相关基因和多重耐药转运蛋白基因的表达进行qPCR分析的实验结果图；图2F是对从新鲜切除的肿瘤标本中分离到的CD133+TICS和CD133_细胞的qPCR 分析结果图；图3是从新鲜切除的HCC临床标本和未分化的球状肿瘤分离到的CD133+TICS中， miR-130b高水平表达一系列相关实验的结果图；图3A是HCC标本(左，蓝色阴影，分析肿瘤数η = 5)和HCC细胞系PLC80M和 Huh7(右，浅褐色阴影)miRNA的分析图；图;3B是对一组肝细胞系的⑶133的表达(蓝色线条)和miR_130b的表达(红色线条)的分析图；图3C是在15例HCC临床标本中，与CD133"细胞相比，CD133+TICs中miR_130b的表达升高的qPCR检测后的散点分析图；图3D是对未分化球状肿瘤(” sphere”)和分化的贴壁肝癌细胞(”diff”)中 miR-130b的表达情况的qPCR的结果图；图3E不同培养环境下HCC细胞系PLC80M分别形成未分化(” sphere” )和分化 (”diff”)肿瘤，在经化疗药顺钼(1.6yg/ml)和多柔比星(0. 25yg/ml)处理后，检测其 miR-130b的表达情况的分析图；图4是miR_130b在调节⑶133+TICs自我更新、生长增殖、成瘤性和耐药性中的作用一系列相关实验的结果图；图4A是将miR-130b表达载体或空载体转染入CD133阴性细胞(CD133 miR_130b 和CD133—EV)后，细胞增殖试验结果图；图4B是将miR_130b表达载体或空载体转染入CD133阴性细胞后，qPCR检测其干细胞相关基因表达结果图；图4C是经浓度为0 μ g/ml (对照)和2 μ g/ml的多柔比星处理后⑶133+细胞和 ⑶133 miR-130b、⑶133—EV所剩活性细胞的百分比实验结果图；图4D是⑶133 miR-130b与⑶133_EV相比，体外能够形成更多数量的球状肿瘤的实验结果图；图4E是利用Xenogen系统对CD133 miR_130b所形成的原发肿瘤进行GFP显像的实验结果图；图4F是(左和中)在异种种植连续传代试验中，取出第二代和第三代小鼠体内的种植肿瘤并用于体外培养肿瘤形成试验结果图；图 4G 是 qPCR 分析细胞系 Huh7 和 PLC8024 中 CDl细胞(CD133TV 和 CD133 miR-130b)和 CD133+细胞(ZIP CTRL 禾Π ZIP miR_130b) CD133 的表达情况的实验结果图；图5是TP53INP1是miR_130b的直接靶点的一系列相关实验结果图；图5A是Venn简图，显示=PicTar (红)、TargetScan (蓝)和mRNA表达谱分析 (绿)所预测的可能为miR-130b靶点的侯选mRNA ；图5B是小鼠(mmu 小家鼠)，大鼠(rno 褐家鼠)，猴(mml 恒河猴)，母牛(btau 欧洲牛)和人(has 智人)的miR-130b和TP53INP13’非编码区(TP53INP13’ UTR)两个预测的 miR-130b 可能的结合位点nt3927_3953 和 nt5525_5562 ；图5C是HCC临床标本和细胞系中miR_130b和TP53INP1表达的荧光活性分析结果图；图5D是对一组肝细胞系的⑶133 (蓝线)和miR_130b (红线)的表达与 TP53INP1 (绿线)的表达的分析结果图；图5E是在同样的HCC细胞系中，通过免疫印迹检测⑶133和TP53INP1的表达的实验结果图； 图5F是在15例HCC临床标本中，CD133+TICs与其CD133-对照细胞相比，TP53INP1 的表达的qPCR实验分析的散点图；图5G是利用线性回归和Pearson相关来描述15例HCC临床标本中CD133+细胞与CD133-细胞中miR-130b和TP53INP1表达的图；图5H是免疫印迹分析新鲜切除的HCC和HCC细胞系中⑶133+细胞与⑶133—细胞 