1片茚-2-基氨基）-7, 8-二氢吡啶并[4, 3-d]嘧 啶-6 (5功-基]-3-氧代丙基}氨基甲酸叔丁酯的合成
方案AA，步骤A.将1_(3_二甲基氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（2.69克；1.5当 量；14. 06毫摩尔)添加到含有在二氯甲烷（30毫升)中的3-(叔丁氧基羰基氨基）丙酸（1. 8 克；1. 0当量；9. 37毫摩尔)、N-茚满-2-基-5, 6, 7, 8-四氢吡啶并[4, 3-d]嘧啶-2-胺（2. 50 克；1.0当量；9. 37毫摩尔)和N，N-二甲基-4-氨基吡啶（0.229克；0.2当量；1.87毫摩尔） 的烧瓶中。将该混合物搅拌2小时，然后将该溶液直接加载到硅胶柱上并通过柱色谱法（30 至100%乙酸乙酯/二氯甲烷)提纯以产生无色泡沫形式的{3- [2- (2, 3-二氢-1片茚-2-基 氨基）-7, 8-二氢吡啶并[4, 3-d]嘧啶-6 (5功-基]-3-氧代丙基}氨基甲酸叔丁酯（3. 42 克；83%) :MS(m/z) : 438(M+1)。
[0120] 制备 48 3-氨基-1-[2_(2, 3-二氢-1//萌-2-基氨基）_7, 8-二氢吡啶并[4, 3_d]喃 啶-6 (5功-基]丙-1-酮的合成
方案AA,步骤B.将三氟乙酸（1毫升）添加到{3-L2-(2,3-二氢-1炉茚-2-基氨 基）_7, 8-二氢吡啶并[4, 3-d]嘧啶-6(5功-基]-3-氧代丙基}氨基甲酸叔丁酯（0. 19 克；1. 0当量；0. 44毫摩尔）在二氯甲烷（1毫升）中的溶液中并搅拌16小时。浓缩该混 合物，然后将残留物在二氯甲烷和IN氢氧化钠之间分配。分离各层并用二氯甲烷进一步 萃取水层。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供所需3-氨 基-l-[2-(2,3-二氢-1片茚-2-基氨基）-7,8_二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5功-基] 丙-1-酮（0? 145 克；98%) :MS(m/z) : 338 (M+1)。
[0121]实施例25 片{3-[2-(2,3_二氢-1片茚-2-基氨基）-7,8_二氢吡啶并[4,3-d]嘧 啶-6 (5功-基]-3-氧代丙基} -2- (1片咪唑-1-基）乙酰胺的合成
方案AA，步骤C.将1_(3_二甲基氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（0. 124克；1. 5 当量；〇. 65毫摩尔）添加到2-咪唑-1-基乙酸（0. 060克；1. 1当量；0. 47毫摩尔）、3_氨 基-l-[2-(2,3-二氢-1片茚-2-基氨基）-7,8_二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5功-基] 丙-1-酮（0. 145克；1.0当量；0.43毫摩尔）和N，N-二甲基-4-氨基吡啶（0.0105克； 0. 2当量；0. 086毫摩尔）在二氯甲烷（1. 43毫升）中的溶液中。将所得溶液搅拌16小时。 将该溶液直接加载到硅胶柱上并通过柱色谱法（0至10%甲醇/二氯甲烷）提纯以提供 白色固体形式的//~{3-[2-(2, 3-二氢-1//萌-2-基氨基）_7, 8-二氢P比啶并[4, 3_d]喃 啶-6 (5功-基]-3-氧代丙基}-2-(1片咪唑-1-基）乙酰胺（0.094克；49%):MS(m/z): 446(M+1)〇
[0122」 p」食分y
1-苄基-5-羟基-1炉1，2, 3-三唑-4-甲酸乙酯的合成
