用于牛皮癣治疗的蛋白酶抑制剂的制作方法

专利名称：用于牛皮癣治疗的蛋白酶抑制剂的制作方法
背景技术：
牛皮癣是一种慢性皮肤病，其特征为变厚、发红的红斑和鳞屑状皮肤。牛皮癣折磨着约2％的人群。该病通常在成年生活的早期发作，但也可能在少年人或老年人中发生。该病的严重程度各不相同，而且其通常的特征为交替的缓解和突然发作。在更严重的病例中，牛皮癣可累及高达90％的皮肤，并有可能危及生命。
在细胞水平，牛皮癣的特征是表皮角质形成细胞的过量增生，伴随着T淋巴细胞和其他免疫系统细胞的浸润，后者导致与自身免疫疾病相似的炎症。角质形成细胞从基底细胞层运行到角质层的表皮更换时间正常为14天，在此过程中角质形成细胞经历一系列复杂的基因表达改变，导致细胞死亡-“终末分化”。在牛皮癣病人中，表皮更换时间是2天，角质形成细胞的增殖显著提高，以一种相对不成熟的或分化程度较低的形式脱落。
目前，对牛皮癣来说还没有长期治愈的方法。治疗方法包括煤焦油制备物(天然煤焦油或蒸馏蒽林)、局部外用皮质类固醇、用于除去鳞屑的机械处理和抗代谢物如氨甲蝶呤。光敏药物补骨脂素加长波紫外线(PUVA)，以及合成的维甲酸也可以使用。虽然轻中度病例可以在某种程度上有效治疗，但更严重的病例难以治疗，并且对局部治疗或紫外线光疗法具有抗性。而且，系统使用传统的抗牛皮癣药物或长期局部使用类固醇，能够导致有害的副作用或使牛皮癣加重。
遗传分析表明，至少某些形式的牛皮癣含有一种遗传组分，并且人们正在努力致力于定位“牛皮癣易感基因”。与自身免疫疾病的相似性以及患病个体中HLA-13、HLA-17、HLA-Cw6和HLA-DRw7出现率的增加使人们的注意力集中于免疫调节策略和开发能够降低T-细胞活化或耗竭活化T-细胞群的新药物。但由于缺乏能够反映牛皮癣斑中存在的所有不同的临床和细胞改变的动物模型，研究工作受到了严重的阻碍。
一种可以避免免疫调节药物的潜在副作用的替代方法是针对牛皮癣中角质形成细胞的异常分化。角质形成细胞的成熟与蛋白酶的产生相关，后者能降解周围的细胞外基质，使细胞迁移到表层，并通过直接或间接激活细胞因子前体来激活细胞进行分裂。在终末分化时，稳定的角质层的形成需要这种蛋白酶的活性被下调。几种蛋白酶如纤溶酶原激活物和组织蛋白酶B业已显示存在于正常的皮肤，而且牛皮癣的细胞病理生理可能是由于蛋白酶的过量和未调节的水平导致的。
在牛皮癣中，业已观察到尿激酶纤溶酶原激活物(u-PA)和组织纤溶酶原激活物(t-PA)异常的表达。最显著的变化是表皮基底细胞层上部中t-PA表达的大大提高。Jensen等《皮肤病学研究杂志》90(6)777-782(1988)。Baird等《皮肤病学研究杂志》95(5)548-552(1990年11月)。40例牛皮癣患者在局部(蒽林、皮质类固醇)和系统(PUVA)治疗前后，应用自体组织造影纤维胶片方法进行的活组织检验显示，牛皮癣斑中存在u-PA和t-PA的免疫反应性，但在正常和治疗后干净的皮肤中缺乏。Lotti等《国际皮肤病杂志》29(7)528-530(1990)。而且，PAI-2在牛皮癣表皮基底细胞层上部与t-PA相同的区域的增加提示，PAI-2在引发异常伤口愈合模式的皮肤病理学中起一种保护作用。Lyons-Giordano等，“纤溶酶原激活物2型抑制剂在正常和牛皮癣表皮中的表达”《组织化学》101(2)105-112(1994年2月)。
因此很明显，非常需要治疗牛皮癣的新方法和组合物。特别是需要开发通过调节纤溶酶原激活物/抑制剂系统，尤其是使用纤溶酶原激活物抑制剂的治疗牛皮癣的新方法和组合物。
发明简述本发明涉及使用尿激酶抑制剂来治疗牛皮癣。因此，本发明提供一种治疗牛皮癣的方法，包括对有此需要的病人给予有效剂量的尿激酶抑制剂，其中所说的抑制剂局部施用于受累皮肤区域。在本发明的一个实施方案中，尿激酶抑制剂选自含PAI-2、其具有纤溶酶原激活抑制特性的变异体、PAI-2的衍生物和所说衍生物的变异体的组合物。
根据本发明的一个方面，衍生物通过PAI-2的生化修饰而获得，其中所说的修饰选自与聚乙二醇化学交联、磷酸基团连接、硫酸基团连接、肽酶处理、用糖链修饰酶处理以及用糖连接酶处理。在一个实施方案中，变异体通过在PAI-2的氨基末端删除或添加氨基酸残基而获得。在另一个实施方案中，变异体通过在PAI-2的羧基末端删除或添加氨基酸残基而获得。
根据本发明的另一个方面，尿激酶抑制剂以一种凝胶制剂的形式给药。在一个实施方案中，凝胶是一种还含有一种去污剂的纤维素凝胶。在本发明的另一个实施方案中，去污剂是Tween-80。