TP53INP1的表达情况结果图；图51是qPCR分析新鲜切除的HCC和HCC细胞系中CD133+细胞与CD133_细胞 TP53INP1的表达情况结果图；图 5J 是 qPCR 检测 CD133-细胞(CD133TV 和 CD1331niR-130b)和 CD133+细胞(ZIP CTRL和ZIP miR-130b)TP53INPl的表达情况结果图；图阢是免疫印迹检测CD133-细胞(CD133TV和CD133 miR_130b)和CD133+细胞 (ZIP CTRL 和 ZIP miR-130b)TP53INPl 的表达情况结果图；图6是TP53INP1调节⑶133+TICs的肿瘤形成和自我更新能力的一系列相关实验结果图；图6A是17例HCC标本及其配对的比邻NT组织中TP53INP1的表达的免疫印迹检测实验结果图；图6B是组织芯片中TP53INP1的表达的具代表性的结果图；图6C是shRNA干扰PLC80MCD 133—细胞TP53INP1的表达并形成了一系列克隆， 免疫印迹检测克隆464和4095与未作处理的对照PLC80MCD133-细胞(NTC)及TP53INP1 的表达情况结果图；图6D是免疫印迹检测克隆464和4095的生长增殖能力的情况结果图；图6E是印迹检测克隆464、4095在体外形成球状肿瘤的情况结果图；图6F是克隆464、4095和对照NTC细胞经皮下注射入小鼠的右后臂，在SCID/
5Beige小鼠体内形成的肿瘤(黑色箭头为皮下肿瘤，每组小鼠的个数η = 6)。图6G是鼠体内形成的肿瘤进行Η&Ε染色，组织学检验结果图；图6Η是细胞接种后每隔10天测量一次肿瘤体积，连续15周。图61是克隆464和4095能够在第二代小鼠体内形成种植肿瘤图6J是转染了 ΤΡ53ΙΝΡ1的⑶133+细胞能起始体外球状肿瘤的形成并连续传代的实验结果图；图6Κ是前述细胞在免疫缺陷小鼠身上的成瘤能力的实验结果图，黑色箭头代表较大的肿瘤，而白色箭头代表较小的肿瘤。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需说明的是，以下实验中所用到的实验方法除了常规的操作方法外，几类实验的实验操作方法可见如下具体方法1.临床活体组织标本在人类实验伦理准则委员会规定的伦理准则指导下，我们从83例手术切除的肝癌病人身上获取相应的新鲜肿瘤组织标本和其比邻的相对正常组织。病人组织标本取自于2008年和2009年香港皇家玛丽医院或者威尔王子医院。病人手术前都没有进行局部或全身治疗。疾病的诊断都是由病理医生基于显微镜下肿瘤细胞的形态特征进行组织学鉴定的。病人肿瘤分期是通过美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)的肿瘤分期系统确定的。手术切除后，20分钟之内获取组织，并立刻剪碎，用VI型胶原酶 (Sigma-Aldrich ；Louis, M0)酶解，然后在含有青霉素(500U/ml)和链霉素(500ug/ml) DMEM/F12培养液重悬组织碎块。将悬液滤过IOOum的滤膜(BDBiosciences ；Franklin Lakes, NJ)获得单细胞悬液。通过蔗糖密度梯度离心的方法除去死细胞和红细胞，残余的红细胞用ACK缓冲液裂解。活细胞数通过台盼兰染色进行计数分析。2.⑶133生存相关性的临床样品研究我们的41例肝癌组织标本取自2000年到2005年香港皇家玛丽医院做了手术切除的肝癌病人。这些病人包括了 37例男性病人和4例女性病人，年龄介于观到80岁(中位年龄为55岁)。根据AJCC/UICC的分期系统进行肿瘤分期。表Sl为病人的临床信息总结。在收集病人肝癌标本之前所有病人都知情并获得了他们的同意，该研究也通过了香港大学伦理委员会的审核。3.细胞分选和流式分析我们用PE标记的小鼠单克隆抗体抗人CD133/1(AC133，Miltenyi Biotec ； Auburn, CA)标记肝细胞进行流式细胞分选。