专利名称：抑制GCF基因表达的SiRNA及其载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药基因工程领域。具体地涉及一种抑制GCF基因表达的SiRNA及其载体和应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi )是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。RNAi是一种从低等生物到哺乳动物都有的保守的防御机制。双链RNA在细胞内被Dicer酶切成约19-22nt的小片段干扰RNA (SiRNA)进而形成SiRNA-蛋白复合物(siRNP)，SiRNA 通过识别、降解具有同源序列的mRNA最终导致特异性的基因表达沉默(gene silencing)(Liu JY 等,RNA1-gene silencing mediatedby dsRNAs, Section Genet Foreign MedSci，2004，27 (I) :4-10)。因此，RNA干扰技术近年来日益受到人们的重视。SiRNA技术正在逐步应用在研究基因功能、细胞信号转导途径分析、冗余基因的确定、药物开发中靶标验证、基因治疗、病毒感染、癌症和显性遗传病治疗等。治疗肿瘤的方法主要有三种，分别为外科手术、化疗与放射治疗，其中放射治疗约占这些肿瘤治疗的27%左右。细胞的辐射效应与细胞的辐射敏感性和临床上肿瘤放射治疗有关。在临床上，辐射敏感性已成为提高肿瘤放疗效果的一个重要因素，这种辐射敏感性与福射敏感基因有关。与福射有关的早期反应基因IER5 (Immediate Early Response5,简称为IER5，中文名称为早期反应基因5)的过表达能够抑制Hela细胞的分裂，而GCF (Homosapiens chromosome2open reading frame3 (C2orf3)基因为 IER5 的一个转录调控因子，GCF的结合位点在IER5启动子-388 _382bp和-274 _270bp，它在Genebank中编号为NM_003203. 4，全长 4455bp。目前有关GCF的研究主要有GCF基因序列(Takimoto M, MaoP, Molecularanalysis of the GCF gene identifies revisions to the cDNA and aminoacid sequences (I), Biochim Biophys Acta, 1999，0ct6, 1447 (I) : 125-31)、基因和蛋白表达的情况，细胞分馏研究显示GCF主要存在于细胞核中，GCF是一个稳定的蛋白拥有相对比较长的半衰期，并且GCF是一个磷蛋白，它的磷酸化形式存在于细胞核内，磷酸化发生在丝氨酸和苏氨酸残基上。GCF能够被R田酸、佛波脂、周期AMP刺激，但是不能被钒刺激(Laura B, Hitoshi Y, Ira P and Alfred, Biochemical Characterization of HumanGCF Transcription Factor in Tumor Cells, The Joural Biological Chemistry, 1992，Vol. 267，No. 3，Issue of January25, pp. 1689-1694)，此外它在某些病变组织上也有一些表达，比如GCF mRNA的高水平表达出现在KATO III和AGS(胃癌)、FEM-X (黑素瘤)、和U266B1 (脊髓瘤)细胞中，克隆人类的一种成纤维细胞(W138)中没有发现GCFmRNA的表达，在鼠的一个细胞系(NIH3T3)和猴的一个细胞系(CV-1)中用交叉杂交也没有发现。原位杂交之后通过一个1. 9kb GCF cDNA的基因探针分析人类染色体，结果显示GCF基因在 2pll. 1-11. 2(Alfred C. Johnson, Ryoichiro Kageyamat, Nicholas C. Popescuy, andIra Pastanj Expression and Chromosomal Localization of the Gene for theHuman Transcriptional Repressor GCFj Department of Molecular and CellularBiology, University of Arizona, Tucson, AZ85721，USA，Volume269,number2，288-291)。
