专利名称：药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及某些细胞激肽(cytokines)在治疗血液疾病，主要是消耗性血栓性出血疾病中的新用途。
消耗性血栓性疾病包括弥漫性血管内凝血(DIC)、去纤维蛋白综合征和消耗性凝血病。消耗性血栓性出血疾病是一种病理综合征，其表现形式很大程度上可认为是凝血酶形成的结果，尽管存在其他特征，如血液因子和血小板消耗及纤维蛋白溶解。凝血酶催化某些促凝蛋白的激活及其后的消耗，以及纤维蛋白血栓或凝块的形成。纤维蛋白血栓被看作是DIC的指征。在几乎所有的DIC的病例中都存在微血管性非粘附性血栓。
消耗性血栓性出血疾病如DIC的症状随消耗性血栓性出血疾病的病程和严重度而异。大多数病人有广泛的皮肤和粘膜出血，且为多部位出血。偶然情况下，病人实验室检查异常而无临床表现。实验室检查的主要表现包括血小板减少，凝血酶原时间(PT)延长，活化部分凝血活酶时间(APTT)延长、凝血酶时间(TT)延长及纤维蛋白原血浆水平降低，表明必需的凝血因子的消耗。纤维蛋白降解产物升高(FDPs或纤维蛋白裂解产物)，说明继发性纤维蛋白溶解剧烈。其他因子如因子Ⅴ、Ⅷ和ⅩⅢ通常是降低的。这样的发现可强烈提示诊断。特别是，因子Ⅷ的降低可能是一敏感的指征。但是，与出血密切相关的DIC的主要表现是血浆纤维蛋白原水平的降低。通常，血液中血块形成和血块溶解因子之间达到很好的平衡，这将在下面作更详细的解释。
迄今，消耗性血栓性出血疾病的治疗是基于纠正消耗性血栓性出血疾病的任何可逆病因，为控制主要症状即出血和/或血栓形成所作的测定，及防止病因再发的预防措施。治疗因病因和临床表现而异，但主要的问题是控制常互为因果的出血和血栓形成。临床医生既可供给患者血浆凝血因子以纠正低纤维蛋白原血症;也可输注新鲜冷冻血浆及血小板浓缩物以纠正血小板减少症。血栓形成通常是给肝素加以对抗，肝素是能预防凝血因子进一步消耗的强的抗凝血酶药剂。抑制伴随出现的纤维蛋白溶解的药剂极少使用，因为难以控制它们继发的血栓形成作用。
在投与肝素和血液制品的速度上必须十分小心。输血而不先给肝素实际上可能促使血栓形成而不纠正血浆缺乏状态。临床医生必须克服给有出血表现的患者用抗凝剂的这一自相矛盾了。逻辑学指出起先可因肝素的副反应而使出血加重。一旦开始肝素治疗，需要通过补充消耗的血小板和凝血因子立即处理出血素质。
显然，需要有一种治疗消耗性血栓性疾病的相对简单的方案，籍此医生可不必为恢复正常的止血功能而面对使患者对几种物质的需要得到平衡的任务。
出人意料地，我们发现，给与白细胞介素-6(IL-6)可有利地用于对抗消耗性血栓性出血疾病如DIC，它不仅增加血液血小板计数，而且同时提高血浆纤维蛋白原水平并抑制纤维蛋白溶解和凝血酶生成。它还引起血浆急性相蛋白质如α1抗胰蛋白酶和α2巨球蛋白的升高，它们是纤维蛋白溶酶的天然失活剂，因此是纤维蛋白溶解的抑制剂。
本发明一方面提供白细胞介素-6在制备治疗或预防消耗性血栓性出血疾病(较佳地为治疗或预防弥漫性血管内凝血)的药物上的应用。
本发明还包括治疗或预防患消耗性血栓性出血疾病或面临这种危险的人或动物受试者(较佳地为治疗或预防弥漫性血管内凝血)的方法，即将有效量白细胞介素-6给予所述受试者。
本发明还进一步提供白细胞介素-6在制备治疗或预防与至少一种血浆急性相蛋白质水平降低相关的功能障碍的药物上的应用。
IL-6的这一用途理想地适于处理DIC，因为它不仅符合上述需要，而且还增加血液小板计数。
“血细胞介素-6”这一措词和“IL-6”这一术语均指包括天然的、合成的和重组的多肽形式及其衍生物。例如，在M.Revel，Experientia54549-557(1989)中研究了IL-6的特征并加以讨论。较佳地是使用重组人IL-6(hrIL-6)。
