芪类化合物在抑制铜绿假单胞菌群体感应系统中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及芪类化合物在抑制铜绿假单胞菌群体感应系统中的应用，具体涉及白藜芦醇、白皮杉醇和氧化白藜芦醇三种芪类化合物在抑制铜绿假单胞菌群体感应系统中的应用。

背景技术：

抗生素的广泛使用导致越来越多的致病菌产生了耐药性，因此，急需开发新的抗生素和建立新的治疗模式。近来的研究发现，很多病原菌的致病性是由一种密度依赖的群体感应系统(Quorum Sensing，QS)调控，群体感应系统通过介导致病基因的表达，调控病原菌生物被膜(biofilm)的形成，对其致病性进行调控。高效的群体感应抑制剂(QSI)有望实现对病原菌致病性和生物被膜的控制。

最早发现的具有QS抑制活性的天然产物是从红藻中分离得到的溴化呋喃酮，它能够抑制铜绿假单胞菌等细菌的QS活性，大幅降低细菌生物膜对抗生素的抗性(Gram,L.,et al.Applied and environmental microbiology,1996.62(11):4284-4287)。从葡萄和花生等食物中分离出的一种天然抗毒素白藜芦醇，已被证明具有抗炎、抗氧化等多种活性，并能抑制奇异变形杆菌毒力因子的表达(Won-Bo Wang,et al.Journal of MedicalMicrobiology(2006),55,1313–1321)。

铜绿假单胞菌是最常见的与医院感染有关的革兰氏阴性菌，特别容易感染免疫功能不全的病人以及患有肺部疾病囊胞性纤维症的病人。铜绿假单胞菌通过两个AHL介导的QS系统来控制多种毒力因子的表达，包括外蛋白酶、铁载体、外毒素和一些次级代谢物。此外，铜绿假单胞菌是一个强大的生物膜形成者，而生物膜的形成被认为是一个重要的病原性特征。

芪类化合物是一类重要的植物激素，广泛存在于植物界中。目前，芪类化合物的研究集中在其抗菌、抗氧化及抗癌等生物活性方面，但其对铜绿假单胞菌是否具有QSI活性未有报道。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供芪类化合物在抑制铜绿假单胞菌群体感应系统中的应用，具体是白藜芦醇、白皮杉醇和氧化白藜芦醇三种芪类化合物在抑制铜绿假单胞菌群体感应中的应用。

本发明的目的之二是提供芪类化合物在制备铜绿假单胞菌群体感应抑制剂中的应用。

本发明的目的之三是提供芪类化合物在抑制铜绿假单胞菌群体感应抑制剂中的最低有效浓度，其中，白藜芦醇的最低有效浓度为100μM，优选为300μM以上，更优选为400μM以上；白皮杉醇的最低有效浓度为100μM，优选为400μM以上；氧化白藜芦醇的最低有效浓度为10μM，优选为400μM以上。

本发明具有以下有益效果：

三种芪类化合物均能在不影响铜绿假单胞菌PAO1生长的情况下，显著抑制其群体感应，其中白藜芦醇的活性最高；浓度为100μM时，三种化合物均能很好地抑制铜绿假单胞菌PAO1的群集运动；当浓度为400μM时，三种化合物均能显著地抑制绿脓菌素的产生，抑制率分别为59.3％、37.1％和50.2％。

附图说明

图1是实施例1中三种芪类化合物白藜芦醇、白皮杉醇及氧化白藜芦醇对铜绿假单胞菌PAO1产绿脓菌素能力的影响结果图。

图2是实施例2中三种芪类化合物白藜芦醇、白皮杉醇及氧化白藜芦醇对铜绿假单胞菌PAO1生长的影响结果图。

图3是实施例3中空白对照组(a)、DMSO对照组(b)和三种芪类化合物白藜芦醇(c)、氧化白藜芦醇(d)及白皮杉醇(e)对铜绿假单胞菌群集运动的抑制结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是为更好理解本发明的内容，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