因此弄清楚GCF对IER5基因的调控机理，以及GCF在基因沉默情况下对宫颈癌细胞Hela的增殖和辐射的敏感性的影响，有利于揭示辐射对一些肿瘤，特别是宫颈癌作用的机理研究，也有利于人们开展对该肿瘤辐射增敏药物的开发以及我们更好地了解GCF和由它调控的IER5基因在医疗上应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种抑制GCF基因表达的SiRNA。本发明的第二个目的在于提供一种包含编码上述SiRNA的DNA的重组表达载体，该重组表达载体能稳定表达上述SiRNA序列。本发明的第三个目的在于提供一种包含上述SiRNA或上述重组表达载体的宿主细胞。本发明的第四个目的在于提供上述SiRNA、上述重组表达载体以及上述宿主细胞在制备治疗宫颈癌药物上的应用。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案。抑制GCF基因表达的SiRNA的设计首先在NCBI网站的GeneBank中获得人的GCF全mRNA序列，编号为ΝΜ_003203· 4,全长4455bp,其编码区序列为(CDS, coding sequence)位于13广2476。择其编码区(⑶S)作为SiRNA设计的靶序列，在相应的SiRNA设计网站(http://www. ambion. com/techlib/misc/SiRNA_finder. html)上进行初步设计与筛选，找出具有SiRNA功能的可能靶序列及其对应的SiRNA的编码DNA序列，设计的SiRNA在GCF基因的mRNA的位置太靠前或太靠后都会影响其抑制效果，然后将所选定的正义链和反义链与GeneBank (http //www. Ncb1. nlm. nih. gov/blast/)中已知同物种的基因序列进行比较，排除那些和其它编码序列或EST同源的序列，排除反义链的5'端连续8个碱基与其它基因配对的潜在编码SiRNA的DNA序列。排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在编码SiRNA的DNA序列，最终确定4对SiRNA，编码SiRNA的DNA的核苷酸序列(共2Int)如下GCF-S1RNA796 :其靶序列即作用部位为796_816bp。正义链5，-GCAAGATACTTGGGAACAACA-3’(SEQ ID No.1)反义链5’-TGTTGTTCCCAAGTATCTTGC-3’ (SEQ ID No. 2)GCF-SiRNA1405 :其靶序列即作用部位为 1405_1425bp。正义链5，-GGAAGGAACATCTAGTGATGA-3’(SEQ ID No. 3)反义链5’-TCATCACTAGATGTTCCTTCC-3’ (SEQ ID No. 4)GCF-SiRNA1696 :其靶序列即作用部位为 1696_1716bp。正义链5’-GCCATGGTTCAAATCTGTAGA-3’ (SEQ ID No. 5)反义链5，-TCTACAGATTTGAACCATGGC-3，(SEQID No. 6)GCF-SiRNA1738 :其靶序列即作用部位为 1738_1758bp。正义链5’-GGAAGATTCAAAGAAGGAAAG-3’ (SEQ ID No. 7)
反义链5，-CTTTCCTTCTTTGAATCTTCC-3’(SEQ ID No. 8)根据shRNA设计原则，将上述4对SiRNA设计成发夹shRNA插入片段以使其插入载体中从而稳定表达SiRNA，编码发夹shRNA的shDNA的核苷酸序列如下GCF-shRNA796 正义链5’ -CACCGCAAGATACTTGGGAACAACATTCAAGAGATGTTGTTCCCAAGTATCTTGCTTTTTTG-3’ ；(SEQ ID No. 9)反义链5’ -GATCCAAAAAAGCAAGATACTTGGGAACAACATCTCTTGAATGTTGTTCCCAAGTATCTTGC-3’ 。(SEQ ID No. 10) GCF-shRNA1405 正义链5’-CACCGGAAGGAACATCTAGTGATGATTCAAGAGATCATCACTAGATGTTCCTTCCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 11)反义链5' -GATCCAAAAAAGGAAGGAACATCTAGTGATGATCTCTTGAATCATCACTAGATGTTCCTTCC-3’。(SEQ ID No. 12)GCF-shRNAI696 正义链5’-CACCGCCATGGTTCAAATCTGTAGATTCAAGAGATCTACAGATTTGAACCATGGCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 13)反义链5’-GATCCAAAAAAGCCATGGTTCAAATCTGTAGATCTCTTGAATCTACAGATTTGAACCATGGC-3’ 。(SEQ ID No. 14)GCF-shRNA1738 正义链5’-CACCGGAAGATTCAAAGAAGGAAAGTTCAAGAGACTTTCCTTCTTTGAATCTTCCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 15)反义链5’-GATCCAAAAAAGGAAGATTCAAAGAAGGAAAGTCTCTTGAACTTTCCTTCTTTGAATCTTCC-3’ 。(SEQ ID No. 16)经实验证明，在这四对GCF-SiRNA中，抑制GCF基因表达效果最好的为GCF-SiRNA796，其次为 GCF_SiRNA1405 和 GCF_shRNA1696。本发明提供的含有编码SiRNA的DNA序列的重组表达载体的构建方法如下将编码SiRNA的上述DNA序列设计成上述发夹shRNA插入片段以使其能够插入到载体中，首先将其与载体连接，连接产物需要转化到大肠杆菌DH5a感受态(购于博大泰克公司)。经由Amp抗性筛选含上述表达载体的克隆，然后提取质粒并进行测序，以保证选用的质粒其内部插入的SiRNA片段无误。从而构建得到重组表载体，其中所述重组表达载体优选基于pGPU6/GFP/Neo载体构建而成，其重组表达载体命名为pGPU6/GFP/Neo_shRNA。