根据本发明的另一个方面，PAI-2按0.1-2000ug/cm2受累皮肤面积进行给药。根据本发明的另一个方面，PAI-2给药至少每天一次，至少应用5天。
本发明还提供一种治疗牛皮癣的方法，包括对有此需要的病人给予有效剂量的治疗性试剂，所说试剂包括PAI-2和至少一种其他丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所说治疗性试剂局部施用于皮肤受累区域。在一个实施方案中，其他的丝氨酸蛋白酶抑制剂是一种uPA抑制剂。
根据本发明的一个方面，治疗性试剂进一步包含一种选自硫蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂。在一个实施方案中，这些蛋白酶抑制剂与PAI-2共同给药。
本发明进一步涉及一种在含有去污剂的凝胶中包含PAI-2的药物组合物。根据本发明的一个方面，药物组合物含有PAI-2和至少一种其他丝氨酸蛋白酶抑制剂。根据本发明的另一个方面，药物组合物还含有一种选自硫蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂。在一个实施方案中，去污剂是Tween-80。在另一个实施方案中，凝胶是纤维素凝胶。在另一个实施方案中，凝胶至少含有一种进一步的组分，该组分能减少聚合物的形成、增加PAI-2的稳定性以及可以用作一种穿透增强剂。在一个优选的实施方案中，该组分是聚乙二醇。
本发明的其他目标、特征和优点将通过下面的详细描述变得更加清楚。但应当理解，在说明本发明的特殊实施方案时，这些详细描述和特殊的例子仅是说明性的，因为通过这种详细描述，本发明的精要和允许范围内的各种改变和修饰对于本领域的技术人员来说非常明显。
附图简述

图1显示PAI-2在Tween-80存在时从纤维素凝胶中的释放增强。
优选实施方案的详细介绍本发明提供含有一种可用于治疗牛皮癣的尿激酶抑制剂的组合物。在一个优选的实施方案中，该抑制剂以一种外用试剂的形式提供。本发明还包括含有一种尿激酶抑制剂组合另一种蛋白酶抑制剂用于治疗牛皮癣的组合物。此外，本发明提供治疗牛皮癣的方法，包括在皮肤受累区域局部施用前面介绍的组合物。
在一个优选的实施方案中，纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI-2)是局部施用的试剂。PAI-2的特性在Kruithof等“II型纤溶酶原激活物的生物和临床特征”《血液》864007(1995)中有详细介绍。简而言之，PAI-2是纤溶酶原激活物(PA)系统的一个组分。PA系统有多种功能，包括在广泛的生理过程中调节细胞外蛋白分解，例如组织重新模建、细胞迁移、创伤愈合和血管发生。
纤溶酶原激活物(PA)是将纤溶酶原转变为纤溶酶的丝氨酸蛋白酶，它是一种酪氨酸样的丝氨酸蛋白酶，不仅负责纤维蛋白的降解，而且对细胞外基质的降解和转换亦有作用。纤溶酶可在炎症位点局部形成，并可通过其无活性的前体---纤溶酶原的有限蛋白分解而修复，这种前体在血浆和间质液中循环。纤溶酶原可被尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)激活。这些催化反应一般在原生质膜(u-PA)或纤维蛋白表面(t-PA)发生。这些活性酶由广泛的间充质、上皮和内皮细胞应答于多种细胞因子和生长因子而产生。活化的纤溶酶能降解广泛的底物，包括细胞外基质大分子(胶原除外)和纤维蛋白。纤溶酶及其活化蛋白酶的活性在细胞外通过多种蛋白酶抑制剂包括PAI-2和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)调节。
本发明的发明者业已发现，局部施用选自尿激酶抑制剂如PAI-2的化合物可导致与牛皮癣病灶相关的牛皮癣斑的厚度、发红和鳞屑以及红斑的缓解。在本发明的一个优选实施方案中，使用丝氨酸蛋白酶抑制剂PAI-2。具有与PAI-2基本上相同的氨基酸序列并且能抑制纤溶酶原激活物的PAI-2的变异体也可用于本发明的组合物中。也就是说，“PAI-2的变异体”是一种具有与PAI-2基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，尽管PAI-2氨基酸序列的残基被天然或人工地删除、添加或取代，但PAI-2的特征性抑制活性没有丧失。本领域熟知的PAI-2活性的鉴定试验可方便地用来筛选具有这种特征的假定变异体。