小鼠IgGlk-PE(eBioscience ;San Diego, CA)用作同源异性抗体。应用BD FACSVantage SE(BD Biosciences)对样品进行分析并分选。阳性细胞中的25%强阳性的细胞和阴性细胞中的20%非阳性细胞分别选作阳性细胞群和阴性细胞群。我们用磁珠标记的CD133/1抗体(AC133，Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec)结合酶解的肝癌组织标本的肿瘤细胞来进行磁珠分选。每例病人标本用磁珠分选两次。分选得到的细胞用结合CD133抗原另一个抗原决定簇的抗体(CD133/2，AC141,Miltenyi Biotec)来分析并控制其纯度。细胞活性用台盼蓝染色进行分析。来源于病人组织和小鼠异种种植瘤经分选了的与未被分选的细胞，用PE标记的⑶133/1 (AC133， Miltenyi Biotec)抗体与小鼠IgGlk-PE (eBioscience)作为同源异性抗体分析其CD133 表达情况。分别用FITC标记的小鼠单克隆抗体抗人⑶31抗体(eBiosciences)和FITC 标记的小鼠单克隆抗体抗人CD45抗体(clone2Dl，Stem Cell Technologies)或者小鼠 IgGlk-FITC同源异性抗体，分析⑶133+细胞群中的⑶31内皮细胞和⑶45淋巴细胞。应用 FACScalibur apparatus 仪器进行流式细胞分析，并用 CellQuest 软件(BD Biosciences) 对数据进行分析。4. miRNA表达谱分析j^M Stem Cell miRNA qPCR (System Biosciences ；Mountain View, CA) 分选细胞的总RNA进行miRNA表达谱分析，其中包含了 95个在细胞的自我更新和分化上有潜在功能的人类miRNA。人类小分子核内TORNA用作扩增的标准化对照。所有miRNA都在 Sanger miRBase 数据库里已注册。用 SYBR Green 进行 qPCR 扩增，用 System Biosciences 提供的软件进行数据分析处理。5.动物模型及小鼠电荷耦合器件成像实验所用动物实验的操作规程，都符合香港大学关于教学与研究使用活体动物的准则。实验通过对4到5周SCID/Beige小鼠的肝脏进行原位注射或者皮下注射，以检测细胞的成瘤性。原位注射的方法新鲜获取的肿瘤细胞通过分选得到CD133+和CD133-细胞， 悬浮于完全培养液后，分别以1 1的比例与基质胶(BD Biosciences)混合，原位注射到小鼠肝脏内。miR-130b移植实验中，miR-130b的antagomirs或反义对照用于转染CD133+ 肿瘤起始细胞，而miR-130b或空载体用于转染CD133-细胞，转染后的细胞用完全培养液悬浮后都接种于小鼠皮下。每组实验设八只小鼠。肿瘤形成后，每3天用游标卡尺测量一次瘤的大小，而肿瘤的体积通过公式Volume (cm3) = L*W2*0. 5计算获得。小鼠处死后，即刻对小鼠肿瘤部分进行成像。简而言之，利用Xenogen IVIS 100冷却电荷耦合器件摄像机 (Caliper Life Sciences ;Hopkinton，MA)。曝光时间从30秒到1分钟。灰度图像获取后， 再对肿瘤部分获取荧光图像。通过对灰度图像与ph0t0ns/s/cm2的散射光重叠，来显示动物的肿瘤图像。在TP53INP1移植实验中，慢病毒介导的TP53INPl-shRNA细胞或转染了非特异shRNA的对照⑶133-细胞用完全培养液悬浮后，接种于小鼠皮下。每组实验设六只小鼠。成瘤后，对肿瘤组织进行冰冻切片(5微米厚)，并用于HE和IHC染色。接种了肿瘤细胞的小鼠，5个月没有形成明显肿瘤的，将被处死终止，并切开接种肿瘤细胞的部位，以确定其未形成肿瘤。6.