专利名称：团头鲂β防御素基因及其编码的蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新天然抗菌肽，具体是指一种团头鲂β防御素基因及其编码的蛋白和应用。
背景技术：
细菌对传统抗生素的耐药性已成为全球关注的重大公共卫生问题。WHO将抗生素耐受描述为“影响所有国家的全球公共健康紧急事件”，而且这一问题导致全球健康问题的比例在逐渐增加，因此，发展克服耐药性问题的新型抗生素显得越来越重要。近年来出现的抗菌肽就是一类发展潜力巨大的新型抗菌类药物，它不仅对细菌和真菌有广谱杀灭作用，而且还具有很好的抗病毒和抗肿瘤作用，另外，与传统抗生素相比，其作用机制独特，不易引起微生物的耐药性，绝大多数不损害或破坏高等动物的正常细胞，因此它极有可能成为在临床上替代抗生素来治疗细菌感染的新型药物。相比陆生动物和高等哺乳动物，鱼类的抗菌肽种类更丰富，也更具有独特性，是抗菌肽生物资源中还没有得到有效开发的巨大宝库。已有报道证实，鱼类某些抗菌肽比高等脊椎动物具有更强的杀菌活性，因此，对鱼类抗菌肽的开发利用研究具有重要的科学意义和实际应用价值。防御素是一组小的阳离子抗菌肽，根据半胱氨酸残基位置及二硫键连接方式的不同，可ct，β，Θ三种防御素，其中β防御素(β-defensin)因广泛表达于机体各组织和粘膜上皮，是宿主抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线，被认为是最重要的防御素。但是天然防御素来源有限，化学合成也存在成本高、批量生产困难；防御素抗菌活性与肽分子的空间结构密切相关，体外合成的防御素与天然防御素虽然一级结构一致，但空间结构却不尽相同，因而造成活性较差。因此，采用基因工程方法制备防御素将具有很大优势。巴斯德毕赤酵母(Pichia pasoris)由于兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工、修饰的特点，且发酵条件简单，表达水平高，适合高密度培养，为工业化和纯化提供极大的方便。
发明内容
本发明的第一个目的是从团头鲂中获得β防御素基因。本发明的第二个目的是将所述团头鲂β防御素基因在酵母表达系统中高效表达获得重组表达蛋白。本发明的第三个目的是提供重组蛋白的应用。(I)本发明所述团头鲂β防御素基因的获得:利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法，以团头鲂肝脏总RNA为模板，经RT-PCR得到团头鲂β防御素基因，其cDNA序列的开放阅读框(ORF)如序列表SEQ ID N0:1所示。
(2)编码了所述团头鲂β防御素基因的重组蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:2所示。(3)所述团头鲂β防御素重组蛋白(或多肽)，其制备方法为:将序列表SEQ IDNO:1所述的团头鲂β防御素基因开放阅读框(ORF))与酵母表达载体构建重组表达质粒pPICZa-BDl,电转化至毕赤酵母工程菌GSl 15中，抗生素Zeocin筛选高抗性的转化子，并用甲醇诱导表达。收集上述甲醇诱导表达的上清液，对其进行分离纯化的蛋白或多肽即为团头鲂β -防御素I重组蛋白(或多肽)。(4)本发明获得的团头鲂β防御素重组蛋白具有生物活性，具有抗菌作用。采用牛津杯法对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性测定实验证明:团头鲂β防御素重组蛋白对部分革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和部分革兰氏阴性菌如大肠杆菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，而且团头鲂β防御素重组蛋白对氨苄耐药型的嗜水气单胞菌和大肠杆菌抑菌作用明显。因此，本发明的团头鲂β防御素可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括医药产品如抗菌药物、饲料添加剂、兽药、防腐剂等。本发明的有益效果:本发明涉及的团头鲂β防御素重组蛋白对金黄色葡萄球菌、链球菌及氨苄耐药型大肠杆菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，为抗感染药物及耐药型细菌提供了一类疗效好的新药品。本发明所提供的团头鲂β防御素重组蛋白的制备方法不仅易于获得纯度高的产品，而且相对于现有的化学合成方法活性较好、降低成本，缩短制备时间，有利于工业化生产。