因此，本发明包括保守的、半保守的以及其他的氨基酸取代，只要它们不降低活性，使受影响的多肽在本文中治疗性地失效。天然产生的和重组的PAI-2的N-末端和C-末端序列可能各不相同---导致氨基酸残基数的增加或减少---依赖于产生的条件。这些变异体特别地包括在本发明的范围内。技术人员应当理解，PAI-2的其他活性变异体也可用于本发明，只要它们保留了PAI-2的特征性的蛋白酶抑制剂特性。PAI-2的变异体和制备这些变异体的方法也在美国专利No 5 728 564、5 550042、5 486 602、5 444 153和5 403 482中有介绍。
根据本发明，也适宜于作为活性成分的是能通过化学或生物化学修饰PAI-2或一种PAI-2变异体获得的衍生物。这些衍生物的例子是(A)通过与聚乙二醇或其类似物化学交联、(B)通过与磷酸基团或硫酸基团连接、(C)用肽酶如内肽酶处理、(D)用糖链修饰酶或糖链连接酶如唾液酸酶处理而获得的化合物。用这种方式制备的衍生物可用本领域熟知的方法检测其蛋白酶抑制活性。见诸如，Fersht，《酶结构和机制》第2版，W.H.Freeman and Co.，1985，及其参考文献。
这里介绍的蛋白酶抑制剂如PAI-2或PAI-2变异体和衍生物(这里总称为“PAI-2”)可以在任何合适的生理接受的载体例如在磷酸缓冲盐(PBS)溶液中局部施用于病人。其他的载体在本领域是熟知的，并在诸如《雷明顿药物科学》18版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1990)中有介绍。
蛋白酶抑制剂可每天用于伤处，或根据需要调整每天的使用次数。熟练的技术人员应当知道，用于特殊应用的最佳剂量方案在本领域是熟知的，例如上文雷明顿中的介绍。抑制剂的典型每日剂量为大约每cm2受累皮肤区20ug，尽管应当理解，这个数量可进行调整，并且优选使用0.1-2000ug/cm2的浓度。例如，更严重的牛皮癣病例可能需要以500ug/cm2的浓度每天施用多次，例如每天2、3或4次。对于不太严重的病例或对较高剂量反应良好的病例，剂量可以降低。例如，蛋白酶抑制剂的剂量可以顺序降低至例如100、10、1或0.1ug/cm2。此外，抑制剂的施用可以较低频率进行，例如从每天4次降至1次。PAI-2并未显示具有系统毒性，因此，在需要时可以使用更高的剂量。如果需要，PAI-2的系统浓度可使用ELISA试验进行检测，并可相应调节PAI-2的剂量。其他合适抑制剂的毒性和系统浓度可用本领域技术人员熟知的方法测量。
抑制剂在用于病人的载体中的浓度优选为大约1mg/ml，尽管在需要时可使用更高或更低的浓度。例如可以使用低至0.1mg或高至抑制剂在载体中的溶解度极限的浓度。
抑制剂可以短期或长期施用。载体如PBS适用于抑制剂的短期施用。对于较长期的施用，优选使用一种缓慢释放的载体。例如，一种凝胶制剂可用于抑制剂的有效释放。纤维素衍生物在以前已被介绍，可以凝胶制剂与特定的蛋白如EGF、TGF-α、PDGF和FGF匹配。但是，这些制剂中的蛋白质倾向于随时间的延长而聚合，这对于本发明是有害的。这种聚合表现为凝胶的乳色或浑浊，并导致活性蛋白成分的活性降低，并且使蛋白从凝胶中释放变慢，因为聚合物的大小增加。
本发明者通过在抑制剂/纤维素多聚凝胶中加入少量的去污剂(最高至，包括0.05％)克服了这个聚合难题。这使凝胶的清澈度显著改善。这种凝胶的优势在下文实施例2中有更详细地介绍。可以使用去污剂如Tween 80或Genapol PF10。熟练的技术人员还应当理解，其他的去污剂也可以成功地使用。
本发明者意外地发现，除了在凝胶中减少聚合，使用0.02％的Tween80导致抑制剂从一种抑制剂/含Natrosol凝胶中的释放增强。这些实验在下面的实施例2中介绍。本发明者业已进一步发现，在凝胶中加入高达10％的丙二醇也能减少聚合物的形成并增加PAI-2在凝胶中的稳定性。丙二醇进一步显示能促进PAI-2穿透进入皮肤。
在本发明的另一个实施方案中，PAI-2与至少一种其他的蛋白酶抑制剂结合使用。例如，PAI-2可与另一种丝氨酸蛋白酶抑制剂如氨氯吡嗪脒或其衍生物联合使用。
在另一个实施方案中，PAI-2与至少一种金属蛋白酶、酸性蛋白酶和/或硫蛋白酶的抑制剂联合使用。例如，PAI-2可与乙二胺四乙酸(EDTA)、胃抑素和N-乙基马来酰亚胺(NEM)中的一种或多种联合使用。