方案BB，步骤A.将丙二酸二乙酯（7. 16毫升；1.3当量；46. 67毫摩尔），接着碳酸钾 (19. 85克；4当量；143. 60晕摩尔）添加到苄基叠氮（4. 5毫升；1. 0当量；35. 90晕摩尔）在 二甲亚砜（36毫升)中的溶液中并将所得溶液在40°C下加热16小时。加入5N盐酸直至pH =1，然后过滤所得沉淀物。用水洗涤该沉淀物并干燥以提供白色固体形式的1-苄基-5-羟 基-1炉1,2, 3-三唑-4-甲酸酯（5. 65 克；64%):MS(m/z): 248 (M+1)。
[0123]制备 50 1-苄基-5-羟基-1炉1，2, 3-三唑-4-甲酸的合成
方案BB，步骤B.将1-苄基-5-羟基-1炉1，2, 3-三唑-4-甲酸酯（1. 46克；1. 0当 量；5. 90毫摩尔）和氢氧化钠（IN;10. 00毫升；1. 7当量；10. 00毫摩尔）的90 °C溶液搅 拌9小时。加入1N盐酸直至pH为2,然后过滤该反应并干燥滤饼以提供1-苄基-5-羟 基-1炉1,2, 3-三唑-4-甲酸（1.15 克；89%):MS(m/z): 220 (M+1)。
[0124]制备 51 1-苄基-1片1，2, 3-三唑-5-醇的合成
方案BB，步骤C.将1-苄基-5-羟基-1炉1，2, 3-三唑-4-甲酸（1.25克；1.0当量； 5. 70毫摩尔）在二甲基甲酰胺（2毫升）中的溶液置于预热至125°C的反应块中并加热2分 钟。使该反应冷却至室温并立即将该1-苄基-1片1，2, 3-三唑-5-醇用于下一步骤：MS(m/ z): 176(M+l)〇
[0125]制备 52 4-[(l_苄基-1片1，2,3-三唑-5-基）氧基]丁酸甲酯的合成
方案BB,步骤D.将4-溴丁酸甲酯（1.48毫升；2.0当量；11. 42毫摩尔）添加到1-苄 基-1片1，2, 3-三唑-5-醇（1. 0克；1. 0当量；5. 71毫摩尔）和碳酸钾（1. 59克；2. 0当量； 11. 42毫摩尔）在二甲基甲酰胺（2毫升）中的溶液中。将该反应在50°C下加热1小时，然 后冷却至环境温度并搅拌16小时。用乙酸乙酯和水稀释该反应。分离各层并用乙酸乙酯 进一步萃取水层。用水洗涤合并的有机萃取物（3x)，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱 色谱法（0至50%乙酸乙酯/二氯甲烷）提纯该粗产物以提供4-[(1-苄基-1片1，2, 3-三 唑-5-基）氧基]丁酸甲酯（0.506 克；32%):MS(m/z): 276 (M+1)。
[0126]制备 53 4-(2H-三唑-4-基氧基）丁酸甲酯的合成
方案BB，步骤E.将5滴浓盐酸添加到4-[(1-苄基-1炉1，2, 3-三唑-5-基）氧基] 丁酸甲酯（〇. 50克；1. 0当量；1. 82毫摩尔）和10%碳载钯（0. 05克；0. 025当量；0. 047毫 摩尔)在乙醇（7毫升）中的不均匀溶液中。排气并用氮气（3x)，然后氢气（3x)回填，并将反 应混合物在50psi氢气下剧烈搅拌16小时。过滤该内容物并浓缩滤液以提供4-(2H-三 唑-4-基氧基）丁酸甲酯（0.335 克；99%)。MS(m/z): 184(M-1)。
[0127] 制备 54 4-(2片三唑-4-基氧基）丁酸的合成
方案BB，步骤F.将1N氢氧化钠（2. 32毫升；2. 0当量；2. 32毫摩尔)添加到4- (2H-三 唑-4-基氧基）丁酸甲酯（0. 215克；1. 0当量；1. 16毫摩尔）在乙醇（1毫升）中的溶液中 并将该混合物加热至60°C16小时。加入1N盐酸（2. 32毫升；2. 0当量；2. 32毫摩尔）并 浓缩以提供4-(2片三唑-4-基氧基）丁酸（0.20克；100%)。不经进一步提纯即用于下一 步骤：MS(m/z): 170(M-1)。
[0128] 实施例26 1-[2_(2, 3-二氢-1//萌-2-基氨基）_5, 7-二氢P比略并[3, 4_d]喃 啶-6-基]-4-(1片1，2, 3-三唑-5-基氧基）丁 -1-酮的合成