图1为团头鮮肝脏总RNA电泳结果。图2本发明所述团头·鲂β防御素基因RT-PCR扩增产物。1:目的基因；M:DNA分子量标准(购自大连宝生物)。图3为本发明所述利用表达引物扩增团头鲂β防御素基因的产物。1:目的基因；M =DNA分子量标准(购自大连宝生物)。图4为是本发明中团头鲂β防御素重组蛋白对金黄色葡萄球菌抑菌活性测定。I:氨苄青霉素10 μ g ;2:pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3:pPICZ a A- β -防御素转化子诱导产物I ;4:pPICZ a A- β -防御素转化子诱导产物II。图5为是本发明中重组β防御素对嗜水气单胞菌抑菌活性测定。1:氨苄青霉素10μ g ;2:pPICZaA酵母转化子诱导产物；3:pPICZa A-BDl转化子诱导产物I ;4:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物II。图6为本发明中重组蛋白对无乳链球菌抑菌活性测定。1:氨苄青霉素10μ g ;2:pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物I ;4:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物II。图7为本发明中重组蛋白大肠杆囷抑囷活性测定。1:氣节青霉素10yg;2:pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物I ;4:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物II。图8为本发明的核苷酸序列。图9为本发明的氨基酸序列。图10为NCBI已公布的来源于不同物种的β防御素的氨基酸序列比对图。黑色方框为保守序列。
图11为本发明中插入表达载体的核苷酸序列。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1:团头鲂总RNA的提取及cDNA的合成I)团头鲂总RNA的提取:实验用的玻璃器皿经0.1%的DEPC水处理，150°C烘烤4h。塑料器皿经0.1% DEPC水浸泡过夜，121 °C 20min高温高压灭菌。金属用具经lmol/L的NaOH浸泡2h，经0.01%的DEPC水彻底冲洗后，37 °C烘干。各试剂用无核糖核酸酶(Ribonuc I ease，RNase)的0.01% DEPC水配置。用麻醉剂MS222将团头鲂麻醉，解剖，取出肝脏，剪取0.1g肝脏提取RNA。总RNA抽提按Trizol试剂的说明书进行。提取的RNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像仪观察鉴定，可见清晰的三条带(图1)。总RNA样品冻存于-80°C，备用。2) cDNA (反转录产物)第一条链的合成:以提取的团头鲂肝脏总RNA为模板进行反转录，反应体系为40 μ L,即:无RNase 水 8 μ L，总RNAl5 μ L,Oligo dT (18) -Adaptor 引物 2uL,70°C下10分钟，立即冰浴冷却，之后分别加入:5 X RT 缓冲液 8 μ L，dNTP 混合液 4 μ L，RNase 抑制剂 1.5 μ L，反转录酶1.5 μ L，总计40 μ L,混匀，反转录反应条件为:42°C下20分钟，70°C下15分钟，最后4°C结束反应，4°C保存，备用。实施例2:团头鲂β防御素基因的克隆及序列分析I)引物设计根据NCBI/GenBank上已登录鱼类β防御素序列信息，根据序列的保守性，用Primer 5.0软件在cDNA序列开放阅读框(ORF)的上下游区域，设计一对引物(Fl，Rl); Fl:5’ - GCCATCATCCGAAGAAAC -3’ ；R1:5’ - TTCCAAATCAAAGGCATG -3’。2) PCR扩增:以反转录产物(cDNA)为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μ L，即:Premix Taq 2.025 μ L ;上游引物 Fl (100mM)0.5 μ L ;下游引物 Rl (100mM)0.5 μ L ;反转录产物(cDNA)2y L ;灭菌无离子水22 μ L，总体积为50 μ L，混匀。PCR扩增反应条件为:94°C下预变性3min ;然后进行30个循环反应，其温度循环条件为94°C下变性30s，48°C下退火30s，72°C下延 伸Imin ;循环结束后在72°C下再延伸lOmin。3)PCR产物鉴定:扩增完成后，取PCR产物5 μ L用6X核酸上样缓冲液点样，1.0%琼脂糖凝胶，I XTAE缓冲液，120V，电泳20分钟观察结果，得到约334bp左右的PCR产物(见图2)。4)目的基因的克隆、筛选与测序
