一组新的抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一组新的抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组抗菌肽、其制备方法及在制备治疗细菌、真菌、病毒感染的药物中的应用。
背景技术：
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。随着对抗菌肽一级结构和高级结构研究的不断深入，已有许多研究者对这些抗菌肽的结构和功能进行研究，发现在模拟膜的疏水环境下，分子中的α -螺旋度与其杀菌活性密切相关。另外研究结果表明抗菌肽是通过破坏膜的完整性使得细菌细胞膜渗漏而杀死细菌(Nakajima Y. etal.，J. Biol. Chem, 262 :1665-1669 ；Zasloff M. Nature, 2002,415 389-3%)。因此有人试图通过增加分子中α-螺旋结构或提高多肽中含正电荷氨基酸的比
^ W^Ι (Broth W. B. etal. ,Antimicrobial Agents Chemotherapy, 2001,45 :1894-1895 ；HongS. Y. etal.，P印tides，2001，22 :1669-1674)。美国专利6，316，594公开了天然抗菌肽parasinl，它是一种新的从鲶鱼中分离出来的，是由鲶鱼在表皮损伤时为防止微生物的入侵其上皮粘膜层产生出一种具有很强抗菌作用的多肽，属于α -螺旋抗菌肽，分子量为2000. 4Da,由19个氨基酸残基组成，序列为 Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser Ser0尽管专利文献中的Parasin I对微生物表现出非常有效的广谱抗菌活性，包括革兰阳性和革兰阴性细菌以及真菌，而且没有任何溶血性。它合成的衍生物也具有有效的活性。但是在我们实验中却发现其杀菌活性较低，天然序列很难应用于临床，但是Parasin I基本没有溶血性，它的一些相关的序列改造和功能应用方面的开发还进行的较少。所以本发明想通过对Parasin I序列的改造，得到杀菌活性更强的有药用开发价值的抗菌肽，即可以形成新的专利技术。

发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一组抗菌肽。本发明需要解决的技术问题之二是提供一组抗菌肽的制备方法。
本发明需要解决的技术问题之三是公开所述抗菌肽的应用。本发明的发明构思是这样的我们在经过多次试验后发现在Parasin I序列中间隔插入疏水性氨基酸和带正电荷的氨基酸后，形成两个疏水氨基酸和两个正电荷氨基酸交替排布的序列，这样的结构减低毒性并提高杀菌活性。经过改造后筛选到以下12条序列， 抑杀菌试验证明其杀菌活性有较大的提高。而溶血毒性基本没有变化，非常有希望用于治疗细菌感染的新药的开发。本发明提供的抗菌肽是在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成的， 它们的这一系列序列被命名为GKV，序列如下GK V-I:Lys Gly Ala Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Ala Leu Lys ArgAla Gly LysGK V-2 :Lys Gly Gly Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysArg Ala Gly ArgGK V-3 :Lys Gly Gly Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysGK V-4 :Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysGK V-5 :Lys Gly Ala Arg Arg Gly Ala Lys Arg Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysGK V-6 :Lys Gly Ala Arg Arg Leu Ala Lys Arg Ser Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Ala Gly ArgGK V-7 :Lys Phe Ala Arg Arg Leu Ala Lys Arg Leu Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Leu Gly ArgGKV-8 :Lys Phe Leu Arg Arg Leu lie Lys Arg Leu Val Lys Lys Val Leu Arg Lys Leu Gly ArgGKV-9 :Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Arg Ala Ala Lys Lys Ala Thr ArgGKV-10 :Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu Lys Arg Ala Leu Lys Lys Ala Leu ArgGKV-Il :Lys Gly Leu Lys Lys Gly Leu Lys Arg Gly Leu Lys Lys Gly Leu ArgGKV-12 :Lys Ala Thr Lys Lys Ala Leu Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ala Thr Arg本发明提供的一组抗菌肽，其制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱鉴定。为了深入研究本发明这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备本发明公开的一组抗菌肽和作为对照的抗菌肽，以进行研究。利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc ；FEBS Letters ； 437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽 GramicidinS，parasinl, magaininll 为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本发明抗菌肽的杀菌活性强于所述三种天然抗菌肽的杀菌活性。抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD49tl值确定毒性的大小。因此本发明还检测了抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本发明抗菌肽的溶血毒性极小。此外，又对本发明抗菌肽进行动物体内急性毒性试验，证明抗菌肽无毒性作用。又进行抗菌肽对小白鼠急性感染金黄色葡萄球菌的抑制作用的试验，表明抗菌肽对金黄色葡萄球菌感染有显著的抑制作用。本发明提供一组新的人工设计合成的抗菌肽。可方便地采用固相化学法制备或将编码抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得。该抗菌肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒具有广谱杀伤活性，并较天然抗菌肽有更强的杀菌活性，但对动、植物细胞无任何毒害作用。并通过抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染杀菌活性的小鼠试验显示抗菌肽给予0. 25mg/kg剂量，就能达到100%杀菌抑制率，而作为杀灭金黄色葡萄球菌特效药的万古霉素要给予4. Omg/kg剂量才能达到100%的杀菌抑制率，表明本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染有很显著的杀菌效果，因此本发明抗菌肽可应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物。