其中，载体pGPU6/GFP/Neo带有人U6启动子，可购于Ambion公司，上述编码发夹shRNA的shDNA包含有21个碱基对的SiRNA作用片段；一个序列为TTCAAGAGA的loop环结构以避免形成终止信号；shRNA的转录终止序列采用T6结构；正义链的5’端添加有CACC，与Bbs I酶切后形成的粘端互补；反义链5’端添加有GATC，与Bam H I酶切后形成的粘端互补。本发明提供的包含上述SiRNA或上述重组表达载体的宿主细胞优选为HeLa细胞，其按照如下方法构建能稳定抑制GCF基因表达的HeLa细胞采用阳离子脂质体LipofectamineM2000将上述pGPU6/GFP/Neo_shRNA载体导入Hela细胞株中，然后通过G418抗生素进行筛选(确定杀死所有HeLa细胞的G418抗生素的最低浓度为700 μ g/ml,选用700 μ g/ml进行转染后筛选，选用350 μ g/ml为维持选择的药物浓度)，挑选单克隆细胞培养并检测抑制GCF基因的蛋白水平，从而得到稳定抑制GCF基因表达的细胞系，更优选地，该宿主细胞为GCF-shRNA-HeLa单克隆细胞系，已于2012年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5821，保藏单位地 址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。上述抑制GCF基因表达的SiRNA、上述重组表达载体、上述宿主细胞用于制备治疗宫颈癌的药物。本发明具有如下优点和有益效果(I)本发明提供了三对能有效地抑制GCF基因表达的SiRNA序列；(2)构建了能稳定表达上述SiRNA序列的载体；(3)本发明转染成功获得具有抑制GCF基因表达的SiRNA功能的细胞系，优选为GCF-shRNA-HeLa CGMCC No. 5821，该细胞系属于单克隆，RNA干扰效率高，能有效抑制GCF基因的表达，同时使具有SiRNA同源序列的基因表达沉默而不影响其它基因的功能，所以该细胞系特异性强，无毒副作用；该细胞系为人类揭示GCF基因的生物学功能及了解早期反应基因(IER5)的有关信号转导途径等研究提供了实验细胞，GCF作为IER5的负调控因子，抑制GCF基因的表达可以使IER5过量表达从而提高肿瘤细胞的辐射敏感性，所以本发明提供的SiRNA序列、包含上述SiRNA序列的编码DNA的表达载体以及上述宿主细胞可以用于宫颈癌药物的研发，同时也可用于对该基因有关的潜在药物开发与其反应连锁基因的研究，从而有利于宫颈癌的放疗与药物研发。
图1是pGPU6/GFP/Neo载体的结构示意图；图2是重组质粒pGPU6/GFP/Neo_shRNA的Bam H I和Pst I单酶切鉴定图；其中M: lamda/Ecol30I ；M左侧为Pst I酶切结果；M右侧为Bam H I酶切结果；编号 1、2 为 pGPU6/GFP/Neo-shRNA796 的酶切结果，编号 3、4 为 pGPU6/GFP/Neo_shRNA1405的酶切结果，编号5、6为pGPU6/GFP/Neo-shRNA1696的酶切结果，编号7、8为pGPU6/GFP/Neo-shRNA1696的酶切结果，编号9、10为阳性对照口6 诎/6 /他0-1^4 0!1-8111 應的酶切结果、编号11、12为阴性对照pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA的酶切结果。图3是Western Blot检测结果；(A)为阳性对照以及正常HeLa、阴性对照中GAPDH蛋白的表达情况，其中，1:A5-3，2 :A5-2，3 :A5_1，4 :阴性对照(Negative)，5 :正常HeLa(Normal) ; (B)转染1、2、3号重组质粒的HeLa及正常HeLa、阴性对照中GCF蛋白的表达情况；注图中实验组细胞名称中第一个大写字母表示重复实验的第几次，第一个数字表示转染质粒的编号，最后一个数字为该种质粒挑选出的第几株单克隆细胞系。如C1-6表示在C组转染I号质粒后挑选出的第6株单克隆细胞。图4是GCF-shRNA-HeLa (左)与阴性对照HeLa (右)细胞形态比较(X 40);图5是GCF-shRNA-HeLa单克隆细胞与阴性对照HeLa的生长曲线；图6是辐射对GCF-shRNA-HeLa细胞周期影响的实验曲线，其中A :辐射后随时间的变化处于Gtl-Gl期的细胞数目； B :辐射后随时间的变化处于G2-M期的细胞数目；C :辐射后随时间的变化处于S期的细胞数目；D :辐射后随时间的变化凋亡(APOP)的细胞数目。