统计学分析I^M Microsoft Office Excel software (Microsoft Corp. ；Redmond, WA) ,IlJ^ 数据中的异常值后，进行独立样本t检验，所有数据都应用PASW Statistics 18. O (SPSS, Inc. ；Chicago, IL)进行分析。P值小于0. 05认为有统计学差异。不同临床病理分期⑶133 表达的差异通过X2检验来分析。Δ Ct值落在1/2标准差士均数范围内的病例被剔除。 Δ Ct值低于均数-1/2标准差的病例被认为⑶133高表达，而Δ Ct值高于均数+1/2标准差的病例被认为⑶133低表达。利用Kaplan-Meier方法和log-rank检验来比较原发肿瘤 ⑶133阳性和原发肿瘤⑶133阴性患者生存率之间的差异，生存率定义为从手术至死亡这一时间段，而未死亡的患者定义为从手术至上一次随访的时间段。检验组织芯片中癌旁非肿瘤肝组织和肝细胞癌组织表达Τρ53ΙΝΡ1的均数有无差异所用的配对t检验中，134例患者的标本只有77例有意义，剩余57例由于癌旁非肿瘤肝组织和肝细胞癌组织中都不表达 Τρ53ΙΝΡ1而被排除。实施例1.肝细胞癌临床标本中⑶133阳性肝脏肿瘤起始细胞(⑶133+TICs)的鉴别本实验室的前期工作已鉴别出一类肿瘤起始细胞，它们存在于异种移植的肝细胞癌(HCC)和细胞系中，具有细胞表面抗原标记⑶133.⑶133+细胞能够广泛增殖，显示出更强的自我更新和分化的潜力，表达干细胞相关标记并且在肿瘤中维持着低的出现率.⑶133+细胞还能够通过激活Akt/PKB通路导致HCC的耐药性.对异种移植的HCC和细胞系中这类⑶133+TICs的鉴别和描述提示，在原发HCC临床标本中，⑶133也同样可以成为一种肿瘤起始细胞标记。因此，作为第一步，我们利用流式细胞术和免疫组化(IHC)来检测取自HCC患者的新鲜组织标本中⑶133的表达。总共分析了 35例患者，流式细胞提示在 HCC标本中CD133+细胞的出现率很低，范围在1. 3%到13. 6% (图1A)。流式细胞过程中分别利用⑶45和⑶31来排除造血祖细胞和内皮祖细胞对⑶133+细胞群的潜在污染。结果显示⑶133+细胞中全造血系的标记⑶45为阴性，只有不到1. 3%的⑶133+亚群可能为⑶31+ 的内皮祖细胞(图2A)。接下来的组织学对CD133+细胞的分析结果与流式细胞的结果相似 (图1B)。所有的HCC标本再次证明了 CD133+细胞群只占少数，相比之下，相应的癌旁非肿瘤肝组织(NT)中CD133几乎不表达(图IA和1B)。由于继临床标本收集之后的随访期不够长，无法计算CD133的表达与无瘤生存率和总生存率之间的相关性。但是，对更早期收集到的41份HCC组织标本的实时定量PCR(qPCR)的分析结果和随访数据显示CD133表达增高不仅与更高的肿瘤分期相关，而且与更高的复发率和更低的总生存率相关。和低肿瘤分期(I期或II期)相比，肝细胞癌中CD133的表达增高与高肿瘤分期(III期或IV期)的关联性更大(X2检验，ρ = 0. 008 ；图1C)。而且，关联性分析显示⑶133 Δ Ct值与这41例 HCC患者的肿瘤分期呈负相关(n = 38，Pearson相关，r = -0. 428，X2检验，ρ = 0. 007)。 Kaplan-Meier生存分析显示，当与那些原发肿瘤⑶133阴性或低表达的患者相比，原发肿瘤CD133阳性的患者具有更低的无瘤生存率(前者均数估计=61. 49月，后者均数估计= 13. 75月)(log-rank检验，ρ = 0.001 ；图ID).此外，CD133表达还与长期总生存率相关， 原发肿瘤⑶133阳性的患者平均总生存率为27. 11个月，相比之下，原发肿瘤⑶133阴性或低表达的患者平均总生存率为78. 51个月(log-rank检验，ρ < 0. 001).单变量COX回归分析同样鉴别出肿瘤分期与无瘤生存率的紧密关联，CD133表达与无瘤生存率和总生存率都相关.