在另一个实施方案中，PAI-2与至少一种其他蛋白酶抑制剂和至少一种金属蛋白酶、酸性蛋白酶和/或硫蛋白酶抑制剂的组合物联合使用。
丝氨酸和硫蛋白酶以及酸性蛋白酶和金属蛋白酶的抑制剂在本领域是熟知的，许多都可以从商业渠道获得，例如从Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)、Promega(Madison，WI)、Calbiochem(La Jolla，CA)和Life Technologies(Rockville，MD)购买。其他的抑制剂在酶学的著名文献中介绍，例如Fersht《酶的结构和机制》2版，W.H.Freeman and Co.，1985及其参考文献。
其他的抑制剂可在PAI-2处理之前、之后或同时施用。抑制剂也可以比PAI-2更高或更低的频率施用。具体地说，降解较快的抑制剂可以比较稳定的抑制剂更高的频率施用。相反，更稳定的抑制剂施用的频率要低一些。熟练的技术人员应当理解，简单的抑制剂稳定性试验可用来测定抑制剂施用的频率。
其他的抑制剂优选用与PAI-2相同的载体进行施用，尽管这对有效性来说不是必要的。具体地说，抑制剂可在用于PAI-2的相同凝胶载体中使用，如同上面的介绍。如果抑制剂不是在与PAI-2相同的载体中使用，那么它们可在所介绍任何可以药用的载体中例如上文雷明顿中所介绍的载体中使用。
这样，一般性介绍的本发明可通过参考下面的实施例更容易地理解，这些实施例以说明的方式提供，而不是为了限制本发明。
实施例1局部施用PAI-2凝胶(1mg/ml)用于治疗牛皮癣A.基本研究设计进行一项双盲、安慰剂对照的随机研究来测定局部施用PAI-2凝胶治疗轻中度牛皮癣的安全性、耐受性和效果。研究病例总数为22例男性13例，女性9例，平均年龄为42岁(范围为18-64岁)。入选患者的病程平均为17年(范围为3-34年)。在进行试验的22个病人中，14个病人在开始试验之前没有对他们的试验病灶进行治疗，8个病人不得不终止对他们病灶的治疗。
对牛皮癣斑治疗14天。在每只臂上，在治疗前(0天)剥去一个病灶，并在开始治疗后的第7天重复一次。癣斑通过重复(10次)的施用和除去黏附的敷料来剥去。参与研究的每个病人都对4个病灶进行治疗，每只臂上各2个。
将PAI-2或安慰剂凝胶每晚施用于牛皮癣病灶。不使用敷料。将一只臂上的病灶用0.5g(装在一个2.5mL注射器中的0.5mL)安慰剂凝胶(1％w/v Natrosol凝胶)处理。另一只臂上的病灶用与安慰剂相同剂量的PAI-2凝胶(1.0mg，1％w/v Natrosol凝胶)处理。每个凝胶都施用于一个病灶，并轻轻涂抹。
PAI-2凝胶通过将1mg/g的PAI-2溶解于1％Natrosol、一种纤维素的部分取代的聚(羟乙基)酯的凝胶中来制备。PAI-2在这种凝胶中保留了生物活性，并以6小时释放75％的速率从此凝胶中释放。
PAI-2本身以高纯度的重组蛋白的形式制备，由用编码人PAI-2的cDNA转化的酵母细胞的发酵来获得，例如通过美国专利No 5 298 400中介绍的方法，该专利在此全文引入作为参考。纯化PAI-2的方法在诸如美国专利Nos 5 204 807和5 462 857中介绍。B.安全性和耐受性本研究的一个目标是评估局部施用的PAI-2凝胶的安全性和耐受性。在参与本研究的22个病人中，所有的病人，除了一个受试者在第1次访问后没有继续试验，都包括在安全分析中(n＝21)。
在治疗之前、治疗结束时和研究结束时，进行完全的血液学和生物化学筛查。检测全血计数、电解质、尿素氮、肌酐、肝功能和血糖。
被研究者判定为具有临床意义的任何异常的实验室数据，包括治疗后的实验室检测，都采用适当的医学处理，直到回归为正常或基线值。
在治疗一周(第7天)、治疗结束时(第14天)和研究结束时(第21天)监测不良反应事件。研究者负责记录在研究过程中所有观察到的或记录的所有不良反应事件，不考虑药物相关的评估和/或临床意义。
不良反应事件(AE)定义为在基线时不存在但在研究过程中出现，或者在基线时存在但在研究过程中恶化的任何症状、体征、综合征或疾病。不考虑事件的可疑原因。
严重的不良反应事件定义为致命的或被认为危及生命的任何事件，这种事件需要住院或延长住院时间，或者这种事件可导致永久残废、先天性畸形、癌症或超剂量。
不良反应事件可由病人自动报告，或对研究者的一般性询问的回答，或者是实验室数据改变的结果。