方案BB，步骤G.将1_(3_二甲基氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（0. 168 克；1.5当量；0.88毫摩尔）和二异丙基乙胺（0.41毫升；4当量；2. 34毫摩尔）添加 到4-(2炉三唑-4-基氧基）丁酸（0? 1克；1. 0当量；0? 58毫摩尔）和N-(2, 3-二 氢-1片茚-2-基）-6, 7-二氢-5片吡咯并[3, 4-d]嘧啶-2-胺二盐酸盐水合物（0. 201克； 1. 0当量；0. 58毫摩尔)和N，N-二甲基-4-氨基吡啶（0. 014克；0. 2当量；0. 12毫摩尔)在二 氯甲烷（5. 8毫升)中的溶液中。将该反应搅拌2小时，然后将反应混合物直接加载到硅胶柱 上。通过柱色谱法（10%(2N氨/甲醇)/乙酸乙醋)提纯以提供白色固体形式的1-[2-(2,3_二 氢-1片茚-2-基氨基）-5, 7-二氢-6片吡咯并[3, 4-d]嘧啶-6-基]-4-(1片1，2, 3-三 唑-5-基氧基）丁 -1-酮（0? 104 克；44%) :MS(m/z) : 406 (M+1)。
[0129] 通过胆碱释放测得的autotaxin的抑制 这一试验的目的是使用胆碱释放试验检测autotaxin抑制。
[0130] 受试化合物(在100%DMS0中的10mM储液)在100%DMS0中连续稀释以在半区96 孔板（Corning3992)中产生10个浓度的100X抑制剂。在100%DMS0中的这10个孔各自 在圆底96孔板（Fisher12565502)中在测定缓冲液中稀释1:33. 33,以在含有3%DMS0的 孔中产生 3X浓度。该测定缓冲液是 50mMTrispH8. 0、5mMKC1、1mMCaCl2、lmMMgCl2、 0.01%TRITON?X-100(SigmaT9284)和 0.01%脂肪酸游离牛血清白蛋白（SigmaA8806)。 然后将各3X受试化合物的20微升等分试样一式一份（insinglicate)添加到黑色平底96 孔板（Corning3991)中。然后将3X重组人autotaxin(转染到293E细胞中并通过镍螯合物 和尺寸排阻色谱法提纯的具有C端His标签的全长人autotaxin)的每孔20微升等分试样 添加到除无酶对照孔外的每一孔中。将每孔20微升的测定缓冲液等分试样添加到无酶对 照孔中。在避光的同时将含有胆碱氧化酶（SigmaC5896)、辣根过氧化物酶（SigmaP8125)、 amplexultrared(InvitrogenA36006)和autotaxin底物溶血磷脂酰胆喊（LPC) 16:0 (AvantiPolarLipids855675P)的3X混合物（cocktail)的20微升等分试样添加到各孔 中。胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、amplexultrared和LPC16:0在孔中的最终浓度分别为 0.4单位/毫升、4单位/毫升、40yM和30yM。然后将该板用铝箔封条密封并在Labline ImperialIII孵育器中在37°C下孵育1小时。在该孵育过程中，LPC被autotaxin裂解以 产生溶血磷脂酸（LPA)16:0和胆碱。释放的胆碱被胆碱氧化酶氧化以产生甜菜碱和过氧化 氢。过氧化氢与辣根过氧化物和amplexultrared反应形成焚光分子试齒灵（resorufin)。 用SpectraMaxGeminiEM焚光计使用SoftMaxPro4. 8软件在530-590纳米激发-发射 波长下测定板上的试卤灵。借助内部Lilly软件0L0曲线拟合工具，使用4参数曲线拟合 计算IC5(ls。结果表示为算数平均值+/-标准偏差；n=x。本文中的实施例1-15的化合物基 本如上所述测试并表现出低于大约100nM的对autotaxin的IC5(I。下面例举的化合物基本 如上所述测试并表现出对autotaxin的下列活性： 表1:autotaxin的抑制?日日喊経协试胳
[0131] 表1中的数据表明农1的化甘物在怀外胆顺粹取试验中抑制autotaxin。