DIC主要见于产科并发症、转移癌、大片创伤和细菌脓毒症。DIC的病因可按起始机制分类，分成四类1)在诸如以下情况时组织因子的释放ⅰ)产科综合征，如胎盘早期剥离、羊水栓塞、滞留性死胎，中三月流产;ⅱ)溶血;ⅲ)肿瘤如粘蛋白性腺癌和急性早幼粒细胞白血病;ⅳ)血管内溶血;ⅴ)脂肪栓塞;和ⅵ)组织损害，如烧伤、头部受伤、枪伤、外科创伤和蛇咬伤;
2)在诸如主动脉瘤、溶血尿毒综合征和急性肾小球肾炎中的内皮损伤;
3)典型地见于Kasabach-Merrit综合征的血管畸形和血流减缓;和4)感染(特别是伴有败血性休克)，其致病因素可以是细菌性的，如葡萄球菌性、链球菌性、肺炎双球菌性、脑膜炎双球菌性或革兰氏阴性杆菌性;真菌性的，如曲菌属、白色念珠菌;病毒性的，如虫媒病毒、水痘、天花或风疹病毒;寄生虫性的，特别是疟疾和黑热病;立克次体性的，如洛矶山斑疹热或真菌性的如急性组织胞浆菌病。
因此，白红胞介素-6可用于治疗伴有消耗性血栓性出血疾病的败血性休克。
DIC是威胁生命的综合征，在临床上被分为以下四种综合征a)代偿性DIC，可伴有血栓形成但不导致出血;
b)去纤维蛋白综合征，在该综合征中，限制血液凝固的机制被组织因子的释放所破坏，导致纤维蛋白原、其他凝血因子和血小板大量利用和耗竭，导致血栓形成和/或出血;
c)早期纤维蛋白溶解，这时限制纤维蛋白溶解的机制被纤维蛋白溶酶原激活剂的释放所破坏导致出血;
d)微血管病性血小板减少症，在该症中血小板微血栓广泛播散，导致血小板耗竭、组织局部缺血性坏死和红细胞性微血管病改变。
DIC的早期阶段可能不易被医生察觉，因为诸如DIC的病因，如感染，可能掩盖该病的早期病程。但是，该病可快速获得动量，并表现出超出起始刺激的重要性。
在DIC，内源性和外源性凝血系统均被激活，引起局部和全身凝血酶释入循环系统。血管系统任一成分即血管壁、血浆蛋白和血小板的改变可导致消耗性疾病。如上所述涉及特征性损害内皮的那些疾病状态，导致血管舒缓素-激肽激活即内源性凝血。另一方面，组织损伤释放组织因子，在提到的那些疾病状态中促凝血物质如组织凝血激酶起局部作用或释入循环，即外源性凝血。内源性和外源性凝血系统导致酶复合物(因子Ⅹa、因子Ⅴ、钙和磷脂)的形成，该复合物使凝血酶原(因子Ⅱ)转变为凝血酶。
DIC的消耗性过程反映了凝血酶的多重作用。凝血酶使纤维蛋白肽从纤维蛋白原水解出来，产生纤维蛋白单体，纤维蛋白单体与纤维蛋白原结合形成可溶性复合物或聚合起来形成纤维蛋白血栓。纤维蛋白血栓常引起微血管阻塞，导致局部血流减少甚至局部缺血、梗塞和坏死。凝血酶引起的纤维蛋白形成降低了血浆纤维蛋白原浓度。凝血酶还激活因子ⅩⅢ，后者使纤维蛋白抗纤溶作用，因而降低血栓溶解的可能性。此外，凝血酶以低浓度结合于血小板，引起形状变化，聚集和分泌。血小板对凝血酶原激活成凝血酶的作用部分是由于结合于血小板表面的血小板因子Ⅴ，它是因子Ⅹa的受体。凝血酶整激血小板释放血小板因子Ⅴ。实际上，凝血酶加强凝固连锁反应，通过激活血浆凝固因子Ⅴ和Ⅷ导致连锁反应的形成。按此机制，凝血酶活性是纤维蛋白原、血小板(血小板减少症)和凝固因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ和ⅩⅢ降低的原因。正常人凝血酶时间典型地为9-13±3秒。
已知凝血酶的前凝血酶(prothrombotic)活性被两个天然抑制系统中和，它们依赖于血浆蛋白和内皮表面的相互作用。抗凝血酶Ⅲ和肝素辅助因子Ⅱ通过形成复合物而缓慢地中和凝血酶。这样的中和作用在肝素的存在下被增强。