三种芪类化合物抑制铜绿假单胞菌PAO1绿脓菌素产生的实验。

配制NB培养基灭菌备用；挑取已划线培养好的铜绿假单胞菌PAO1单菌落到NB培养基中，37℃过夜培养；取30μL过夜培养的菌液1:1000稀释到装有30mL NB培养基的锥形瓶中，同时加入不同浓度的芪类化合物白藜芦醇、白皮杉醇及氧化白藜芦醇，使其终浓度分别为100、200、300及400μM，等体积的DMSO作为对照组，混匀后放入摇床中，150rpm、37℃培养16-18h，每组重复三次；取5mL上述得到的培养液到10mL离心管中，8000×g离心5min；将上清液转移至一个新的10mL离心管中，加入3mL三氯甲烷，充分混匀，静置；弃去水相，加入1mL 0.2M HCl，充分混匀后8000×g离心5min，测粉红到深红色上层溶液的OD₅₂₀。

绿脓菌素是由铜绿假单胞菌QS系统调控产生的一种重要的毒力因子，在侵袭性感染中起着重要作用。由图1可以看出，三种化合物均能显著地抑制绿脓菌素的产生，且抑制效果随药物浓度的增加而增强，呈现出剂量依赖性。其中白藜芦醇的抑制效果最好，氧化白藜芦醇次之，白皮杉醇末之；在400μM时，三种化合物均能显著地抑制绿脓菌素的产生，抑制率分别为59.3％、37.1％和50.2％。

实施例2

三种芪类化合物生长曲线的测定。

取30μL过夜培养的菌液1:1000稀释到装有30mL NB培养基的锥形瓶中，同时加入不同浓度的芪类化合物白藜芦醇、白皮杉醇及氧化白藜芦醇，使其终浓度为400μM，等体积的DMSO作为对照组，150rpm、37℃条件下培养；起始培养开始时，取200μL各培养液于96孔板中，用酶标仪测其于620nm处的吸光度；从起始培养开始，每隔2h，取一次菌液测其在620nm处的吸光度，直至24h；对所得数据进行统计学分析。

绿脓菌素产量的减少可能是化合物对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制引起的，也可能是化合物抑制了铜绿假单胞菌的生长引起的。因此，为了排除生长抑制对群体感应抑制的影响，我们测定了在400μM下三种化合物对铜绿假单胞菌PAO1的生长曲线。结果如图2所示，与对照相比，在400μM下，三种化合物对铜绿假单胞菌PAO1的生长无明显影响。这一结果进一步证明绿脓菌素产量的减少归功于三种化合物对铜绿假单胞菌的群体感应抑制活性，而不是生长抑制活性。

实施例3

三种芪类化合物抑制铜绿假单胞菌PAO1群集运动(swarming)的实验。

配制swarming培养基(NB培养基8g、葡萄糖5g、琼脂5g、蒸馏水1000mL，调PH至7.2左右)，灭菌后冷却至50℃左右时加入不同浓度的芪类化合物白藜芦醇、白皮杉醇及氧化白藜芦醇，混匀后倒入已灭菌的平板中，其中芪类化合物白藜芦醇、白皮杉醇及氧化白藜芦醇为100、200、300及400μM，同时以等体积的DMSO作为溶剂对照组。待平板凝固后，取2μL PAO1的过夜菌液接种到琼脂板的中央；37℃倒置培养16h后观察结果。

铜绿假单胞菌的群集运动(swarming)受其群体感应系统调控。因此，测定三种化合物对铜绿假单胞菌群集运动的影响可以作为又一个指标，来进一步验证三种化合物对铜绿假单胞菌群体感应的影响。如图3所示，和未加任何物质的阴性对照组(a)和溶剂DMSO对照组(b)相比，在群集运动平板上，各个测定浓度的白藜芦醇(c)、白皮杉醇(e)及氧化白藜芦醇(d)均能显著地抑制铜绿假单胞菌的群集运动的直径及分叉数，展现出显著的群集运动抑制效果。