取pMD19_T载体I μ L (50ng/uL)与胶回收的目的片段3 μ L混合后，加入6 μ L溶液I，混匀后置16°C连接过夜。取10 μ L连接产物，无菌条件下加入大肠杆菌Τ0Ρ10感受态细胞中，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置30min。42°C水浴，热激90s，之后立即冰浴3min使之冷却，注意不要晃动。转移菌液至装有500 μ L预热至37°C的LB培养液中，150rpm37°C温和振荡45min，使细菌恢复抗药性。向含氨苄青霉素(AMP) (lOOPg/mL)的LB琼脂平板上加入 40 μ L X-gal (20mg/mL)、4yL IPTG (200mg/mL)，均匀涂布，37°C放置半小时后，取150 μ L菌液涂布于平板上。倒置平皿于37°C恒温培养箱培养12 16h，置于4°C使蓝色充分显现，挑白色菌落接种于含150 μ g/mL AMP的LB培养液中，剧烈振摇(230rpm) 12^16h后鉴定。将PCR扩增为阳性的克隆，取菌液送华大基因生物工程技术服务公司，进行测序分析，得到334bp (见图8)的cDNA序列，该基因有完整的开放阅读框(0RF)，其开放阅读框的序列如序列表SEQ ID NO: I所不的序列。序列号:SEQID NO:1序列长度:204bp序列类型:cDNA来源:团头鲂序列特征:有正确的开放阅读框(ORF):204bp ;决定位置:起始、终止密码子存在位置:ATG, I 位；TGA, 204 位5)上述步骤4所得序列ORF全长204bp，编码蛋白质具有如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。该蛋白质 含有67个氨基酸，分子量为7.17KD，含有4个强碱性氨基酸残基(K，R)，3个强酸性氨基酸残基(D，E)，29个疏水性氨基酸残基(A，I, L, F，W，V), 18个极性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center forBiotechnology Information, http:// www.ncb1.nlm.nih.gov)网站的 BLAST (BasicLocal Alignment Search Tool)软件对所测氨基酸序列进行分析。用DNAstar软件包里的Megalign软件,通过ClustalW方法比较的不同物种之间核苷酸序列相似度(见图10)。结果表明获得了团头鲂β防御素基因的全长ORF编码区序列。实施例3:重组真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的诱导表达I)设计团头鲂β防御素的表达引物:根据团头鲂β防御素ORF序列设计表达引物(F2，R2)，上游引物F2去除5’信号肽序列，并加入EcoR I酶切位点，下游引物加入终止密码子(TGA，注:互补密码子TCA)和Xba I酶切位点，具体如下:F2:5’ CG GAATTC ATACTTGTCTTGCTTGTCC 3’EcoR IR2: 5’ GC TCTAGATCA ATGTGATACACAGCATAAG 3’Xba I2)重组表达质粒的构建用表达引物(F2，R2)对重组质粒进行PCR扩增(见图3)，目的片段与表达载体pPICZ a A都用限制性内切酶EcoR I和Xba I进行分步双酶切，Τ4连接酶16°C连接过夜，转化大肠杆菌T0P10，构建真核重组表达质粒pPICZ a A- β -防御素，经华大基因公司测序鉴定，确定该基因已正确插入到表达载体pPICZa A中(见图11)。
3)重组表达质粒的线性化将测序正确的重组表达质粒pPICZ a A- β -防御素和pPICZ a A空载体分别用限制性内切酶BstX I酶切，体系如下:去离子水10 μ L，质粒30 μ L，IOXH 缓冲液 5 μ L，BstX 15 μ L,总计50 μ L,45°C反应5h，酶切产物用DNA清洁试剂盒进行纯化，20yL去离子水进行洗脱，-20°C保存。4)将重组质粒导入酵母感受态细胞及阳性酵母菌落的筛选将毕赤酵母(？丨(*丨& &8如1^8)65115感受态细胞8(^1^与经88七乂 I线性化后的pPICZ a A-β-防御素质粒(20 μ L)混匀，转移至预冷的0.2cm电转杯(Bio-Red)中，置于冰上5!!^11，21^，25 4 ，40(^，电 击8毫秒后，立即加入ImL预冷的lmol/L山梨醇，取200 μ L分别涂布于含伯莱霉素(Zeocin ) (100 μ g/mL, 500 μ g/mL, 1000 μ g/mL)的 YPDS 平板上，28°C培养72h，培养至单个菌落出现。同时电转化未加入任何外源基因的pPICZ a A空载体。挑取阳性菌落用YPD+ZeocinTM 250rpm振荡培养后，采用煮冻法提取重组酵母基因组DNA。将ImL菌液2500g离心5min，弃上清，沉淀中加入500 μ L TE缓冲液悬浮沉淀；2500g离心3min，弃上清；重复上步骤一次；最后沉淀溶于100 μ L TE，沸水浴10min，-80°C冷冻30min,再次沸水浴IOmin ；1500g离心5min ;取上清2 μ I为模板做PCR。以重组酵母基因组为模板进行PCR扩增，反应体系为20 μ L，即:Premix Taq 2.010 μ L,上游引物5’AOX (100 mM) 0.5 μ L,下游引物3’AOX (100 mM) 0.5 μ L,模板I μ L，灭菌无离子水8 μ L，总计20 μ L，混勻。