血纤维蛋白溶酶(纤溶酶)是能消化纤维蛋白和纤维蛋白原及其他凝血蛋白质包括因子Ⅴ和Ⅷ的强效蛋白酶。纤溶酶对纤维蛋白血栓的存在产生应答，使消耗的血管阻塞和局部缺血效应降为最低。在纤维酶原激活剂如组织纤溶酶原激活剂(t-PA)作用下，从纤溶酶原生成纤溶酶，这些激活剂位于中性白细胞和血管内皮，在组织损伤时释放出来。纤溶酶生成和纤维蛋白溶解被多种纤维蛋白溶解抑制剂局限于纤维蛋白凝块，这些纤维蛋白溶解抑制剂之一是纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)。纤溶酶生成也出现在激活的因子Ⅻ和/或激肽释放酶(kallicrein)存在时，例如在内源性凝血系统的接触相。当凝血酶生成被引发时，无论它是由接触即内源性凝血系统或组织损伤即外源性凝血系统触发的，这时纤维蛋白溶解就开始了。这两种蛋白酶即凝血酶和纤溶酶之间的平衡决定了临床特征是否为血栓形成、器官局部缺血和出血(凝血酶占优势)或主要是出血(凝血酶和纤溶酶作用)。α1抗胰蛋白酶和α2巨球蛋白均天然地使纤溶酶失活。α1抗胰蛋白酶和α2巨球蛋白均是急性相蛋白质，这一组的其他蛋白质包括补体成份C3c转铁蛋白、结合珠蛋白酸α1糖蛋白(haptoglobulin acid α1glycoprotein)、血浆铜蓝蛋白和C-反应蛋白。
我们在注射IL-6时观察到纤溶酶原激活物(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)释放，进一步证明纤维蛋白溶解中有IL-6参与，提示内皮细胞受IL-6刺激，t-PA水平提高约4倍，这在健康受试者(例如在运动后)所观察到的范围内，而PAI-1水平的提高为约30倍。
从上述内容可以看到，在治疗DIC时需要提高血液血小板计数，提高血浆纤维蛋白原水平，使凝血酶时间延长并增加纤维蛋白溶解和纤维蛋白原溶解抑制剂(α2巨球蛋白和α1抗胰蛋白酶，它们是血浆急性相蛋白);所有这些均由给IL-6而产生。
含IL-6的药物可经口、直肠、鼻内、经皮和胃肠外途经给药，以后者为佳。推荐的剂量是以每剂35-350μg活性物质为佳，低剂量适于输注或注射，较高剂量适于其他给药形式。推荐的静脉给药剂量为0.5-30μg/kg/d，以1-10μg/kg/d为佳。当活性物质是逐渐给予时，例如输注，给药速度以0.02-1.25μg/kg/h为佳，0.04-0.4μg/kg/h为更佳。缓释口服剂型应以大约此剂量速度较满意地释放。
合适的给药剂型包括片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、糖浆剂、乳剂、气溶胶和可分散粉末。合适的片剂可由例如将一种或几种活性物质与已知的佐剂混合而制成，这些佐剂为诸如惰性稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或乳糖，崩解剂如玉米淀粉或藻酸，粘合剂如淀粉或明胶，润滑剂如硬脂酸镁或滑石和/或达到缓释的试剂如羧酸聚亚甲基(carboxypolymethylene)、羧甲基纤维素、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯或聚乙酸乙烯酯。片剂还可由几层组成。
包衣片可以同样的方法制成，用通常用于片剂包衣的物质如火棉胶或虫胶、阿拉伯树胶、滑石、二氧化钛或蔗糖，将类似于制片剂那样制成的芯核进行包衣。为了达到缓释或防耐受不良，芯核还可由几层组成。同样地，为了达到缓释，片剂包衣可由上面关于片剂所给出的辅药包成几层。
为了避免活性多肽被胃酸降解，可提供包肠衣的片剂，该肠衣在胃中的pH下不溶解，而在肠中的pH下，如pH6.0或更高的pH下溶解。合适的包衣材料包括聚甲基丙烯酸甲酯类如Eudragit(R
hm，Darmstadt)。