图1是抗菌肽GK V-4的质谱图。
具体实施例方式实施例1抗菌肽的固相化学合成制备及分离纯化按上述序列制备GK V-I到GK V-12，同时制备Gramicidins, parasinl和 magaininll作为对照。GramicidinS 的序列Val Orn Leu Phe Pro Val Orn Leu Phe ProParasinl 的序列Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser Sermagaininll 的序列Gly lie Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glulie Met Asn Ser本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的 Pioneer多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通过质谱鉴定。具体试验步骤如下1、抗菌肽的制备(以制备0. Immol量的GK V-I为例)以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备的GK V-I多肽序列为N-Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys-C制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0. Immol的结合了第一个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20%哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。制备后的多肽经如下步骤剪切取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88%三氟乙酸，5%苯酚，5%水，2%三异丙基硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转/分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。2、抗菌肽纯化称量一定量干燥后的多肽，溶于0. 三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗脱液为含80%乙氰的0. 1 %三氟乙酸)，收集洗脱峰。实施例2抗菌肽GK V-4基因在大肠杆菌中的表达首先设计合成编码抗菌肽的GK V-4基因，将其克隆到pGEX-4Tl载体上(购自 Amersham Pharmcia Biotech公司)，然后转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达GST-GKV-4 融合蛋白，再经凝血酶切割后，得抗菌肽GKV-4。实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。大肠杆菌JM109培养在液体或固体的LB培养基中。采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK V-4基因的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK V-4基因的5’端引入酶切位点BamHI (GGATCC)，在3’端加上终止密码子 (TAG)，所得构建基因的长度为72bp。通过DNA合成仪直接合成该核苷酸片断。首先用PCR方法对基因进行扩增。设计-对引物5，-CCTAGGTTTCCACA-3，和 5，-GATGAAGTTTCG-3，。PCR 反应条件如下94°C，30 秒；45 °C，45秒；72 °C，30秒；反应30个循环。PCR反应后将该片断经过Klenow酶补平后用 BamHI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与pGEX_4Tl 载体的BamHI和SmaI的双酶切片断连接后转化大肠杆菌JM109，转化子通过SmaI酶切鉴定、筛选。转化子经过IPTG诱导表达GST-GKV-4融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GKV-4，具体操作参照试剂盒操作说明。GKV-4蛋白序列Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys
编码GKV-4的核苷酸序列AAAGGTGTTCGTAAAGGCGCCAAACGCCAGGGTTGCAAGAAACTTGCCCGTAAGGCTTTGAAG实施例3抗菌肽GK V-4基因在酵母细胞中的表达本实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。设计合成编码抗菌肽的GKV-4基因，经过BamHI酶切与编码GST的DNA序列连接，后将其连接到质粒pBluescriptSKII (购自美国Mratagene公司)中，转化大肠杆菌DH5ci (购自武汉大学菌种保藏中心)，提取质粒经过测序证明序列正确后，质粒经过 EcoRI, XhoI酶切后连接到pPIC9载体(购自美国^witrogen公司)中，后转化毕氏酵母菌株KM71 (购自美国hvitrogen公司)，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK V-4。有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。毕氏酵母菌株KM71培养在液体或固体的BMGY培养基中，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GKV-4时酵母菌株培养在BMMY 培养基中，每隔M小时补加甲醇至终浓度为1%。采用酵母菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GKV-4及GST的DNA序列。在抗菌肽GKV-4基因的5’端引入酶切位点BamHI (GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)及 EcoRI酶切位点(GAATCC)，所得构建基因的长度为78bp，同时在GKV-4基因前段接编码GST 的DNA序列，同时在GST的DNA序列的5，端加了一个BioI酶切位点。GKV-4核苷酸片断的制备通过DNA合成仪直接合成编码GK V_4核苷酸片断。然后用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物5 ’ -CCTAGGTTTCCACA-3，和 5，-CTTAAGGATGAAGTTTCG-3，。PCR 反应条件如下:94V, 30 秒；45°C，45 秒；72°C，30 秒；反应35个循环。编码GST的DNA序列的的制备设计一对弓|物5’ -CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’5， -CAGTGCTACGCCGGCGAG-3，用以上引物扩增pGEX-4Tl载体。PCR反应条件如下94°C，30秒；45°C，45秒； 72°C，60秒；反应30个循环。