然而，CD133的表达与年龄，性别，AFP含量和肿瘤大小的关联性不大.接下来，我们分析从HCC新鲜切除标本中分离的CD133+TICS的成瘤性和干细胞样特性。初步数据证实，将肿瘤组织分解成单个细胞，要求至少70 %的细胞具有活性才能保证在体成瘤性试验和离休肿瘤形成试验的顺利进行。在收集到的83对HCC标本和相应NT组织中，只有四分之一(n = 21)的标本分解所得到的细胞活性大于70%，因此，只有这21份样本用作下一步的研究得用流式细胞术对CD133表达细胞进行初筛(n = 35)。清除无活性细胞后，再通过磁珠分选对⑶133+TICs进行富集，进一步使⑶133+细胞的纯度达到可观的82% -92%，更重要的是，可以使⑶133_细胞的纯度大于98%。同样地，在流式中分别利用⑶45和⑶31来排除造血祖细胞和内皮祖细胞的潜在污染。对细胞进行分选之后，我们研究了肿瘤来源的⑶133+细胞和⑶133_细胞在SCID/ Beige小鼠常位异种种植和产生肿瘤的能力。大约需要⑶133_肝癌细胞5X105悬浮于基质胶中才能偶尔起始肿瘤的形成，然而，相比之下，只需要将2X104CD133+细胞悬浮于基质胶中，8周之后就可产生肉眼可见的肿瘤(图2B数据代表被检测到的8个肿瘤)。这些数据提示能够起始HCC的细胞都富集于⑶133+细胞群中。加之，组织学分析显示⑶133+细胞异种种植产生的肿瘤，在组织学类型上与原发肿瘤相同(数据未列出)。为了研究CD133+ 肝癌细胞是否具有长期的成瘤性，我们测试了它们在连续种植试验中形成肿瘤的能力。从第一代异种种植形成的肿瘤中分别分选出CD133+和CD133—细胞，再将其种植到第二代小鼠体内，只有CD133+肿瘤细胞能够形成肿瘤。第二代种植与第一代种植相比，肿瘤形成的速度更快，成功形成肿瘤的小鼠数目更多(第二代为85%，第一代为65% )，证明第二代种植肿瘤的生长更具优越性(图2B)。从肿瘤的形态上，难以分辩其来自第一代种植肿瘤还是原发肿瘤。因此，存在于HCC组织中的⑶133+细胞群能够在连续异种种植中形成肿瘤，提示其具有在体自我更新能力。接下来，我们检测了⑶133+TICs和⑶133—细胞在非粘性，无血清，添加有生长因子的培养液中生长成球状肿瘤的能力，这种培养液能够促进未分化细胞的增殖。在培养的 3周时间内，得到球状肝细胞癌，由处于生长状态的CD133+细胞组成，而CD133_肿瘤细胞在这种无血清培养液中失去活性无法生长(图2C，数据代表被检测的7个肿瘤)。更重要的是，从这些⑶133+细胞组成球状肿瘤组织分解而来的单个细胞能够在接下来的连续传代中增殖形成克隆，显示出无限的生长能力。CD133+细胞扩增生长成为球状肝细胞癌时，癌组织内的细胞依然是CD133+细胞。为了鉴定这些CD133+细胞的分化能力，向球状肿瘤的培养液中添加10%的血清，同时去除表皮生长因子和成纤维生长因子2，经过几天的培养后，球状肿瘤开始分化，粘附于培养上成为贴壁细胞，与未分化的球状肿瘤相比，这些贴壁细胞经体外诱导分化后⑶133的表达量降低(图2D，数据代表被检测的7个肿瘤)。⑶133+细胞形成球状肿瘤各连续传代的能力提示其具有离体自我更新能力。同样地，CD133+TICS细胞团体外诱导分化后，干细胞相关基因，包括Bmi-1，Notch 1，Sox2, Oct-4, nanog, β-catenin， Smo,nestin和多重耐药转运蛋白ABCG2和ABCBl的表达都降低了(图2E，数据代表被检测的3个肿瘤)。除此之外，来源于患者HCC组织的⑶133+TICs，与⑶133_细胞相比，其干细胞相关基因的表达水平更高，包括nanog，Oct-4，ABCBl和Sox2 (图2F，数据代表被检测的3 个肿瘤)。综上所述，这些数据证明HCC中具有表面标记⑶133的肿瘤起始细胞的存在，并且这些细胞能够产生肿瘤，具有干细胞特性，包括自我更新，分化和体外形成肿瘤的能力。