记录所有的不良反应事件。描述持续时间、频率(单次事件、间隔、持续)、严重性(轻度、中等、严重---表1)、其原因的评估(所研究的适应症、并发疾病、伴随的治疗、研究的疗法或其他)、其与所研究的药物疗法的关系(明确、很可能、可能、不太可能、无关---表2)、以及对所研究的药物疗法的影响及其结果。
在开始研究时，病人们被要求在研究期间报告任何有害或异常的事件/反应。在确定自上次访问后是否发生了不良反应事件，不要问提示性的问题，而是问“自上次访问后你感觉怎样”。
追踪在治疗结束时仍然存在的所有不良反应事件，直到该事件被解决或稳定。
表1不良反应事件的认定严重性的评估
表2不良反应事件的认定原因的评估
21个病人符合安全性分析的要求。指定的每天总剂量是将含有1.0mg/mL PAI-2的1.0mg的Natrosol凝胶施用于2个病灶，每个病灶用0.5mg处理。但19个病人在治疗的第1周仅用指定每日剂量的半量PAI-2进行处理，因为他们在每只臂上使用一个注射器而不是2个；2个病人接受指定每日剂量治疗仅1周。19个病人中有2个因偶然因素使用了一次额外的剂量。
在研究中5个病人共报告了6次不良反应事件。一个病人在第3次访问(第14天)时报告血糖水平轻度升高，研究者判断不太可能与本药物研究有关。在研究中4个病人总共报告了5次皮肤相关的不良反应事件在凝胶施用时感觉冷、轻微刺痛、烧灼感和温和的刺痛以及肘部痒/痛/破裂/流血。
报告的不良反应事件不严重，反复发作，严重性为轻至中度。没有1例不良反应事件需要进行任何处理。皮肤相关的不良反应事件(除了痒/痛/破裂/流血)被认为在某种程度上与所研究的药物有关，尽管这些事件的分布在试验药物与安慰剂之间相似。
没有严重的不良反应事件报告。本研究没有死亡的报告。这项研究没有报告其他明显的不良反应事件。
4个病人报告了在血液学和临床化学中有临床意义的改变。没有其他数值在临床化学和血液学的参考范围之外，不具临床意义。
第5号病人在第3次访问和基线时血清ALT升高(SGPT)(分别为123U/L和112U/L)，并且血清GGT水平(分别为62和63U/L)也升高。因为在研究开始前18个月和基线测定已经发现肝功(ALT/GGT)水平升高，并且没有显示在研究过程中有升高的趋向，因此可以得出结论，这些改变与本研究药物无关。
第6号病人的基线血清SGOT(67U/L)、SGPT(124U/L)和GGT(257U/L)水平升高，第3次访问时仍高(分别为71U/L、89U/L和237U/L)。这些改变不被认为与本研究的药物有关。
第8号病人基线测定时WBC计数(2.0×109/L)、中性粒细胞(0.95×109/L)和淋巴细胞(0.80×109/L)均降低。
第17号病人的血小板计数在基线测定时(82×109/L)、第3次访问时(82×109/L)和第4次访问时(85×109/L)均降低。血清GGT水平在基线测定时(227U/L)和第4次访问时(208U/L)均升高。血糖水平(BGL)在第3次访问时(11mmol/L)和第4次访问时(10.9mmol/L)均升高。在第3次访问时的BGL改变被记录为一次AE，它被判断为与本研究的药物无关。
使用ELISA方法检测在治疗前(第1次访问)、治疗结束时(第3次访问)和研究结束时(第4次访问)取得的血液样品中PAI-2，来确定系统吸收是否发生。PAI-2分析的检测低限是8ng/mL，定量的极限(L0Q)被假定为50ng/ml左右。重复分析之间可接受的误差系数(CV)为10％或更低。
使用ELISA方法检测血液中PAI-2的水平，来确定系统吸收是否发生。治疗前采取的血液样品部分贮存在-80℃，并用于检测由PAI-2激发的可能抗体。治疗前(第1次访问)、治疗结束时(第3次访问)和研究结束时(第4次访问)从每个病人各收集20mL血液样品。将血液样品分装进3个单独的试管用于PAI-2分析、血液学和临床化学筛查。
血液样品检测的PAI-2水平示于表3。此表中给出的结果代表来自不同试验的分析，只有当结果彼此不同时，将两次分析的结果给出。
除了4号病人，所有病人治疗前获得的样品中PAI-2水平都低于检测的极限(BDL)。在给予了2周的治疗后，在治疗结束时和结束后2周收集的血液样品，大多数PAI-2浓度都低于检测极限。但是，高于检测极限的浓度是没有意义的水平。在2个病人中，分析失败，因为CV比10％高。这次研究中获得的所有结果都低于LOQ。