根据本发明的活性物质糖浆或活性物质混合物还可以含有甜味剂如糖精、环己氨磺酸盐、甘油或蔗糖、及香味增加剂，例如香料，如香草醛或橙提取物。它们还可含有悬液佐剂或增稠剂如羧甲基纤维素钠，润湿剂如脂肪醇与环氧乙烷缩合产物，或防腐剂如对羟基苯甲酸盐(酯)。
输注或注射用溶液可按常规方法加以制备，例如，加防腐剂如对羟基苯甲酸盐(酯)或稳定剂如乙二胺四乙酸，然后转入熔瓶、注射瓶或安瓿中。或者，将注射用化合物与其它成分(或无其他成分)冷冻干燥，在使用时用适当的缓冲溶液或蒸馏水溶解。也可采用浓缩药团静脉注射。
通过将活性物质和惰性赋形剂如乳糖或山梨糖醇混合，并装入明胶胶囊，可制备含活性物质或活性物质混合物的胶囊。
合适的栓剂可这样制备例如，通过与为本目的所提供的载体物质如中性脂肪或聚乙二醇或其衍生物相混合。
化合物可与聚交酯或谷氨酸为基础的共聚物混合，以提供可嵌入的持久的释放系统，分别见US377919和K.R.Sidmanetal.(J.MembranceSci.19807277-291)。
现在参照下面的实施例和附图对本发明加以描述。
实施例1材料和方法rhIL-6所有的重组人IL-6(rhIL-6)是通过在哺乳动物细胞中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达对人IL-6的互补DNA而制备的。整个研究中使用同一批产品。生理化学特性研究表明，rhIL-6的氨基酸组成和从编码基因推断的理论组成一致。分子的糖基化发生在N-和O-糖基化部位。纯度超过99%。内毒素含量在可测限定之下。比活性为13.7×106U/mg蛋白。
重组hIL-6以200或400μg/ml浓度，分装每支1.1ml，冷冻贮存于-20℃PBS(pH7)溶液中。在这些条件下，rhIL-6稳定期为数月。注射用稀释液以含1%狒狒血清的氯化钠临时制备。
动物25只狒狒(雄性22只，雌性3只)，重20-25kg，在运到时进行隔离检疫，撤消留检前筛选疾病迹象。单独笼养，喂饲商业灵长类食物和新鲜水果，并有随意自来水配出器。
辐照为了引起骨髓损害，使一组狒狒接受全身混合中子-伽玛射线照射。
血液学检查在全身麻醉(氯胺酮(ketamine)5mg/kg)下从后隐静脉采血样。用配有兽医试剂盒的Coulter计数仪进行全血计数(白细胞、红细胞、红细胞压积、血红蛋白)，并在用May-Grünwald-Giemsa染色的涂片上进行白细胞分类计数。
血液化学进行各种血液化学试验，例如检测α1抗胰蛋白酶和α2巨球蛋白急性相蛋白质。
特别是通过活化部分凝血活酶时间(APTT或白陶土部分凝血活酶时间(高岭土-脑磷脂时间)、凝血酶时间和纤维蛋白原定量试验检测止血作用。
高岭土-脑磷脂凝血时间(或部分凝血活酶时间(PTT)和APTT)用于评估内源性系统。这是在脑膦脂(从组织中提取的血小板因子Ⅲ替代物)和高岭土(一种粘土样物质，在标准条件下激活因子ⅩⅢ)存在下，无Ca++和缺少血小板的血浆的凝固时间。然后是测定因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅷ、Ⅴ、Ⅱ和Ⅰ。狒狒正常的活化部分凝血活酶时间是35秒左右。
在已知量凝血酶存在下，血浆在一定的不变的时间内凝固，据此对凝血酶时间加以测定。在低纤维蛋白原血症，如果血浆中有抗凝血酶存在的情况下，凝血酶时间较长。
纤维蛋白原的定量试验采用在过量凝血酶存在下稀释血浆的凝固时间表示。凝固所需时间与血浆纤维蛋白原的量直接相关。
临床检查在整个研究的观察期，每天两次进行体检、直肠测温，称重，摄食、行为、注射部位观察。研究观察期以后，在有关研究者管理下定期进行进一步的健康状态检查。
评价rhIL-6效应和耐受性的寻找初始剂量的研究在体重20-25kg的10只正常狒狒(7雄3雌)上进行。