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐名本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件如SambiOOk等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。实施例1抑制GCF基因表达的SiRNA序列的筛选利用网络资源以及软件对GCF基因进行生物信息学分析，检索NCBI GeneBank得到GCF基因RNA全序列，编号为NM_003203. 4，全长4455bp，其编码区序列为(CDS，codingsequence)位于131 2476。选择编码区作为SiRNA设计的祀序列。在相应的SiRNA设计网站(www. ambion. com)上进行初步设计与筛选,然后对比下列设计原则筛选出来SiRNA序列。SiRNA序列设计的原则(I)在GCF基因的启动子后50-100个碱基自5’ -端开始。(2)寻找GCF基因序列中的23个碱基，最好是5’_AA (N19)TT_3，(N是任何碱基)。如果找不到四个以上AA (N19)TT,则用AA (N21)补足。如果找不到四个以上AA (N21),则用NA (N21)补足。(3)所选定序列中，G和C的数目的总和为总数(23)的35_55%。(4)满足以上(I广(3)项要求的片段数目如果不足四个，将G和C的数目的总和放宽至为总数(23)的30-70%。(5)避免二级结构重复,如ACGACGACG，AAAA等。(6)将所选定的正义链和反义链与 GeneBank (http //www. Ncb1. nlm. nih. gov/blast/)中已知同物种的基因序列进行比较，排除那些和其它编码序列或EST同源的序列，排除反义链的5'端连续8个碱基与其它基因配对的潜在编码SiRNA的DNA序列，排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在编码SiRNA的DNA序列，最后得到4对SiRNA，编码SiRNA的DNA的核苷酸序列(共2Int)如下GCF-S1RNA796 :其靶序列即作用部位为796_816bp。正义链5，-GCAAGATACTTGGGAACAACA-3’(SEQ ID No.1)反义链5’-TGTTGTTCCCAAGTATCTTGC-3’ (SEQ ID No. 2)
GCF-SiRNA1405 :其靶序列即作用部位为 1405_1425bp。正义链5’-GGAAGGAACATCTAGTGATGA-3’ (SEQ ID No. 3)反义链5’-TCATCACTAGATGTTCCTTCC-3’ (SEQ ID No. 4)GCF-SiRNA1696 :其靶序列即作用部位为 1696_1716bp。正义链5，-GCCATGGTTCAAATCTGTAGA-3’(SEQ ID No. 5)反义链5，-TCTACAGATTTGAACCATGGC-3，(SEQID No. 6)GCF-SiRNA1738 :其靶序列即作用部位为 1738_1758bp。正义链5’-GGAAGATTCAAAGAAGGAAAG-3，(SEQ ID No. 7) 反义链5，-CTTTCCTTCTTTGAATCTTCC-3’(SEQ ID No. 8)根据shRNA设计原则，将上述4对SiRNA设计成发夹shRNA插入片段以使其插入pGPU6/GFP/Neo载体中从而稳定表达SiRNA，编码发夹shRNA的shDNA的核苷酸序列如下GCF-shRNA796 正义链5’ -CACCGCAAGATACTTGGGAACAACATTCAAGAGATGTTGTTCCCAAGTATCTTGCTTTTTTG-3’ ；(SEQ ID No. 9)反义链5’ -GATCCAAAAAAGCAAGATACTTGGGAACAACATCTCTTGAATGTTGTTCCCAAGTATCTTGC-3’ 。(SEQ ID No. 10)GCF-shRNA1405 正义链5’-CACCGGAAGGAACATCTAGTGATGATTCAAGAGATCATCACTAGATGTTCCTTCCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 11)反义链5’-GATCCAAAAAAGGAAGGAACATCTAGTGATGATCTCTTGAATCATCACTAGATGTTCCTTCC-3’ 。(SEQ ID No. 12)GCF-shRNAI696 正义链5’-CACCGCCATGGTTCAAATCTGTAGATTCAAGAGATCTACAGATTTGAACCATGGCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 13)反义链5’-GATCCAAAAAAGCCATGGTTCAAATCTGTAGATCTCTTGAATCTACAGATTTGAACCATGGC-3’ 。(SEQ ID No. 14)GCF-shRNA1738 正义链5’-CACCGGAAGATTCAAAGAAGGAAAGTTCAAGAGACTTTCCTTCTTTGAATCTTCCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 15)反义链5’-GATCCAAAAAAGGAAGATTCAAAGAAGGAAAGTCTCTTGAACTTTCCTTCTTTGAATCTTCC-3’ 。(SEQ ID No. 16)