表3 PAI-2 ELISA分析结果 *LOQ＝定量的极限(50ng/ml)；阴影区域＝未进行分析；+CV＞10％；BDL＝低于检测极限(＜8ng/mL)；总而言之，整个研究过程中报告的大多数不良反应事件，尽管它们被认为与被研究的产品有关，或某种程度上有关，但它们在试验药物和安慰剂之间的分布相似。在研究过程中发现的血液学和临床化学的有临床意义的改变与要研究的产品无关，因为它们在基线测定时就存在。
在一些样品中，有证据表明局部施用的PAI-2可能被吸收，但是，大多数样品中没有可检测到的PAI-2存在。检测到的PAI-2浓度不是有意义的水平，因为它们都低于能够表示PAI-2可能吸收的LOQ，如果吸收，也是微量的。
因此，进行的安全性评估表明，局部施用PAI-2凝胶在牛皮癣病人中能被很好地耐受。C.效果本研究的另一个目标是评估用PAI-2凝胶治疗牛皮癣的效果。根据此目标，在每次访问时，对病灶的厚度、红色的程度和鳞屑进行了评估。此外，在治疗前、治疗结束时和研究结束时对病灶进行了拍照。1.效果的测量和变化a.病灶厚度治疗的病灶的厚度在第0、7、14和28天由同一人用卡尺进行了测量。病灶的厚度通过用牛皮癣病灶的厚度减去附近正常皮肤的厚度来计算。每次评估使用同一的正常皮肤区域。
病灶厚度的评估在第0和7天剥去病灶之前和之后进行。
b.红色和鳞屑在每次访问(第0、7、14和28天)时，使用红色计测量红色的程度，并根据分类尺度进行评估分为0(无)至3级(严重)。每个病灶的鳞屑在每次访问时使用尺度进行评估分为0(无)、1(轻度)、2(中等)和3级(严重)。
红色和鳞屑的程度的评估在第0和7天病灶剥去之前和之后进行。
c.照片证据在治疗之前(第0天)、治疗结束时(第14天)和研究结束时(第28天)使用医院的医学照相机在标准条件下对病灶照相。第0天在病灶剥去之前和之后对病灶照相。2.效果评估在拆分处理模式之前确定2组研究群体意愿治疗(ITT)组和程序治疗(PP)组。ITT组用于安全性和效果分析，PP组用于效果分析，第0天至第14天。
ITT组包括所有接受了一个剂量的研究药物并在治疗开始后至少有一个效果观察记录的所有受试者(n＝21)。第3号病人和第8号病人只接受了1的治疗，在第2次访问(第7天)取得的数据直接用于第14天和28天的ITT分析。
PP群体包括完成了第3次访问(第14天)并且由主要研究者确定没有明显的程序偏差的所有受试者(n＝19)。
在每次访问时都对病灶厚度、红色的程度和鳞屑的改变进行评估和分析。在积极治疗和安慰剂处理、病灶剥去和未剥去、每个治疗组中的剥去和未剥去之间进行比较。还检查每个治疗亚组中随时间的改变。
a.意愿治疗(ITT)分析(i)病灶厚度从第0天至第14天和28天的病灶厚度的改变在表4中给出(单位为mm)。每个处理组合的病灶的改变百分比在表5中给出。
当分析第0天至第14天和28天的改变时，除了一种情况，病灶厚度没有显著的减少，该情况是未剥去的病灶在用活性药物处理后，病灶厚度从第0天至第14天减少为27.24±43.7％(表5)。但是在百分比改变中有很大的变化，包括一些百分比的负改变，这表明病灶厚度的大小增加。
表4病灶厚度—第0天至第14天和第28天的改变(mm)
*配对t-检验表5.每个处理组合在第0天至第14天和28天的病灶厚度的改变(百分比)
+配对t-检验；*显著改变；N.B.负数，提示增加。
(ii)红色度根据从0(无)到3级(严重)的分类尺度评估的第0天至第14天和28天的红色度的改变在表6中给出。
红色度的改变不显著，除了一种情况，即p值接近显著(p＝0.022)，是用安慰剂处理的病灶在第0天至第28天的改变未剥去(-0.048±0.7)对剥去(0.524±0.81)。
在分析第0天至第14天的改变时，活性组中剥去的病灶红色也有显著的降低，其中p值应用配对t-检验时为0.016。比较第0天与28天，在安慰剂组中红色有显著的降低，其中p值为0.008(表6)。
表6.红色度——第0天至第14天和第28天的分值改变
+配对t-检验；*统计学有显著意义。
(iii)红斑红斑使用一种红斑记录器进行测量。红斑在第0天至第14天和28天的改变在表7中给出。
安慰剂处理与活性药物治疗相比，在比较第0天至第14天和28天的改变时，没有显著的变化。但是，在使用配对t-检验分析每个处理亚组对基线的改变时，有显著的降低(表7)。
表7.红斑—第0天至第14天和第28天的改变
+配对t-检验；*统计学有显著意义；**临界显著意义。
(iv)鳞屑根据鳞屑尺度分级标准，0(无)，1(轻度)，2(中等)和3(严重)，从第0天到第14天和第28天的鳞屑变化在表8和表9中给出。
该参数的任何对比均无显著差异。