在2只一组共5组中，4组分别接受每天两次皮下注射rhIL-620、10、3、1μg/kg/d，连续8天。对照组按同样的方式只接受赋形剂。
研究按随后两个部分进行，第一部分评价两个高剂量组，以一个受剂者为对照，第二部分评价两个低剂量组，以另一个受试者为对照。在第二部分另给一个猴子单剂rhIL-6皮下注射10μg/kg。这一单独的给药在注射4天后引起明显的血小板计数增加。首次注射rhIL-6后第1、3、6、24小时采血样作血液学检查，然后在治疗阶段每天一次，以后是每周两次直至开始治疗后的37-40天采血样检查。收集两个高剂量组及其对照者的另一些血样，用于一些引起事实上的失血的生化和止血参数的评价。
基于rhIL-6在正常猴上引起的造血效应特别是血小板生成，开始了第二个研究，以评估在辐射引起的造血损害后rhIL-6加速造血作用再生的能力。
将体重20-25kg的14只新的雄性狒狒随机分为三组。一组6只受辐射试验动物(“辐射治疗”组或IT)接受rhIL-610μg/kg/d，分两次皮下注射，连续13天。根据在正常猴上进行的初步剂量摸索试验得到的效应和耐受性特征，该剂量被认为是最适剂量。一组6只受辐射试验动物(“辐射未治疗”组或INT)按同样方案只接受赋形剂。一组2只实验动物(“伪辐射”组，NIT)按同样方案接受10μg/kg/d，作为rhIL-6生物活性对照。所有治疗(rhIL-6或赋形剂)均在辐射日(0日)1天后(1日)开始。
注射IL-6的未辐射狒狒的结果临床耐受性至少在治疗进行后40天内，每天作临床症状学观察。在研究期间未观察到体重、食物消耗、体温和行为的明显改变。未见全身或局部(注射部位)不耐受征象，各组均无死亡。
血液学检查人重组IL-6引起血液血小板计数明显增加，一般开始于各种试验剂量治疗后4-5天。血小板增多时间在开始治疗后8-13天不等，并与剂量无关。虽然每个剂量组的个体数太少，不能进行统计分析，但观察到剂量依赖性反应趋势，高到10μg/kg/d剂量，血小板计数有最大增加，在20μg/kg/d时，血小板最大升高似乎变钝(平坦)。
止血在所有接受治疗的狒狒上，凝血酶时间均增加，在某些接受治疗的动物上，治疗的第一周内从20秒提高到达35秒。最高值见于以20μg/kg/d进行治疗的两个动物。
在所有受治疗狒狒上，纤维蛋白原增加4倍以上，直至治疗末达到顶峰。这快速的增加与注射剂量不成比例。在治疗停止后逐渐正常化。
急性相蛋白质与对照组相比，所有受治疗动物血浆铜蓝蛋白均有明显提高，似无剂量依赖性关系。在治疗停止后，十分进行性地回复基准值。
在所有受治疗的狒狒上，C-反应蛋白明显增高。治疗结束后2-12天之间出现正常化。
在所有动物上，触珠蛋白明显增高，治疗停止后十分进行性地正常化，这种增高似与剂量无关。
引起骨髓抑制的结果临床耐受性典型的辐射后综合征分布于两个研究组。未见这些症状被rhIL-6加重。两个未辐射的对照组不显示任何特殊的临床症状。在注射部位未见局部不耐受。在研究期间和其后，两组均无死亡。
血液学检查重组hIL-6明显地减弱辐射引起的血小板减少，并加速血小板恢复。
中子辐射在两个组均引起深度血小板减少。到最低点的时间定义为从0日到最低点的天数，该时间两组有显著差异治疗组(rhIL-6治疗7整天)平均时间为7.7±0.8天，对照组平均时间为12.8±1.9天(p＝0.003)。而且，至少恢复到基准值(按照射前12只狒狒血小板平均计数)的平均时间，治疗组(17.3±5.2天)明显短于未治疗组(25.0±2.2天)(p＝0.003)。与未治疗组的自发恢复斜率比较，在受治疗的辐射动物的恢复相，有几天出现血小板计数明显升高，高于正常值(峰值559，000/mm3，p＝0.03)。正如预期的那样，“伪辐射”的治疗对照组显示明显的血小板增多，确证了在剂量摸索研究中观察到的数据。
