本发明公开了一种大豆蛋白酶抑制剂的纯化方法。本发明的技术方案是将制得的蛋白酶抑制剂先用活性炭吸附除去较高分子量、未水解的大豆蛋白质及色素等物质，然后用超滤除去不溶底物、分子量较大的大豆蛋白质和肽类，获得合理的氨基酸和多肽，再用凝胶排阻色谱分离柱将混合物通过多孔的凝胶床而达到更好的分离效果。 此方法设备简单，重复性好，得到的大豆蛋白酶抑制剂回收率很高，活力不受破坏。
背景技术：
我国是世界大豆的生产国之一，栽培历史悠久，分布广，种植面积大，大豆年产约640万吨，约占世界总产量的10％，位居第三。我国大豆品种蛋白质含量高，籽粒中蛋白质含量可高达48％-50％。大豆作为一种重要的农作物，价格低廉，氨基酸含量平衡，是一种重要的优质植物蛋白资源，具有诸多的生理功能。但由于它的低溶解性、不易消化吸收，高浓度状态下粘度大等缺点限制了其应用于食品及医药等行业。
近代研究表明，人类摄入的蛋白质经消化酶作用后，不是像以前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽的形式吸收小分子肽具有良好的溶解性，人体消化时不被水解，而且可以直接被小肠绒毛上皮细胞快速吸收，并具有各种生理活性，人们称这类肽为生物活性肽。大豆多肽是指大豆蛋白质经酶水解、分离精制等过程而获得的通常由3～6个氨基酸组成的相对分子量低的低肽混合物，其水溶性很高(可溶性氮NSI约为99％)，可作为新的治疗药剂、功能食品添加剂或饲料添加剂来使用。大豆蛋白经酶水解分离精制等过程得到大豆多肽，含有组成与大豆蛋白完全一致的必需氨基酸，含量平衡且丰富，具有优于它的加工特性，如高溶解性，高稳定性，高吸湿保湿性，抗凝胶性，尤其是小分子肽吸收速度快，蛋白质利用率高等，同时还具有防病治病，调节人体生理功能，如具有易吸收和低过敏性、降低血脂和胆固醇、降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢、增强运动员体能，帮助恢复疲劳、促进钙磷和其他微量元素的吸收、促进大脑发育、提高记忆力增强免疫功能、保护表皮细胞、防止黑色素细胞沉淀等多种生物功能。大豆肽由于具有良好的溶解性和稳定性，可用于大多数的普通食品中；由于其具有各种生理活性，安全实用，无副作用，还可专用于营养疗效食品、功能保健食品和运动员食品等多类特种食品中。因此，大豆肽是一种十分有前途的功能性食品原料，应用范围广，市场开发潜力大，它以其独特的功能和特，性广泛应用在食品工业、医药、化妆品等领域，成为目前众多学者关注的课题。
但由于大豆蛋白酶水解产物是多肽混合物、AA等，不同肽段的生理功能是不同的，必须选用适当方法，从这些混合物中分离纯化出某些具有生物活性的大豆蛋白酶抑制剂，以满足人们的需要。因此探寻小分子大豆肽分离纯化方法具有十分重要意义。本发明的技术方案将制得的蛋白酶抑制剂先用活性炭吸附除去较高分子量、未水解的大豆蛋白质及色素等物质，然后用超滤除去不溶底物、分子量较大的大豆蛋白质和肽类，获得合理的氨基酸和多肽，再用凝胶排阻色谱分离柱将混合物通过多孔的凝胶床而达到更好的分离效果。 此方法设备简单，重复性好，得到的大豆蛋白酶抑制剂回收率很高，活力不受破坏。
技术实现要素：
本发明的目的是生产纯度较高的大豆蛋白酶抑制剂。
本发明的技术方案是：将制得的蛋白酶抑制剂先用活性炭吸附除去较高分子量、未水解的大豆蛋白质及色素等物质，然后用超滤除去不溶底物、分子量较大的大豆蛋白质和肽类，获得合理的氨基酸和多肽，再用凝胶排阻色谱分离柱将混合物通过多孔的凝胶床而达到更好的分离效果。 此方法设备简单，重复性好，得到的大豆蛋白酶抑制剂回收率很高，活力不受破坏。包括如下步骤：
（1）活性炭吸附脱色过程：将一定量的活性炭加入水解液，在40℃～60℃下搅拌1.5h～2.5h后过滤离心，去除活性炭。
（2）超滤：料液用4kDa～2kDa 的超滤膜于40℃～60℃， 0.lMPa～0.2MPa 对料液超滤30min～50min。
（3）凝胶排阻色谱分离
1)凝胶层析柱的制备
称取10gSephadex LH-20用250mL洗脱液在沸水浴中加热搅拌3h，加热过程中需不断补充洗脱液，静置过夜，充分溶涨，得到凝胶悬浮液。先在层析柱内加入约1／3柱高的洗脱液，关闭出口，在搅拌下将凝胶悬浮液G-50缓慢注入柱子中，待自然沉降1-2cm后，打开出口，继续加入凝胶悬浮液加到所需高度为止，并在胶面上加一片有机膜以保护胶面，最终柱体积为2*30cm。