表8 鳞屑——第0天到第14天和第28天的分值变化
+配对t-检验表9.鳞屑—两个样品t-检验的结果
b.程序治疗(PP)分析19个病人对于效果的PP分析是有价值的。在进行的任何PP分析中都没有显著差异，除了病灶厚度，其中用活性药物处理的未剥去的病灶厚度减少28.36±45.6％(表10)。
表10.每个处理组合的第0天至14天的病灶厚度的改变(百分比)
+配对t-检验；*显著改变；N.B.负值提示增加。3.统计学/分析结果进行了两个样品t-检验来比较各处理亚组之间从第0天分别至第14天和第28天的4个因素(病灶厚度、红色度、红斑和鳞屑)的改变，使用分类和0(无)至3(严重)级的尺度，用于红色度和鳞屑的连续变化。红斑使用一种红斑记录器进行测量。每种情况，用第0天的测量值减去第14天和第28天的测量值(这样正值表示随时间减少)，并在下列组之间比较差别●未剥去，安慰剂对活性剂●剥去，安慰剂对活性剂●安慰剂，未剥去对剥去●活性剂，未剥去对剥去还进行配对t-检验来检查每个处理亚组随时间的改变，检测如下假定，即在特定亚组中从基线的改变为0。
在每个时期计算病灶厚度的百分比改变，计算方法为第0天与第14天和第28天的差除以第0天并乘以100。
在四个处理亚组中进行配对方式比较。因此，仅能根据从各亚组的基线的改变得出结论，而不是在各处理组之间。4.效果结论在下列任何比较中，在比较第0天至第14天和第28天的改变时，没有显著的差异未剥去，安慰剂对活性剂剥去，安慰剂对活性剂安慰剂，未剥去对剥去活性剂，未剥去对剥去对于在α＝0.02(单侧可能性)的四个测量参数(即病灶厚度、红色度、红斑和鳞屑)，按方法中的具体介绍。
但是，有一种情况，p值接近显著(p＝0.022)，即在ITT群体中的红色度，第0-28天，安慰剂，未剥去(-0.048±0.7)对剥去(0.524±0.81)。5.每个处理组中的配对比较有一种情况，病灶厚度的减少超过25％，是为未剥去的、活性亚组，第0天至14天。在ITT群体中，减少的百分比是27.24±43.7，在程序治疗组中为28.36±45.6。这些差异在组中使用配对t-检验时显著，P值分别为p＝0.01和p＝0.014。但是在百分比改变中观察到了很大的差异，包括一些负性百分比改变，提示病灶厚度的大小增加。
当在每个处理亚组中使用配对t-检验分析从基线的改变时，红色度和红斑也有显著的减少。这些显著改变都是从基线减少，并且都在ITT群体中。D.讨论和总的结论在本研究中发现的血液学和临床化学中的临床显著改变不被认为与本研究的药物相关，这表明系统性的副作用如果不是不存在的话也很可能是极少量的。
在本研究中记录了大量施用药物的皮肤反应。这些事件大多数尽管在某种程度上与研究的产品有关，但它们在试验药物和安慰剂中的分布相似。
使用如同本研究一样的同一批次和同样强度的PAI-2在健康的志愿者中获得的前期经验表明，无论对PAI-2还是缓冲液，药物都有很好的耐受性，没有皮肤反应。这些发现以及本研究所发现的事实，即皮肤反应的分布在安慰剂和活性处理之间相似，表明局部施用PAI-2凝胶很可能具有很好的耐受性。但是，应当在大群体的病人中进行长期安全研究，来评估皮肤反应在牛皮癣病人中的发生率。
没有局部施用PAI-2的吸收和系统性分布的结论性数据，因为在处理结束后和在处理结束2周后获得的大多数样品中没有检测到PAI-2的存在。
通过分析病灶厚度、红色度/红斑和鳞屑获得了局部施用PAI-2凝胶在治愈牛皮癣病灶中的疗效数据。它们显示，未剥去的病灶的厚度在用活性药物处理2周后，减少超过25％(表5和表10)。而且，剥去的病灶的红色度在活性药物处理2周后也有显著的减少。当在每个处理亚组中使用配对t-检验分析相对于基线的改变时，红色度和红斑也有显著的减少(表6和表7)。但是，在比较未剥去和剥去的四个测量参数时，没有显著性差异。
应当注意，我们发现病灶厚度的百分比改变有很大的差异(表5)。这可部分用以下原因解释，病灶厚度与皮肤厚度之间结果的误差是由于用于厚度测量的方法不精确(Harpenden卡尺)、测量误差和操作者误差。
总而言之，本研究进行的安全性评估表明，局部施用PAI-2凝胶在牛皮癣病人中有很好的耐受性。效果数据表明，PAI-2在局部施用于牛皮癣病灶时，很可能在诱导创伤愈合的皮肤病理中具有保护作用，并对于牛皮癣的治疗具有益处。
实施例2含PAI-2凝胶的制备和PAI-2释放的测量在这些实验中，将含有PAI-2的凝胶置于一个双室管的上层。底层含有缓冲液，用一种微孔膜将两个室分开。在底层中出现PAI-2就表明PAI-2从凝胶中释放，并用PAI-2活性试验进行监测。