相反，rhIL-6治疗既不减弱辐射引起的细胞减少的程度，也不加速其恢复。
止血接受rhIL-6的组(IT或NIT)凝血酶时间增加，超过正常值。在IT和NIT组之间有具有统计学意义的差异(平均从2天-14天)(见下面)平均凝血酶时间ITINT(秒)28.918.7在治疗停止后观察到进行性正常化。
活化部分凝血活酶时间(APTT)在rhIL-6治疗(IT)和未治疗(INT)动物之间观察到平均APTT有统计学意义的延长(平均从2天至14天)。类似的增长见于“伪辐射”组(NIT)。
平均APTTITINT(秒)50.939.7治疗停止后出现进行性正常化。
纤维蛋白原各组动物显示平均纤维蛋白原值提高。但更令人注目的提高见于接受rhIL-6的动物(无论是IT还是NIT)。在IT和INT组之间观察到有统计学意义的差异(平均从2天至14天)(见下面)平均纤维蛋白质ITINT(g/l)9.14.0治疗停止后出现进行性正常化。
急性相蛋白质补体C3crhIL-6治疗组(IT和NIT)有明显提高，并进行性地正常化。辐射看来不影响补体C3c的循环水平。
血浆铜蓝蛋白与未治疗的辐射组(NIT)相比，所有受治疗动物均有明显增高，治疗停止后进行性地恢复到基准值。
C反应蛋白各组动物均显示明显的增高。但是，在未治疗辐射动物，这种升高是短暂的，而在其他两组则持续整个rhIL-6治疗期。在治疗停止后，很快即正常化。
酸性α1糖蛋白和触珠蛋白在接受rhIL-6的动物(IT和NIT)上观察到明显的升高，接着是进行性正常化。
α1抗胰蛋白酶在接受rhIL-6的动物(IT和NIT)上观察到明显的升高，接着是进行性正常化。
α2巨球蛋白在各组动物上均观察到升高。在INT组，这种升高是短暂的，而在其他两组则持续整个rhIL-6治疗期。治疗停止后迅速出现正常化。
止血最显著的特征是凝血酶时间延长和APTT时间较小程度的增加。该结果提示纤维蛋白生成障碍，这可与在这些动物上rhIL-6引起的纤维蛋白原的明显升高相联系。但是，也显示纤维蛋白原增多(虽然较不显著)的非rhIL-6治疗的辐射动物(INT)并不显示凝血酶时间紊乱。
必须强调，治疗停止后出现凝血参数及纤维蛋白原完全正常化。
血液化学在所有rhIL-6治疗动物，血浆铜蓝蛋白、C反应蛋白、酸性α1糖蛋白、触珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白、补体C3c和纤维蛋白原都显著增加。而最显著的效应见于纤维蛋白原和C反应蛋白。在治疗停止时，所有紊乱均是可逆的。
实施例2材料和方法白细胞介素-6重组糖基化白细胞介素-6是通过在中国仓鼠卵细胞中表达对人白细胞介素-6的互补DNA而制成，由Ares Serono(Geneva，Switzerland)提供。其氨基酸序列、糖类组合物和糖类附着部位和天然人IL-6相同。如在鼠T1165浆细胞瘤细胞上用National Institute for Biological Standards and Control(Potters Bar，UK)的IL-6标准品所测得的，该制品的比活性为12.7×106U/mg。整个研究中用同一批号。用鲎(lumulus)溶解产物试验测得内毒素含量低于检测限度(＜0.1内毒素单位/mg)。
动物体重20-25kg的8只狒狒(Papioursinus;CapeLaboratories，Geneva，Switzerland)在运到时进行隔离检疫3个月，在撤消留检前筛选出疾病迹象。将它们单独关在由农业、环境和自然保护部认可的实验室的不锈钢笼内。动物房装有反相空气过滤栅，全光谱光照(上午8时至下午8时)，空调调至23℃，相对湿度为60%。用商品灵长类食物和新鲜水果喂饲，自由饮用自来水。在注射和每次采血时将动物麻醉(氯胺酮Ketamine7mg/kg)。
