专利名称：Sars等冠状病毒主蛋白酶的二萜类天然产物抑制剂及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及药物的筛选，更具体而言，涉及以SARS、TGEV、AIBV等冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性筛选和晶体结构为基础，从鄂西香茶菜中筛选二萜类天然产物抑制剂的方法。
背景技术：
SARS (Severe Acute Respiratory Sydrome)为引起严重急性呼吸道综合症(非典型性肺炎)的简称，其病原体为冠状病毒属的一种病毒(Peiris J. et al. Lancet, 2003, 361: 1319-1325)。冠状病毒是正链RNA病毒。冠状病毒属隶属于冠状病毒科。在目前已知的正链RNA病毒中，它们的基因组是最大的(Siddell，S.G.等人Coronaviruses， toroviruses, and arteriviruses. in Topley & Wilson, s Microbiology and Microbia Infections, IOth edition, Vol. Virology (eds. Mahy, B. W. J. & ter Meulen, V.) 823-856 (Hodder Arnold, London, 2005)。这个属含有约沈个种；按照它们的自然宿主、 基因序列以及血清型关系，这个属又可以分为三个组群其中第一组群包括TGEV，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus (猪传染性胃肠炎病毒)等；第二组群包括SARS冠状病毒等；第三组群包括AIBV，Avian Infectious Bronchitis Virus (禽传染性支气管炎病毒)等(Spaan, W. J. M. and Cavanagh, D. Coronaviridae. in Virus taxonomy, VIIIth Report of the ICTV. 945-62 (Elsevier-Academic Press., London, 2004)。SARS冠状病毒2/3到3/4的基因组编码了两个复制酶多蛋白(r印Iicase polyproteins) ppla禾口pplab (Ziebuhr, Snijder et al. 2000； Thiel, Herold et al. 2001; Anand, Yang et al. 2005; Ziebuhr 2005)，它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制(Ziebuhr, Snijder et al. 2000; Anand, Yang et al. 2005; Bartlam, Yang et al. 2005)o SAI 冠状病毒主要蛋白Onain protease，简称主蛋白酶)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标。天然产物又称次级代谢产物(Secondary Metabolites)，具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ, Gragg GM, Snader KM. Nat Prod R印，2000，17(3) :215-234; Lee K-H. J Nat Prod. 2004，67 O) : 273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是一个小分子化合物的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能够有效抑制冠状病毒主蛋白酶活性的中药小分子抑制剂。本发明的又一个目的是提供所述中药小分子抑制剂在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物中的用途。本发明的另一个目的是提供一种筛选冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法。本发明提供的一种筛选冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法包括如下步骤
A、将冠状病毒主蛋白酶的晶体与备选样品接触浸泡，得到冠状病毒主蛋白酶与小分子抑制剂复合体的晶体。B、收集并分析步骤A中得到的复合体的晶体的X射线衍射数据，获得与冠状病毒主蛋白酶结合的小分子抑制剂的电子密度。C、以步骤B中获得的与冠状病毒的主蛋白酶结合的小分子抑制剂的电子密度为基础，鉴定与冠状病毒主蛋白酶结合的小分子抑制剂，获得小分子抑制剂与冠状病毒主蛋白酶复合体的精细三维结构。D、测定小分子抑制剂对冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。本发明所用的备选样品，优选用如下方法制备
(a)、取一定量的初级原料，用乙醇溶液回流提取，合并提取液，浓缩得浸膏；
(b)、称取一定量步骤(a)中所得的浸膏，用双蒸水悬浮，用有机溶剂萃取，分离有机溶剂相和水相；合并水相，备用；合并每次有机溶剂萃取物，蒸除其中的有机溶剂，得到干膏状有机溶剂相样品，备用；
(C)、蒸除步骤(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量有机溶剂，用大孔树脂柱层析分离，依次用水和乙醇溶液为流动相洗脱；弃去水洗部分，蒸除乙醇溶液洗脱部分的溶剂，得干膏状样品备用；
(d)、上述步骤(b)中制得的干膏状有机溶剂相样品和步骤(c)中制得的干膏状样品即为源自一种初级原料的2个备选样品。本发明中所用的初级原料优选为鄂西香茶菜。本发明的鄂西香茶菜各备选样品可采用如下方法制备
取500克干燥粉碎的鄂西香茶菜药材，用4500毫升95%乙醇回流提取，提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩得浸膏。称取此浸膏20. 5克，用150毫升双蒸水悬浮，倾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次萃取用乙酸乙酯650毫升，充分振摇，静置6-10小时分层。萃取后得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯萃取物用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状鄂西香茶菜乙酸乙酯萃取样品，备用。萃取后的水相部分用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯， 用HP-20型大孔树脂柱层析分离(大孔树脂用170毫升，玻璃柱规格30 X 300 mm)，依次用水、50%乙醇为流动相洗脱。先用水洗脱8次，每次洗脱250毫升，弃去水洗部分。然后用 50%乙醇洗脱5次，每次洗脱300毫升，合并各次50%乙醇洗脱得到的洗脱液。将50%乙醇洗脱部分使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状鄂西香茶菜水相大孔树脂 50%乙醇洗脱样品，备用。上述乙酸乙酯萃取样品和水相大孔树脂50%乙醇洗脱样品即为鄂西香茶菜对 SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性的备选样品。步骤B中晶体的X射线衍射数据收集与整理可采用如下方法