下面的表反映了新型PAI-2凝胶制剂的改良特性。PAI-2从凝胶中释放增强在图1中描述。
PAI-2凝胶制剂的清晰度赋形剂聚合物浓度(％)安慰剂无 Genapol PFIO Tween 80Carbopol 971P 0.5 清楚 S.O 清楚 清楚1.0 清楚 S.O 清楚 清楚Carbopol 974P 0.5 清楚 opal.S.OS.O1.0 清楚 浑浊 opal. S.OCarbopol 981 0.5 清楚 S.O 清楚 清楚1.0 清楚 S.O 清楚 清楚Blanose 7LF 2.0 清楚 浑浊dV.O.dopal.dNatrosol 25OHHX 1.5 清楚 S.O. 清楚 清楚Keltrol RD3.0 opal. 浑浊 V.O. 浑浊关键词opal.＝乳色s.o.＝轻微乳色v.o.＝浓乳色d＝可能微生物污染方法将聚合物溶至所需浓度，然后滴定至pH7.4-7.7。去污剂加至0.05％，PAI-2加至1mg/ml。叠氮化钠(0.05％)用作防腐剂。
这里介绍的本发明可以在不背离本发明的精神和基本特征的情况下用其他的具体形式进行实施。因此前面介绍的具体实施方案应被认为是说明而不是限制本发明的范围。此外，上面引用的所有公开文献在此作为整体进行引入，如同它们被单独引用一样。
权利要求
1.一种治疗牛皮癣的方法，包括对有此需要的病人施用有效剂量的尿激酶抑制剂，其中所说的抑制剂局部施用于受累皮肤区域。
2.权利要求1的方法，其中所说的尿激酶抑制剂选自PAI-2、其具有纤溶酶原激活抑制特性的变异体、PAI-2的衍生物和所说衍生物的变异体。
3.权利要求1的方法，其中所说丝氨酸蛋白酶抑制剂以一种凝胶制剂的形式施用。
4.权利要求3的方法，其中所说凝胶是一种还含有去污剂的纤维素凝胶。
5.权利要求4的方法，其中所说的去污剂是Tween 80。
6.权利要求4的方法，其中所说凝胶还含有聚乙二醇。
7.一种治疗牛皮癣的方法，包括对有此需要的病人施用有效剂量的治疗性试剂，其中所说试剂含有PAI-2和至少一种其他的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所说的治疗性试剂局部施用于受累皮肤区域。
8.权利要求7的方法，其中所说的其他丝氨酸蛋白酶抑制剂是一种uPA抑制剂。
9.权利要求7的方法，其中所说的治疗性试剂还含有一种选自硫蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂。
10.权利要求7的方法，其中所说的蛋白酶抑制剂与PAI-2一起施用。
11.一种在含有去污剂的凝胶中含有PAI-2的药物组合物。
12.权利要求11的药物组合物，其中所说的去污剂是Tween-80，而所说的凝胶是一种纤维素凝胶。
13.一种含有PAI-2和至少一种其他丝氨酸蛋白酶抑制剂的药物组合物。
14.权利要求13的药物组合物，还含有一种选自硫蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂。
15.权利要求13的药物组合物，其中所说的组合物的形式为含有去污剂的纤维素凝胶。
16.权利要求2的方法，其中所说PAI-2按0.1-2000ug/cm2伤口的范围施用。
17.权利要求16的方法，其中所说的PAI-2至少每天施用一次，至少施用5天。
18.权利要求2的方法，其中所说的其衍生物通过PAI-2的生物化学修饰获得，其中所说的修饰选自与聚乙二醇化学交联、磷酸基团连接、硫酸基团连接、肽酶处理、用糖链修饰酶处理以及用糖连接酶处理。
19.权利要求2的方法，其中所说的变异体通过从PAI-2的氨基末端删除或添加氨基酸残基获得。
20.权利要求2的方法，其中所说的变异体通过从PAI-2的羧基末端删除或添加氨基酸残基获得。
全文摘要
牛皮癣可通过局部施用尿激酶抑制剂如PAI－2,或者施用蛋白酶抑制剂如PAI－2与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂如金属蛋白酶、酸性蛋白酶和硫蛋白酶的抑制剂的组合物进行治疗。
文档编号A61K38/57GK1322138SQ99811799
公开日2001年11月14日 申请日期1999年8月5日 优先权日1998年8月5日
发明者C·L·邦恩, P·J·夏普 申请人:澳洲生物科技公司