采血用干净的静脉穿剌针从后隐静脉取血，在预冷的试管中混合，试管包括不含抗凝剂的用于制血清(急性相蛋白质)，含抗凝剂的(枸椽酸盐用于大多数试验，或含蛋白酶抑制剂混合物的枸椽酸盐，用于纤维蛋白肽A或纤维蛋白溶酶-抗纤维蛋白溶酶复合物试验)。
试验所有试剂和检测试剂盒均在预试验中测试其检测狒狒的各参数的适用性。
凝血试验用得自DiagnosticaStago(Asnieres，France)的试剂进行全面的常规凝血试验凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间。功能性抗凝血酶Ⅲ浓度用显色底物技术(StachromATⅢ，Diagnostica，Stago)进行测定，抗原浓度用比浊法(Behring，Frankfurt，Germany)进行测定。凝血酶原片段1+2浓度用ELISA法(enzygnost1+2，Behring)进行定量。血浆中纤维蛋白肽A浓度通过用皂粘土吸附除去纤维蛋白原后用竞争性酶联免疫吸附试验(AsserachromFPA，Diagnostica，Stago)进行测定。凝血酶-抗凝血酶复合物浓度用ELISA法测定(enzygnostTATmicro，Behring)。D-二聚物浓度用ELISA法测定(AsserachromD-Di，Stago)。
因子X、因子Ⅱ和PC，见试验说明。因子Xa活性以1/t计算，表示为开始值的百分数。
纤溶因子纤溶因子的抗原浓度用免疫试验加以测定t-PA用Tintelizet-PA试剂盒(Biopool，Umea，Sweden);PAI-1用PAI-1ELISA试剂盒(Monozyme，Virum，Denmark)，凝血酶-抗凝血酶复合物用PAPELISA试剂盒(Technoclone，Vienna，Austria)。
白细胞介素-6浓度用ELISA法测定(Immunotech，Marseille，France)。
急性相反应蛋白质用BNA比浊计，对C-反应蛋白，触珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白(血清类粘蛋白)、前清蛋白和纤维结合素(Fibronectin)的抗原浓度进行测定，特异抗血清由Behring提供。
研究设计用5只狒狒，接受剂量为0、5、30、100和500μg/kg体重的rhIL-6单剂皮下注射，进行初始剂量摸索试验，在剂量摸索试验的基础上选择100μg/kg剂量。4只狒狒接受单剂皮下注射100μg/kgrhIL-6(在含1%狒狒血清的0.9%灭菌生理盐水中)，4只狒狒只接受赋形剂。在研究过程中，每天测量动物的体重、行为、摄食和体温变化。注射前和注射后30分钟、1小时、3小时、6小时、8小时和24小时采血(每次采血17ml)，以后是每天一次共七天，第二周是两次采血。血样贮于-80℃直至测试(在一个月内进行)。
结果单剂皮下注射rhIL-6对临床和血液学参数的影响未观察到体重、食物消耗、体温或行为、全身或局部(注射部位)不耐受症状的明显改变，也未观察到凝血异常的临床症状。每组均无动物丢失。2-3天后IL-6治疗组狒狒的血小板计数开始增加，约第7天观察到最大的增加为65%。对照组血小板计数的改变最小。赋形剂和IL-6治疗的狒狒红细胞压积和血红蛋白值均降低到注射前的85%，这在第4-7天达到，以后恢复正常。