实施例2. CD133+TICS及其对照CD133_细胞的miRNA表达谱对⑶133+TICs进行鉴别之后，下一步的实验就要来描述这类细胞发挥其功能的潜在机制及其在肿瘤进展过程中所起的作用。miRNA被认为是一类在转录后水平基因表达的重要调控因子，调节着细胞分化、胚胎干细胞的发育，还用肿瘤进展与演变。鉴于此， 我们假设是否是因为miRNA的表达差异使得⑶133+TICs具有与其分化后代不同的特性。 我们从HCC患者的切除标本与肝癌细胞系中分离出⑶133+TICs和⑶133—细胞，通过基于 SYBR-Green的qPCR miRNA芯片，对其进行miRNA表达分析。这些芯片包含95个已被详细描述过的与干细胞自我更新和分化潜能特性有关的miRNA。在HCC患者的肿瘤标本和肝癌细胞系中显示出大于2倍差异的miRNA被认为是有意义的。在临床肝癌标本中，总共找到5 个上调和M个下调的miRNA。同样地，在所有肝癌细胞系中有4个上调和9个下调的miRNA 被鉴别出来。我们推测相关的miRNA应该同时出现于原发肿瘤与肝癌细胞系中。因此，我们结合这两份数据并将其绘制成Verm图，并观察到总共有8个异常表达的miRNA，它们同时出现于所有细胞中2个上调的miRNA (miR-130b和miR-367_5p)和6个下调的miRNA (let_7a， miR-30c, miR-33, miR-153, miR-I 和 miR-10b)(图 3A)。为了验证 miRNA 表达谱分析的结果，我们进行了第二轮的qPCR，所用到的是更加精确的Taqman探针，相应的靶点为肝癌细胞系PCL80M和Huh7，⑶133+细胞中共同异常表达的miRNA和一系列⑶133表达程度不同的肝癌细胞系(数据为显示)。优先考虑的那些异常表达的miRNA确实得到了验证，但是，在探针测试中，两个对照miRNAOiiiR-M和miR-92)的表达未发生变化。然而，只有miR_130b 的表达与所检测的肝癌细胞系中CD133的表达密切相关(图:3B)。肝癌细胞系中CD133表达低的，miR-130b的表达也相对较低(HeG2，H2P，H2M)，相对于CD133表达高的肝癌细胞系，miR-130b的表达也相对较高(PLC8024，Huh7，H印3B)(图。鉴于此，同时由于其在 ⑶133+TICs中异常表达水平高，我们将研究的焦点定于miR-130b。实施例3.从新鲜切除的HCC临床标本分离到的CD133+TICS中，miR_130b高水平表达除了在最初的miRNA筛选试验中所用到的5例HCC临床标本，我们还通过qPCR检测从另外15例新鲜切除的HCC临床标本分选到的CD133+TICS和0)133_肿瘤细胞miR_130b 的表达情况。我们还分选了来自于体外培养的球状肿瘤⑶133+TICs和⑶133_肿瘤细胞中 miR-130b的表达情况。与CD133—对照细胞相比，CD133+细胞群miR-130b的表达更高(N = 15，P = 0. 018 ；图3C)。此外，那些高表达⑶133来自于患者的肿瘤标本与那些不表达⑶133 或体外分化的肿瘤细胞相比，其miR-130b表达更高(图3D)。肝癌细胞系PLC80M经多柔比星和顺钼(它们都是临床上常规的肝细胞癌化疗药)处理后，qPCR分析显示其高水平表达miR-130b，与CD133高表达情况相对应(P < 0. 05 ；图3E)。实施例4. miR_130b显示出更强的增值、自我更新与肿瘤形成能力和对常规化疗药物的抗性我们进一步研究miR_130b是如何调控⑶133+TICs的成瘤性、自我更新的潜能和耐药性。我们将包含有miR-130b的pri-miR序列的慢病毒载体稳定转染Huh7CD133_或 PLC80MCD133—细胞，转染后细胞表达高水平的miR_130b成熟体。