上述发夹shRNA插入片段包含有21个碱基对的SiRNA作用片段；一个序列为TTCAAGAGA的loop环结构以避免形成终止信号；shRNA插入片段的转录终止序列采用T6结构；正义链的5’端添加有CACC，与Bbs I酶切后形成的粘端互补；反义链5’端添加有GATC,与Bam H I酶切后形成的粘端互补。此外，为了进行下列实验，本发明还设置了阳性和阴性对照阳性对照hGAPDH_shRNA正义链5’-GACCGTATGAGAACAGCCTCAAGTTCAAGAGACTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3’ 。 (SEQID No. 17)反义链5’-GATCCAAAAAAGTAGTACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3’。( SEQID No. 18)阴性对照NC-shRNA正义链5’-CACCGTTCTCCGAACGTGTAACGTCAAGAGGTTACGTTACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 19)反义链5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTTGCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3’。(SEQ ID No. 20)以上编码发夹shRNA的shDNA的核苷酸序列采用人工合成。实施例2pGPU6/GFP/Neo_shRNA 载体构建包括如下步骤1、GCF-shRNA 模板的退火(I)由 Invitrogen 公司人工合成 GCF-shRNA796、GCF-shRNA1405、GCF_shRNA1696、GCF-shRNA1738模板序列以及阳性对照hGAPDH-shRNA模板序列和阴性对照NC-shRNA模板序列，其合成的正义链或反义链序列为发夹结构。(2)将合成的 DNA oligo 用 TE (PH8. O)溶解，浓度为 100 μ M。(3)对发夹结构的正义链和反义链进行退火处理使其形成互补的双链反应体系为50yL，其中正义链(ΙΟΟμΜ) :5yL ;反义链(100 μ M) :5 μ L ;退火缓冲液(10 X shDNAAnnealing Buffer) 5 μ L ；ddH20:35 μ L。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理95°C、5min ;85°C、5min ;75°C、5min ；70°C、5min ;4°C保存，所得到退火产物即为正义链和反义链互补的双链模板溶液，将其稀释500倍，终浓度为20nM，用于连接反应。2、pGPU6/GFP/Neo (5117bp)载体的线性化pGPU6/GFP/Neo载体的结构示意图见图1。 ①采用Bbs I和Bam H I双酶切对pGPU6/GFP/Neo载体进行线性化处理。酶切体系为50 μ L，具体为pGPU6/GFP/Neo2 μ g ；Bbs I 2 μ L ；Bam H I 2 μ L ;10XBuffer G 5 μ L ;(1(1!120补M 50 μ L0②将上述反应体系混合均匀并进行离心处理，然后在37°C条件下酶切lh，酶切后进行1%的琼脂糖凝胶检测，采用博大泰克公司的纯化试剂盒回收长度约为4060bp的片段，然后将其稀释至浓度为50ng/y L。3、将步骤I的退火产物与步骤2的双酶切产物连接连接反应体系如下步骤I得到的退火产物I μ L (终浓度为20ηΜ);步骤2得到的双酶切产物I μ L(50ng/yL);双蒸水15yL ;10X连接缓冲液2yL ;T4DNA连接酶(5weissU/ μ L) I μ L。
将上述反应体系置于14_37°C，优选为16°C左右中静置8h，得到的连接产物可保存于-20°C冰箱中。4、转化(I)将冰上融化的感受态细胞50 μ L和上述连接产物3-5 μ L混合，轻轻地混匀后冰浴30min ;再在42°C水浴中热激90s ;然后快速冰浴2_3min使细胞冷却；再向其中加入500 μ L LB培养基(不含抗生素)并混匀，置于恒温震荡器(培英牌THZ-C恒温震荡器)中以200转/分钟，370C的条件培养lh，使细菌复苏；然后在含相应抗生素的LB琼脂培养板进行铺板，待板上液体吸收后倒置该培养板，再将其置于37°C，培养16h。(2)挑菌培养16h后发现培养板的LB琼脂上出现多个直径约Imm左右的白色菌群斑点，挑出其中周围噬菌体少的菌斑接种到含50 μ g/ml氨苄抗生素的LB培养液中，37200转/分恒温震荡器中摇菌过夜。第二天观察LB培养液是否变混浊，变混浊的说明摇菌成功。