白细胞介素-6浓度单剂皮下注射100μg/kgrhIL-6导致血浆IL-6浓度迅速升高，维持24小时(图1)。3小时时达到高达50mg/ml的峰浓度，以后IL-6浓度逐渐下降到24小时时的1.3ng/ml，相应于终端半衰期3-4小时。注射赋形剂的狒狒在整个研究中IL-6浓度维持在检测限度之下(＜0.1ng/ml)。
急性相反应为确证重组糖基化人IL-6在狒狒上是起作用的，我们测定了几种急性相蛋白质的血清浓度。在注射rhIL-6(图2A)后第二天，C-反应蛋白增至8倍，为最大值。在6小时延搁后，α1抗胰蛋白酶浓度开始升高，在第2天时达最大值，比对照组高2倍(图2B)，纤维蛋白原(图2C)、触珠蛋白(图2D)、α2巨球蛋白(未表示出来)和α1酸性糖蛋白(未表示出来)的浓度明显升高，而前清蛋白和纤维结合素浓度短暂降低(图2E和F)。
凝血系统注射rh-IL-6对凝血系统的很多参数产生明显的效应。在IL-6治疗的狒狒上观察到注射1-3天后活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间明显增加(图3)。因子X的功能活性测量显示第1-3天时降低(图4)，而在凝血酶原的功能活性上未观察到变化。1-3天后平均纤维蛋白肽A水平增加二倍以上(图5)，而抗凝血酶Ⅲ浓度达到最低点64%(图6)。在第5天时多数凝血参数回复到注射前数值。24小时后，D-二聚体浓度开始增加，4天内达到高于对照组三倍的浓度，升高的水平维持至少7天(图7)。但是，在凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物浓度上未见明显改变(数据未表示出来)。在IL-6治疗的狒狒上，凝血酶原片段1+2浓度降低，24小时达最低点(图8)。在受治疗的狒狒上，蛋白C浓度降低，第2天达最低点。此后，蛋白C增至略高于对照值。对照组狒狒的蛋白C保持不变(图9)。
纤溶系统rh-IL-6注射对狒狒t-PA和PAI-1浓度有很大影响。t-PA浓度在3小时延搁后即增高，6-8小时后达最大值，高达比对照组高4倍，此后t-PA浓度逐渐回复至正常(图10)。PAI-1浓度以与t-PA类似的方式增高，6-8小时后达最大值，高于对照组30倍，在24小时内回复正常(图11)。
在注射IL-6后纤溶酶-抗纤溶酶复合物的血浆浓度不变(未表示出来)。
图10为IL-6注射组(·)和对照组(o)狒狒t-PA浓度的连续变化(均值±标准误)。
图11为IL-6注射组(·)和对照组(o)狒狒PAI-1浓度的连续变化(均值±标准误)。
权利要求
1.白细胞介素-6在制备治疗或预防消耗性血栓性出血疾病的药物中的应用。
2.按权利要求1所述的用途，其中血栓性出血疾病为弥漫性血管内凝血。
3.白细胞介素-6在制备治疗或预防伴有至少一种急性相蛋白质水平降低的功能异常的药物中的应用。
4.按上述权利要求之一所述的用途，其中疾病或功能异常是代偿性弥漫性血管内凝血、去纤维蛋白综合征、早期纤维蛋白的溶解或微血管病性血小板减少症。
5.按上述权利要求之一所述的用途，其中所述消耗性出血疾病是由组织因子释放、内皮损伤、血管畸形和感染引起的。
6.按权利要求5所述的用途，其中所述感染伴有败血性体克。
7.按上述权利要求之一所述的用途，其中所述药物制成剂量单位形式，每单位含有白细胞介素-635-50μg/剂。
全文摘要
本发明提供白细胞介素-6在制备治疗或预防消耗性血栓性出血疾病的药物中的应用。本发明还提供白细胞介素-6在制备治疗或预防伴有至少一种急性相蛋白质水平降低的功能异常的药物中的应用。
文档编号A61K38/20GK1084409SQ9310824
公开日1994年3月30日 申请日期1993年7月8日 优先权日1992年7月8日
发明者梅斯特里·J·C·, 埃罗达·S·, 马丁·S·, 伊捷·A· 申请人:应用研究体系Ars控股Nv