经XTT细胞生长试验检测(图4A)，与转染了空载体的对照细胞(CD133—EV)相比，转染了 miR_130b的CD133-细胞(CD133 miR-130b)中，干细胞相关基因也高表达，包括β-catenin，Notch 1，Sox2， nestin, Bmi-I，和ATP结合盒半转运蛋白ABCG2 (图4B)。并且，过量表达miR_130b CD133-细胞也对化疗药物多柔比星具有更强的耐药性(图4C)。我们接着检测增加miR-130b的表达对自我更新和肿瘤生长产生的影响。⑶133miR-130b细胞比⑶133_EV细胞，在显著缩短的时间内产生更大更多的球状肿瘤(图4D)。重要是转染了 miR-130b的球状肿瘤能从第一代传至下一代，而对照细胞形成的球状肿瘤却不能传代。将这两种细胞种植入SCID/ Beige小鼠的胁侧面，⑶133 miR-130b细胞的生长显著增强(图4E)。每组的8只小鼠当中，⑶133 miR-130b肝癌细胞注射入小鼠皮下后，将近9周时，能够在其中的4只小鼠体内产生肿瘤，而CD133_EV对照细胞或没有转染的CD133_R癌细胞不能在小鼠体内产生肿瘤。相反的，慢病毒转染PLC80MCD133+TICS敲除miR-130b(ZIRniR-130b)产生相反的结果， 与只转染了反义对照(ZIP CTRL)的CD133+TICs或不转染的CD133+肝癌细胞相比具有更低的体内肿瘤形成能力(表1，表1是转有/无miR-130b的⑶133+⑶133_的成瘤率)。同样的，miR-130b表达的细胞在体连续传代F，二代小鼠时能够产生更多的肿瘤(数据未列出)，离体的第三代球状肿瘤也提示miR-Bob能够增强细胞的自我更新能力(图4F)。 ⑶133+TICs和表达miR-130b的⑶133_细胞形成的肿瘤在组织结构和形态上无明显差异。 总之，表达⑶133 miR-130b与⑶133TV相比，显示出与⑶133+TICs更接近的特性。相反的， 与CD133+TICs相比，miR-130b表达受抑制的CD133+细胞(CD133+ZIP miR_130b)显示出与 ⑶133_细胞更接近的特性。增高或降低miR-130b的表达未影响⑶133的表达，提示，尽管 miR-130b的表达受CD133调节，但CD133表达却不受miR_130b的调节(图4G)。表 权利要求
1.一种特异性抑制miR-130b基因表达的siRNA，其特征在于，所述miR-130b的序列如 SEQ ID NO 1所示，所述siRNA的序列如SEQ ID NO 2所示。
2.一种特异性针对miR-130b基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的siRNA。
3.权利要求1所述的siRNA或/和权利要求2所述的表达载体在制备提高肝癌治疗效果的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用于提高肝癌治疗效果的药物以靶向抑制miR-130b基因的药物为有效成分。
全文摘要
本发明提供了一种特异性抑制miR-130b基因表达的siRNA，miR-130b的序列如SEQ ID NO1所示，siRNA的序列如SEQ ID NO2所示。还提供了一种特异性针对miR-130b基因的表达载体，该载体含有上述序列的siRNA。该siRNA或/和该表达载体可应用在制备提高肝癌治疗效果的药物中。该药物以靶向抑制miR-130b基因的药物为有效成分。本发明通过特异性抑制miR-130b基因表达的siRNA及载有miR-130b反义链核苷酸的表达载体，通过其与miR-130b特异性结合而阻断miR-130b的功能，进而阻断肝癌CSC的自我更新能力，提高其对化疗药物的敏感性。
文档编号A61P35/00GK102168085SQ201110033919
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者关新元, 李焱, 李锦华, 邓君豪, 陈国华, 马桂宜 申请人:中山大学肿瘤防治中心