然后使用碱裂解法小量抽提质粒，所得质粒用Bam H I和Pst I分别酶切鉴定，质粒pGPU6/GFP/Neo的Bam H I和Pst I酶切位点之间是Pst I的酶切位点，而插入目的基因片段之后，Pst I酶切位点被取代，所以阳性克隆应该可以被Bam H I切开，而不能被Pst I切开，酶切结果见图2。从图2中可以看出阳性重组质粒Pst I酶切后显示两条带，第I条为超螺旋的SC构型，第2条为质粒的松弛开环的OC构型；而阳性重组质粒被Bam H I单酶切而线性化,条带在5100bp左右。将酶切鉴定正确的重组质粒的菌液送上海吉玛制药有限公司采用T7通用引物进行测序，其中重组表达载体pGPU6/GFP/Neo_shRNA796的测序结果见序列表中SEQ ID No. 21。重组表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA1405的测序结果见序列表中的SEQIDNo. 22。重组表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA1696的测序结果见序列表中的SEQIDNo. 23。重组表达载体pGPU6/GFP/Neo_shRNA1738的测序结果见序列表中的SEQIDNo. 24。采用高纯度质粒中量抽提试剂盒(Axygen)从测序正确的菌液中抽提pGPU6/GFP/Neo-shRNA796、pGPU6/GFP/Neo_shRNA1405、pGPU6/GFP/Neo_shRNA1696、pGPU6/GFP/Neo-shRNA1738、pGPU6/GFP/Neo-hGAPDH_shRNA、pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA 重组质粒，并按试剂盒说明进行操作。
实施例3pGPU6/GFP/Neo_shRNA转染HeLa细胞系的建立与筛选将实施例2 构建的 pGPU6/GFP/Neo-shRNA796 (命名为 I 号质粒)、pGPU6/GFP/Neo-shRNA1405 (命名为 2 号质粒)、pGPU6/GFP/Neo_shRNA1696 (命名为 3 号质粒)、pGPU6/GFP/Neo-shRNA1738 (命名为 4 号质粒)以及阳性对照 pGPU6/GFP/Neo-hGAPDH_shRNA (命名为5号质粒)和阴性对照pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA (命名为6号质粒)转染到人正常Hela细胞建立单克隆细胞系，具体步骤如下1、确定HeLa的G418致死剂量(人正常Hela细胞购自军事医学科学院二所第四研究室)pGPU6/GFP/Neo载体购于上海吉玛公司，含有抗G418的基因，并表达绿色荧光蛋白，因此用这两个指标来筛选转染成功的单克隆细胞。选取生长状况良好的HeLa细胞，胰酶消化制成细胞悬液，以每孔10000个细胞接种于24孔板，24h后换液，用含有不同浓度G418的DMEM细胞培养液，浓度梯度为IOOyg/ ml>200 μ g/ml、300 μ g/ml>400 μg/ml、500 μ g/ml>600 μ g/ml>700 μg/ml、800 μ g/ml、900 μ g/mlUOOO μ g/ml,同时设立空白对照，两个复孔，以后每3天换液I次，加G41816天后700 μ g/ml浓度以上细胞全部死亡，600 μ g/ml浓度还剩下20%融合在底面的活细胞，除去培养基，用PBS清洗细胞，用溶于50%甲醇的O. 4%台盼兰染色20min。确定杀死所有HeLa细胞的G418抗生素的最低浓度为700 μ g/ml,选用700 μ g/ml进行转染后筛选,选用350 μ g/ml为维持选择的药物浓度。2、选择脂质体和重组表达载体合适的比例选择阴性对照pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA质粒做预实验，监控质粒和脂质体的细胞毒性和转染效率，脂质体LipOfectamineTM2000产品说明书，24孔板推荐DNA用量O. 8μ g, Lipofectamine 2000推荐用量2μ g。在此参考剂量的上下分别选择DNAO μ g、O. 6μ g、0. 8μ g、l. 0μ g,Lipofectamine 2000 选择 0 μ 1、2μ 1、2· 5μ 1，12 种组合方式分别转染人正常HeLa细胞，同时每种组合设立两个复孔，流式细胞仪分析转染效率，综合考虑细胞毒性和转染效率，选择最佳比例DNA0. 8μ g，LipofectamineTM20002y 1，6孔板的底面积是24孔板的5倍，则选择DNA4 μ g, Lipofectamine 200010 μ 1，每孔接种20000细胞。3、细胞转染将pGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒(1-4号质粒)、阴性对照质粒(6号质粒)以及阳性对照质粒(5号质粒)分别转染Hela细胞，其中阳性对照用于检测转染操作是否成功有效。分别做两组平行试验，每组实验有三个复孔，分别命名为第一组A、B、C ;第二组D、E、F。每组18个24孔板，另有正常Hela细胞相同实验条件下培养。按照Lipofectamine 2000说明书的操作方法转染真核细胞，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen,具体方法如下转染前I天将细胞以2X IO5个细胞接种于35mm培养皿中，于转染当日细胞达