[0132] 在人血浆存在下的LPA的降低 下列试验旨在测量LPA的降低。当其用于测试已被识别为autotaxin抑制剂的化合 物时，这一试验是可用于识别选择性autotaxin-介导的LPA抑制剂化合物的工具。经由 autotaxin生物合成LPA被认为对LPAi介导的神经性疼痛而言是LPA来源。MakotoInoue 等人，"Autotaxin,asyntheticenzymeoflysophosphatidicacid(LPA),mediates theinductionofnerve-injuredneuropathicpainy,,MolecularPain, 2008, 4:6〇 通过这一试验的结果证实autotaxin介导的LPA生物合成的祀向抑制。
[0133] 将收集在肝素钠（LampireBiologicals)中的来自健康人类女性捐献者的血衆单 元汇集、等分并储存在-80°C。在试验当天，将血浆等分试样解冻并在离心机中在4°C下以 3000RPMs旋转10分钟以除去碎肩。将90微升血浆等分试样添加到96孔圆底聚丙烯板 的各孔中。将含有 10%DMS0/测定缓冲液（50mMTrispH8.0、5mMKC1、1mMCaCl2、lmM MgCl2)的10X受试化合物的10微升等分试样添加到除不含受试化合物的对照孔外的各孔 中。这一式一份地产生10个IX受试化合物浓度，最终浓度为1%DMS0在90%血浆中。将无 受试化合物的10%DMS0/测定缓冲液的10微升等分试样添加到0小时（n=8)和3小时无受 试化合物对照（n=8)孔中。将500mM乙二胺四乙酸（EDTA)的10微升等分试样添加到各0 小时无受试化合物对照孔中以螯合内源性autotaxin。将0小时无受试化合物对照孔的整 个内容物转移到新的96孔圆底聚丙烯板中并冷冻在-80°C下。然后将含有血浆+/_受试化 合物(减去0小时无抑制剂对照孔)的板在RobbinsScientific? 400型杂交孵育器中在以 14, 000RPMs摇动的同时在37°C下孵育3小时。在该3小时孵育过程中，血浆中存在的卵磷 脂胆固醇酰基转移酶裂解磷脂酰胆碱以造成autotaxin底物溶血磷脂酰胆碱（LPC)的更高 血浆水平。通过内源性autotaxin裂解该提高的内源性LPC水平，以造成内源性溶血磷脂酸 (LPA)的更高血衆浓度（Nakamura等人，ClinicalBiochemistry40 (2007)，274-277)。 可通过autotaxin抑制剂抑制LPA在3小时孵育中的这种提高。在3小时孵育后，将10微 升500mMEDTA添加到所有其余孔(含受试化合物的孔和3小时无受试化合物对照孔)中以 螯合内源性autotaxin。然后将这些孔的整个内容物添加到之前已储存在-80°C下的含有 〇小时无受试化合物对照血浆(没有解冻该〇小时血浆)的板中。然后将该板用铝箔封条再 覆盖并放回_80°C直至取出进行质谱分析。在取出当天，将该板在冰上解冻并将来自各孔的 25微升血衆转移到2毫升TrueTaper?正方形96深孔板（AnalyticalSalesandProducts #968820)中。将含有LPA内标（50ng/mlD5 氘LPA16:0 和 50ng/mlD5 氘LPA18:0)的 提取缓冲液（50%甲醇、49. 9%乙腈、0. 1%乙酸）的400微升等分试样添加到各孔中，并通过 质谱分析测定各样品中的总LPA。根据下列公式计算LPA的降低百分比： 100 - (3小时血浆+受试化合物-0小时无受试化合物的血浆对照物）/ (3小时 无受试化合物的血浆对照物-0小时无受试化合物的血浆对照物）X100。
[0134] 使用4参数曲线拟合计算IC5Q值。结果表示为算数平均值+/_标准偏差；n=x。使 用本发明的化合物的这一试验的结果表明剂量依赖性并且统计显著的LPA降低。
[0135] 表2:人血浆中的LPA的降低
[0136] 表2中的数据证实，该化合物在人血浆存在下降低LPA。结果证实该化合物抑制 autotaxin介导的LPA生物合成。
【主权项】