2)上柱：将一定体积的大豆蛋白水解上清液以3.0ml／min速度通过交联羟丙基葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，用二次水洗脱，合并流出液。
（4）蛋白酶抑制剂的真空冷冻干燥：在真空度15～20mbar，制冷温度-45～-55℃下，分别对凝胶层析柱分离得到三酶水解混合肽进行真空冷冻约24～30h，便可得到大豆蛋白酶抑制剂 。
具体实施方式
将制得的蛋白酶抑制剂先用活性炭吸附除去较高分子量、未水解的大豆蛋白质及色素等物质，然后用超滤除去不溶底物、分子量较大的大豆蛋白质和肽类，获得合理的氨基酸和多肽，再用凝胶排阻色谱分离柱将混合物通过多孔的凝胶床而达到更好的分离效果。 此方法设备简单，重复性好，得到的大豆蛋白酶抑制剂回收率很高，活力不受破坏。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
（1）活性炭吸附脱色过程：将一定量的活性炭加入水解液，在40℃下搅拌1.5h后过滤离心，去除活性炭。
（2）超滤：料液用4kDa的超滤膜于40℃， 0.lMPa 对料液超滤30min。
（3）凝胶排阻色谱分离
1)凝胶层析柱的制备
称取10g Sephadex LH-20用250mL洗脱液在沸水浴中加热搅拌3h，加热过程中需不断补充洗脱液，静置过夜，充分溶涨，得到凝胶悬浮液。先在层析柱内加入约1／3柱高的洗脱液，关闭出口，在搅拌下将凝胶悬浮液G-50缓慢注入柱子中，待自然沉降1-2cm后，打开出口，继续加入凝胶悬浮液加到所需高度为止，并在胶面上加一片有机膜以保护胶面，最终柱体积为2*30cm。
2)上柱：将一定体积的大豆蛋白水解上清液以3.0ml／min速度通过交联羟丙基葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，用二次水洗脱，合并流出液。
（4）蛋白酶抑制剂的真空冷冻干燥：在真空度15mbar，制冷温度-45℃下，分别对凝胶层析柱分离得到三酶水解混合肽进行真空冷冻约25h，便可得到大豆蛋白酶抑制剂 。
实施例2
（1）活性炭吸附脱色过程：将一定量的活性炭加入水解液，在50℃下搅拌2h后过滤离心，去除活性炭。
（2）超滤：料液用3kDa 的超滤膜于50℃， 0.l5MPa 对料液超滤40min。
（3）凝胶排阻色谱分离
1)凝胶层析柱的制备
称取10g Sephadex LH-20用250mL洗脱液在沸水浴中加热搅拌3h，加热过程中需不断补充洗脱液，静置过夜，充分溶涨，得到凝胶悬浮液。先在层析柱内加入约1／3柱高的洗脱液，关闭出口，在搅拌下将凝胶悬浮液G-50缓慢注入柱子中，待自然沉降1-2cm后，打开出口，继续加入凝胶悬浮液加到所需高度为止，并在胶面上加一片有机膜以保护胶面，最终柱体积为2*30cm。
2)上柱：将一定体积的大豆蛋白水解上清液以3.0ml／min速度通过交联羟丙基葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，用二次水洗脱，合并流出液。
（4）蛋白酶抑制剂的真空冷冻干燥：在真空度18mbar，制冷温-50℃下，分别对凝胶层析柱分离得到三酶水解混合肽进行真空冷冻约28h，便可得到大豆蛋白酶抑制剂 。
实施例3
（1）活性炭吸附脱色过程：将一定量的活性炭加入水解液，在 60℃下搅拌 2.5h后过滤离心，去除活性炭。
（2）超滤：料液用 2kDa 的超滤膜于 60℃， 0.2MPa 对料液超滤 50min 。
（3）凝胶排阻色谱分离
1)凝胶层析柱的制备
称取10gSephadex LH-20用250mL洗脱液在沸水浴中加热搅拌3h，加热过程中需不断补充洗脱液，静置过夜，充分溶涨，得到凝胶悬浮液。先在层析柱内加入约1／3柱高的洗脱液，关闭出口，在搅拌下将凝胶悬浮液G-50缓慢注入柱子中，待自然沉降1-2cm后，打开出口，继续加入凝胶悬浮液加到所需高度为止，并在胶面上加一片有机膜以保护胶面，最终柱体积为2*30cm。
2)上柱：将一定体积的大豆蛋白水解上清液以3.0ml／min速度通过交联羟丙基葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，用二次水洗脱，合并流出液。
（4）蛋白酶抑制剂的真空冷冻干燥：在真空度 20mbar，制冷温度 -55℃下，分别对凝胶层析柱分离得到三酶水解混合肽进行真空冷冻约30h，便可得到大豆蛋白酶抑制剂 。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。