PCR扩增反应条件为:94°C下预变性3分钟；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为94°C下变性30秒，48°C下退火30秒，72°C下延伸45分钟；循环结束后在72°C下再延伸10分钟。扩增完成后，取PCR产物5μ L用6X核酸上样缓冲液点样，1.5%琼脂糖凝胶，I XTAE缓冲液，120V,电泳20分钟观察结果。5)高拷贝阳性菌株的诱导表达选择PCR鉴定为阳性的重组酵母菌落接种于含20mL BMGY培养基的250毫升锥形瓶中，28°C，250转振荡培养12 16小时，使0D600=2 6，离心收集菌体弃去BMGY培养基。把适量菌体转移到含IOOmL BMMY培养基的1000毫升锥形瓶中，4层纱布包扎瓶口，使起始0D600为I左右。在28°C，250转条件下开始甲醇诱导表达。每隔24小时，向锥形瓶中加入终浓度为0.8%的甲醇，并补充适量的无菌水，同时诱导pPICZ a A空载体酵母菌。实施例4:团头鲂β防御素重组蛋白(或多肽)的抑菌活性鉴定
甲醇诱导72小时后，10000转离心收集表达上清，0.45 μ m滤膜过滤表达上清，在冰上搅拌加入固体硫酸铵，使饱和度为85%，硫酸铵完全溶解后，4°C静置过夜，14000转超速冷冻离心30分钟，弃上清，用5mL PBS溶液溶解沉淀，4°C保存。同样的方法浓缩pPICZ a A空载体酵母菌表达上清。采用牛津杯法对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性测定:在LB培养基上划线金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，在BHI培养基上划线无乳链球菌和嗜水气单胞菌，培养至单克隆长出。用0.65%无菌生理盐水稀释待测菌株至0D600为0.5 1，吸取50 μ L待测菌液加至已冷却到50°C以下的液态LB和BHI固体培养基和中，混匀后倒平板。在凝固的平板上放置已灭菌的牛津杯，向牛津杯中加入100 μ L浓缩20倍的诱导表达上清(如无特殊说明，所用样品均是浓缩20倍的上清，下略)，以加入相同体积AMP (0.lmg/mL)，浓缩pPICZ a A空载体酵母菌表达上清为阴性对照。培养至菌体长出，观察抑菌圈大小。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养温度为37°C，无乳链球菌、嗜水气单胞菌培养温度为28°C。抗菌效果见附图Γ7。结果表明团头鲂β防御素重组蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(见图4)和无乳链球菌(见图6)以及革兰氏阴性菌嗜水气单胞菌(见图5)、大肠杆菌(见图7)具有良好的抑菌活性，其中氨苄青霉素对嗜水气单胞菌和大肠杆菌无抑菌作用(氨苄耐药型)，而团头鲂β-防御素 I重组蛋白对氨苄耐药型的嗜水气单胞菌和大肠杆菌抑菌作用明显。
权利要求
1.团头鮮β防御素基因，该基因具有如SEQ ID NO:1所不的核昔酸序列。
2.编码权利要求1所述团头鲂β防御素基因的重组蛋白，该重组蛋白具有如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.权利要求2所述重组蛋白的制备方法，其特征在于: 将序列表SEQ ID Ν0:1所述的团头鲂β防御素基因重组至酵母表达载体中，诱导表达后获得重组蛋白。
4.权利要求2所述重组蛋白在制备抗病菌类药物、饲料添加剂、兽药、防腐剂中的应用。
5.权利要求2所述重组蛋白在制备抗金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌的药物、饲料 添加剂、兽药、防腐剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种团头鲂β防御素基因，该基因具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明还公开了编码所述团头鲂β防御素基因的重组蛋白及其制备方法，该重组蛋白具有如序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明的团头鲂β防御素重组蛋白对金黄色葡萄球菌、链球菌及氨苄耐药型大肠杆菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，为抗感染药物及耐药型细菌提供了一类疗效好的新药品。本发明所提供的团头鲂β防御素重组蛋白的制备方法不仅易于获得纯度高的产品，而且相对于现有的化学合成方法活性较好、降低成本，缩短制备时间，有利于工业化生产。
文档编号A61P31/04GK103224940SQ20131012610
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年4月12日
发明者袁改玲, 陈思思, 张涓, 黄金海, 熊文静, 刘小玲, 王卫民 申请人:华中农业大学