扩增片段与质粒的连接将GKV-4的PCR扩增片断经过Klenow酶补平后用BamHI 和EcoRI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与编码GST 的DNA扩增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段连接后与pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI 酶切回收片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，转化子经过抗性、蓝白斑、酶切鉴定后，进一步经过测序确定表达序列正确。提取质粒经》ιοΙ和EcoRI酶切回收小片段，与pPIC9的 XhoI和EcoRI酶切连接构建成表达质粒pPIC9-gst-GKV-4，转化大肠杆菌DH5a后经氨苄青霉素抗性筛选转化子。按文献报道的方法(Clare JJ, etc.，Gene，1991，105 :205-212)制备毕氏酵母KM71的感受态细胞，并将Mel单酶切的线性化重组质粒pPIC9-gst-GKV-4经电转化导入感受态细胞，电转化的条件为1. 5KV，22. 5uF。将电转化的酵母细胞涂板于YPD 平板，30°C培养两天后，筛选表达融合蛋白的阳性克隆。转化子经过甲醇诱导表达GST-GK V-4融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK V-4，具体操作参照试剂盒操作说明,GST-GK V-4融合蛋白序列Leu Glu Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Thr Arg Leu Leu LeuGlu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Lys Trp Arg Asn LysLys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Val Lys Leu The GlnSer Met Ala lie lie Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn Pro Lys Glu Arg AlaGlu lie Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp lie Arg lie Ala Tyr Ser LysAsp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Met Phe Glu Asp ArgLeu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The Leu Tyr Asp Ala LeuAsp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Cys Phe Lys Lys Arglie Glu Ala lie Pro Gln lie Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Trp Pro Leu Gln GlyTrp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Arg Gly SerLys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Ala Leu LysGST-GK V-4 核苷酸序列CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTAAAGGTGTTC
Gly Leu Val Gln Pro Arg Asp Glu Gly Asp Tyr lie Asp Gly Asp Met Leu Gly Gly Cys Tyr Gly Val Ser Arg Pro Glu Met Leu Lys His Pro Asp Phe Met Phe Pro Lys Leu Val Ser Lys Tyr lie Ala Ser Asp Leu Val Pro Lys Leu Ala Arg Lys
GTAAAGGCGCCAAACGCCAGGGTTGCAAGAAACTTGCCCGTAAGGCTTTGAAGTAGGAATTC实施例4抗菌肽的鉴定如图1所示，制备的抗菌肽GK V-4经过质谱分析，GK V_4在质谱图中显示的分子量为2324.0。由多肽序列计算出的理论值为2324.0。证明制备的多肽即为设计的GK V-4 抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。抗菌肽GK V-I，GK V-2及本发明公开的其它抗菌肽，天然抗菌肽Gramicidins， parasinl和magaininll可以采用GK V-4抗菌肽的制备方法制备。实施例5抗菌肽的杀菌活性检测以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。采用96孔板法对抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽 Gramicidins (S)，parasinl (I)和magaininll (II)作为对照，并用固相化学合成法合成本发明中的12条抗菌肽GK V-I到GK V-12，检测它们的杀菌活性。按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性菌种复苏，接种斜面37°C培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37°C培养过夜，稀释菌液使菌浓度为104-105CFU/ml，按每孔IOOul菌液接种于96孔板中，将多肽以一定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37°C培养过夜，酶标仪检测OD620值(In Yup Park etc ；FEBS Letters ；437 (1998) 258-262)。检测结果见表 1。含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD62tl)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度的比值大于90%时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌生长的最低的浓度)。表1几种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(ug/ml)的比较
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权利要求
1.一组抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为序列表中所示的SEQ ID No. 2。
2.权利要求1所述抗菌肽的在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染的药物中应用。
全文摘要
本发明提供一组新的抗菌肽，这些抗菌肽具有比天然抗菌肽更强的杀菌活性，对各种致病菌的杀灭效果都很好。本发明还公开了该组抗菌肽的制备方法，可以用固相化学法合成，也可以通过基因工程表达获得。本发明合成抗菌肽可以用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物。
文档编号C07K14/46GK102391370SQ20111035987
公开日2012年3月28日 申请日期2004年11月16日 优先权日2004年11月16日
发明者李国栋, 黄青山 申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司