1. 式I的化合物或其可药用盐： 其中X是键或CH2;R选自R1和R2各自独立地选自CH和N ; R3是 H 或 CH 3; R4是 H 或 CH 3; L 选自-O (CH2) 3_、-C (O) NH (CH2) 2_、-CH2C (O) NH (CH2) 2_、- (CH2) 3N (C (O) CH3) CH2-、- (CH2) 2N(C (0) CH3) CH2-、- (CH2) 3NH-、（CH2) 20CH2-、_ (CH2) 4-、_ (CH2) 2NHCH2-、_ (CH2) 30-和 -CH2O (CH2)2-O2. 根据权利要求1的化合物或盐，其中R是3. 根据权利要求2的化合物或盐，其中R 1是CH。4. 根据权利要求2或3任一项的化合物或盐，其中R2是N。5. 根据权利要求1至4任一项的化合物或盐，其中L选自-(CH2) 4-、-0 (CH2) 3-、_ (CH2) 20 CH2-、- (CH2) 30_ 和-CH2O (CH2) 2_ 〇6. 根据权利要求5的化合物或盐，其中L是-(CH2)20CH2-。7. 根据权利要求5的化合物或盐，其中L是-O(CH2) 3_。8. 根据权利要求1至3任一项的化合物或盐，其中L选自-(CH2)2N(C(O)CH3) CH2-、- (CH2) 3N (C (0) CH3) CH2-和-CH2C (0) NH (CH2) 2_。9. 根据权利要求1至8任一项的化合物或盐，其中X是键。10. 根据权利要求1至8任一项的化合物或盐，其中X是CH 2。11. 根据权利要求1的化合物或盐，其是1-[2- (2, 3-二氢-1 萌_2_基氨基）-7, 8-二 氢吡啶并[4, 3-d]嘧啶-6 (5功-基]-2-[2-(1斤1，2, 3-三唑-4-基）乙氧基]乙酮12. 根据权利要求1的化合物或盐，其是1- [2- (2, 3-二氢-1片茚-2-基氨基）-5, 7-二 氢-6片吡咯并[3, 4-d]嘧啶-6-基]-2-[2-(1片1，2, 3-三唑-4-基）乙氧基]乙酮13. 药物组合物，其包含根据权利要求1至12任一项的化合物或其可药用盐以及一种 或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。14. 治疗患者的疼痛的方法，其包括给予需要其的患者有效量的根据权利要求1至12 任一项的化合物或其可药用盐。15. 治疗患者的与骨关节炎相关的疼痛的方法，其包括给予需要其的患者有效量的根 据权利要求1至12任一项的化合物或其可药用盐。16. 根据权利要求1至12任一项的化合物或其可药用盐，用于治疗。17. 根据权利要求1至12任一项的化合物或其可药用盐，用于治疗疼痛。18. 下式的中间体化合物：19. 下式的中间体化合物：
【专利摘要】本发明提供式I的化合物、其可药用盐：其中X是键或CH2；R选自和；R1和R2各自独立地选自CH和N；R3是H或CH3；R4是H或CH3；L选自-O(CH2)3-、-C(O)NH(CH2)2-、-CH2C(O)NH(CH2)2-、-(CH2)3N(C(O)CH3)CH2-、-(CH2)2N(C(O)CH3)CH2-、-(CH2)3NH-、(CH2)2OCH2-、-(CH2)4-、-(CH2)2NHCH2-、-(CH2)3O-和-CH2O(CH2)2-。本发明的化合物是autotaxin抑制剂。
【IPC分类】A61P29/00, C07D471/04, C07D487/04, A61K31/5025
【公开号】CN104903327
【申请号】CN201480004482
【发明人】T.J.博尚, 稻茵, S.B.琼斯, B.H.诺尔曼, L.A.普菲菲尔
【申请人】伊莱利利公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月7日
【公告号】CA2893253A1, EP2943494A1, US8969555, US20140200231, WO2014110000A1