70% 90%融合。将质粒DNA (4 μ g)滴入250 μ I无血清无抗生素DMEM培养液中，混匀。将12μ1 Lipofectamine 2000转圈、垂直、贴近液面滴入250 μ I无血清无抗生素DMEM培养液中，滴完轻轻混匀，室温放置5min。混合上述两份培养基，室温孵育20min。
去除培养皿中的培养基，PBS3 4ml清洗细胞，一次，加1. 5ml无血清无抗生素培养基。加入含有质粒和转染试剂混合物O. 5ml, 370C 5%C02条件下培养6h后，弃去无血清无抗生素DMEM培养液，加入含10%FBS无抗生素的DMEM培养基IOml。培养72h，拍照观察绿色荧光蛋白表达情况。4、转染效率的计算转染后72小时荧光显微镜下800倍观察，发出较强的绿色荧光的细胞算作转染成功的细胞，较弱或没有的则算作没有转染进去。转染效率=转染成功的细胞数/细胞总数X 100%，数出每一组的转染效率，求出平均数。
5、G418筛选挑出单克隆细胞株上述转染成功的细胞每天换10%胎牛血清完全培养基，三天后换含有浓度为700 μ g/ml G418的培养基，12天后胰酶消化细胞，计数，数100个细胞铺到IOOmm培养皿中，剩下的传代分装到6孔板内，24h后(细胞大约1:6分裂为佳)加入含700 μ g/ml G418的10%胎牛血清完全培养基，进行筛选，每三天换液一次，IOOmm培养皿中有单克隆形成，在荧光显微镜下用蓝色激发光100倍放大倍数观察，用胰酶局部消化挑取单克隆，挑选绿色荧光亮度强的单克隆移至新的24孔板中用加有100个单位双抗的完全培养基继续培养，并维持G418350 μ g/ml的选择压力。以后观察24孔板细胞生长状态长至85%以上即可消化传代至35mm皿并维持G418350 μ g/ml选择压力，扩大培养单克隆细胞珠，单克隆细胞株在细胞密度小时生长缓慢，可相应提高培养基内血清的浓度，用15%胎牛血清培养基尚可。6、单克隆细胞系的检测将筛选出的细胞扩大培养到IOOmm培养皿，剩下的继续培养留种(注意标记清楚包括细胞种类，时间，细胞状态等)，细胞长满后，再次观察荧光，挑荧光亮度强的收细胞提取总蛋白质，Western Blot检测转染后细胞蛋白质的表达量，挑选出GCF表达最低的单克隆细胞株(收细胞提蛋白质及Western Blotting检测方法如下)。将检测正确的单克隆细胞扩大培养至IOOmm培养皿，按1:3传代继续加药培养长满后收细胞冻存，以备后续实验。下面对Western Blot实验进行说明(I)选择正常HeLa细胞和荧光强度高且稳定并最终能够稳定传代的转染细胞即F6-4(阴性对照，Negative)，A5-1、A5-2、A5-3、C1-6、B2-3、E3-10、E3-14、E3-15 做 WesternBlot实验，其中4号即pGPU6/GFP/Neo GCF_shRNA1738质粒转染Hela细胞不能稳定传代，全部死亡。(2)细胞总蛋白的提取将原DMEM收集于离心管中，加PBS清洗一次，O. 25%胰酶O. 5ml消化2分钟，DMEM停止消化，吹打使细胞悬浮，收集于离心管中，IOOOrpm离心4min ；小心弃去上清，加PBS,重新悬浮细胞,转至1. 5mlEP管中，IOOOrpm离心4min ;小心弃去上层PBS,每IOmg细胞加入50 70 μ I蛋白裂解液(lysis buffer,购自美国Thermo)吹打悬浮，室温混匀5min，HOOOrpm离心10分钟，收集上清于另一1. 5mlEP管中(小心吸取，不要吸取絮状沉淀)，沸水煮lOmin，分装，_80°C保存备用。蛋白质浓度测定考马斯亮蓝染色测蛋白浓度，取5μ I蛋白样品，195 μ I 7jC,2ml考马斯亮蓝，将蛋白样品稀释40倍后测蛋白浓度，200 μ I水，2ml考马斯亮蓝为空白对照，测595nm吸光值。
计算蛋白质浓度蛋白浓度=吸光值X0. 27444Xμ I(3) Western blot检测基本步骤为制胶、蛋白上样(每孔上样量为40 μ g)、转膜、封闭、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜、显色、曝光、洗片。具体如下聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):配制一定量的6%的分离胶，混匀后灌胶，并小心在胶面上加入适量异丙醇，待分离胶自然凝聚后倒出；配制一定量的5%的浓缩胶，混匀后倒胶，迅速插入梳子，待凝固后小心拔出梳子，用注射器抽取电泳缓冲液冲洗加样孔，清除未凝的丙烯酰胺。将蛋白质样品用微量注加样器(白枪头)加入样品孔中。蛋白质样品加至样品孔的底部，避免气泡进入空内，气泡易使样品混入到相邻的样品孔中。