首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从晶体浸泡液中获取浸泡一定时间 (浸泡时间控制在2 - 48小时之间)的晶体，并迅速使用Rigaku公司的冷却系统或Oxford Cyrosystem公司的冷却系统，将晶体在以上所述的两种冷冻系统产生的低温氮气流中冷冻至零下150°C — 180。C ；使X射线通过晶体，使用旋进法收集X射线衍射数据。在收集到将靶标蛋白质的晶体与天然产物混合物备选样品接触后的晶体的X射线衍射数据后，需要按照下述步骤进行相应的数据处理
首先，使用HKL2000等(包括MoSflm、D*trek等)衍射数据处理程序包等本领域已知的常用的数据处理的方法，对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；
其次，使用CNS或者CCP4程序包中的Wiaser、Molrep等各种分子置换(Molecular Replacement)程序等本领域已知的常用的数据处理方法，利用分子置换(Molecular Replacement)的方法，以靶标蛋白的母体晶体结构为初始模型，得到候选的靶标蛋白与靶分子的复合体的精细三维结构；
再次，使用程序0、COOT、XtalView等可视化程序包等本领域已知的常用的数据处理的方法，观测可能的靶标蛋白与抑制剂或者配体小分子复合体的电子密度。如果此时发现，在靶标蛋白相应的活性位点，有不属于蛋白质分子本身的、不属于溶剂分子的、不属于结晶溶液中存在的分子的未知电子密度存在，并且该电子密度与靶标蛋白的活性位点的氨基酸有产生包括氢键作用、共价作用等在内合理的化学环境，则可以确认此天然产物混合物备选样品中，有抑制剂小分子等配体分子与靶标蛋白结合。本发明中的冠状病毒包括SARS冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒或者禽传染性支气管炎病毒。本发明还对鄂西香茶菜各分离段位(即用萃取、大孔树脂等方法分离得到的各个部分的样品)、王枣子甲素进行了 TGEV、AIBV等冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定。由于鄂西香茶菜中所含的成分是相当复杂的，因此必须对其粗提物进行优化，目的是去除对SARS冠状病毒主蛋白酶体外活性测定和晶体浸泡实验中的干扰因素如蛋白、 多糖等，保留成药性较好的小分子并使之尽量集中，提高其相对浓度，以制备适用于以SARS 冠状病毒主蛋白酶晶体结构为基础进行抑制剂筛选的备选样品。本发明不仅提供了可以实现这一目的制备备选样品的技术方案，而且对筛选有抑制活性的样品，用各种色谱、波谱方法分离、鉴定了其中小分子抑制剂-王枣子甲素的结构。目前，基于SARS冠状病毒主蛋白酶晶体结构为基础进行的药物筛选，所发现的小分子抑制剂绝大多数为SARS冠状病毒主蛋白酶底物类似物及其衍生物(Dariusz P.， Marcin H., Marcin G.， et al. Chem. Biol. Drug. Res. , 2007， 69: 269—279; Haitao Y. , Wenqing Χ. , Xiaoyu Χ. , et al. PLOS Biology, 2005，3 (10): 1742-1752)，这类多肽类抑制剂不仅造价昂贵，而且口服利用度低，在血液中的半衰期短，对制服SARS感染发病带来了难度。本发明筛选出的抑制剂-王枣子甲素，为不含肽键的二萜类天然产物，其在20 μ M的浓度时仍对SARS冠状病毒主蛋白酶显示出较强的抑制活性，是极好的药物或潜在的药物前体。另外，我们通过分析SARS冠状病毒主蛋白酶与王枣子甲素结晶复合物的精细三维结构发现，与王枣子甲素结构类似的一些二萜类化合物会结合在SARS冠状病毒主蛋白酶的活性位点，从而产生抑制活性。这为进一步的药物设计和筛选提供了宝贵的依据和参考。本发明发现王枣子甲素是能够有效抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性的抑制剂。本发明发现鄂西香茶菜可治疗冠状病毒如SARS冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒或者禽传染性支气管炎病毒感染。本发明发现王枣子甲素可治疗或者预防冠状病毒如SARS冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒或者禽传染性支气管炎病毒感染。本发明发现具有下结构通式(I)的化合物能与SARS冠状病毒主蛋白酶结合并产生抑制作用。下结构通式(I)的化合物或其药学可接受的盐或溶剂化物与一种或多种药学可接受的载体组成的药物组合物可用于治疗或者预防冠状病毒如SARS冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒或者禽传染性支气管炎病毒感染。其中 R=H, OH, OAc, OCH3, OCH2CH3, OCH(CH3)2, 0X0 (其中 OAc 代表乙酰氧基，
0Μ)代表此位置形成羰基)。查阅文献，符合上列通式的已发现的天然产物有下列结构
权利要求
1.鄂西香茶菜在制备治疗冠状病毒感染的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的冠状病毒为SARS冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒或者禽传染性支气管炎病毒。
全文摘要
本发明提供了一种以SARS、TGEV、AIBV等冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性筛选和晶体结构为基础，从鄂西香茶菜中筛选二萜类天然产物抑制剂的方法。本发明具有下述结构通式的化合物能够有效抑制冠状病毒主蛋白酶的活性。
文档编号A61P31/14GK102247341SQ201110135330
公开日2011年11月23日 申请日期2007年12月14日 优先权日2007年12月14日
发明者娄智勇, 孙玉娜, 张妍, 张畅, 薛飞, 郭宇, 饶子和, 马明 申请人:中国科学院生物物理研究所, 南开大学, 清华大学