将电极插头与适当电极相连。恒流15mA，待染料的前端迁移至分离胶的底部大约两个小时，停止电泳，一般情况下使目的条带迁移至浓缩胶三分之二处压蛋白片子效果较 好。SDS-PAGE结束后，从电泳槽中取出凝胶玻璃板。轻轻撬开上层薄玻璃板，凝胶贴于另一块板上。取下凝胶，在左上角切下一小块作为标记，后放入转膜缓冲液中平衡IOmin后开始转膜。将塑料支架平放，注意黑片(负极)在下，白片(正极在上)依次放置海绵垫、滤纸、凝胶、转印NC纤维膜、滤纸、海绵垫，用玻璃棒赶走各层气泡，夹好支架，放于电转盒内，在4°C冰箱中过夜进行电转，(GCF)恒压46v，16. 5h。电转结束后，膜用丽春红预染，观察蛋白情况，置于超纯水中漂洗，丽春红洗去后，用超纯水再洗5min。将漂洗过的NC膜放于5%BSA (TBST配制)中室温振摇封闭lh。弃去封闭液。用一抗稀释液将一抗稀释到适当比例，然后将洗好的膜放于稀释好的一抗中，(GCF 一抗稀释浓度为I =4000，BAPDHl 10000 β-actinl :4000)室温振摇孵育2h。弃去一抗稀释液膜用TBST漂洗3次，每次5min。加入5%牛奶(TBST配制)稀释辣根酶标记的二抗，稀释浓度为1:2000,室温振摇孵育lh。弃去二抗，TBST漂洗 3 次，每次 5min。取等体积 Western Blotting LuminolReagent试剂A液、B液混合(按每平方厘米NC膜O. 125ml混合液计算)稀释20倍。将NC膜轻轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上，放在保鲜膜上，然后将A、B混合液均匀加到膜上，反应lmin，用保鲜膜覆盖NC膜，表面一定要平整，再用透明胶带将保鲜膜覆盖的NC膜固定在显影盒内，有蛋白质的一面朝上。在暗室内进行放射自显影，自显影时间根据情况调整，定影出片后观察结果。各个质粒转染后GCF蛋白表达下调情况见图3 (A)、表I以及图3 (B)和表2。表I阳性对照以及正常HeLa (Normal )、阴性对照(Negative)中GAPDH蛋白的表达情况
权利要求
1.一种抑制GCF基因表达的SiRNA，其特征在于，编码所述SiRNA的DNA选自(a)、(b)、(c)中的任意一组 Ca)正义链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，反义链的碱基序列如SEQ ID No. 2所示；(b)正义链的碱基序列如SEQID No. 3所示,反义链的碱基序列如SEQ ID No. 4所示；(c)正义链的碱基序列如SEQID No. 5所示,反义链的碱基序列如SEQ ID No. 6所示。
2.一种包含权利要求1所述编码SiRNA的DNA的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是基于pGPU6/GFP/Neo载体构建的载体。
4.一种包含权利要求1所述SiRNA或权利要求2所述重组表达载体的宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为GCF-shRNA-HeLa，保藏编号为 CGMCC No. 5821。
6.权利要求1所述SiRNA在制备治疗宫颈癌药物上的应用。
7.权利要求2或3所述重组表达载体在制备治疗宫颈癌药物上的应用。
8.权利要求4或5所述宿主细胞在制备治疗宫颈癌药物上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制GCF基因表达的SiRNA，属于医药基因工程领域。编码所述SiRNA的DNA选自(a)、(b)、(c)中的任意一组(a)正义链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，反义链的碱基序列如SEQ ID No.2所示；(b)正义链的碱基序列如SEQ ID No.3所示，反义链的碱基序列如SEQ ID No.4所示；(c)正义链的碱基序列如SEQ ID No.5所示，反义链的碱基序列如SEQ ID No.6所示。本发明还公开了包含所述编码SiRNA的DNA的重组表达载体，以及GCF-shRNA-HeLaCGMCC No.5821，该细胞系的RNA干扰效率高，特异性强，无毒副作用，能有效抑制GCF基因的表达。本发明的抑制GCF基因表达的SiRNA、重组表达载体、GCF-shRNA-HeLa单克隆细胞还可用于制备治疗宫颈癌的药物。
文档编号A61P35/00GK102994503SQ201210523760
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者丁库克, 崔巍, 苟巧, 周平坤, 苏旭, 杨川杰, 王春英, 尹玲玲, 崔庆佳, 刘建香, 武云云, 刘晓丹, 张士猛, 王春燕, 董凌月, 齐雪松, 崔宏星, 刘青杰, 张庆召, 尚兵, 毛玲, 刘淑娟 申请人:中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所, 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 河北医科大学第二医院