因； 所述的a -淀粉酶启动子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，麦芽寡糖基海藻糖 合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；麦芽寡糖基海 藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。2. 权利要求1所述重组质粒载体的制备方法，其特征在于，步骤如下： (i) 以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到PHT片段； 所述的PCR引物序列如下： PHT-up:5 ' -ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3 ' PHT-down:5 ' -CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3 ' 所述的PCR扩增体系为50 y 1 : 2XTaq PCR MasterMix 25 yl，IOy mol/L 引物 PHT-up 2.5 yl，IOy mol/L 引物 PHT-down 2. 5 y 1，模板 2. 5 y 1，用 ddH20 补足 50 y I ; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;95°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，30 个循环；72°C 延伸10min，-20°C保存； (ii) 提取B. amyloliquefaciens菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到PamyQ 片段； 所述的PCR引物序列如下： PamyQ-up:5 ' -TTTTATCTTATCACGCCCCGCACATACGAA-3 ' PamyQ-down:5 ' -TTCCTCCTTTAATTGGGAAGCACAAGTCTGAACGAAA-3 ' 所述的PCR扩增体系为50 y 1 : 2XTaq PCR MasterMix 25 y 1，10 ymol/L 引物 PamyQ-up 2.5 y 1，10 ymol/L 引物 PamyQ-down 2. 5 y I，模板 2. 5 y I，用 ddH20 补足 50 y I ; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;95°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，30 个循环；72°C 延伸10min，-20°C保存； (iii) 以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到SamyQ片段； 所述的PCR引物序列如下： SamyQ-up:5 ' -GTGAGCGGATAACAATTCCCAATTAAAGGAGGAAGG-3， SamyQ-down:5 ' -GGATCCTACGGCTGATGTTTTTGT-3 ' 所述的PCR扩增体系为50 y 1 : 2XTaq PCR MasterMix 25 y 1，10 ymol/L 引物 SamyQ-up 2.5 y 1，10 ymol/L 引物 SamyQ-down 2. 5 y I，模板 2. 5 y I，用 ddH20 补足 50 y I ; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;95°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，30 个循环；72°C 延伸10min，-20°C保存； (iv) 将步骤⑴制得的PHT片段与步骤（ii)制得的PamyQ片段进行重叠PCR，制得 PHT-PamyQ 片段； 所述的重叠PCR的初次扩增体系为25 y I : PHT 片段 4 y I ;PamyQ 片段 4 y I ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y I ;ddH20 4. 5 y 1 ; 所述的重叠PCR的初次扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，5 个循环；72°C延 伸 2min ; 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25 y I : 上游引物 PHT-up 2ul ;下游引物 PamyQ-down 2ul ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y I ；ddH20 8. 5 y I ； 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，30 个循环；72°C 延伸lOmin，-20°C保存； (V)将步骤（ii)制得的PamyQ片段与步骤（iii)制得的SamyQ片段进行重叠PCR，制 得 PamyQ-SamyQ 片段； 所述的重叠PCR的初次扩增体系为25 y 1 : PamyQ 片段 4 y I ;SamyQ 片段 4 y I ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y I ;ddH20 4. 5 y 1 ; 所述的重叠PCR的初次扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，5 个循环；72°C延 伸 2min ; 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25 y I : 上游引物 PamyQ-up 2 U 1 ;下游引物 SamyQ-down 2 y I ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y I ；ddH20 8. 5 y I ； 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，30 个循环；72°C 延伸lOmin，-20°C保存； (vi)将步骤（iv)制得的PHT-PamyQ片段与步骤（V)制得的PamyQ-SamyQ片段进行重 叠 PCR，制得 PHT-PamyQ-SamyQ 片段； 所述的重叠PCR的初次扩增体系为25 y 1 : PHT-PamyQ片段4 y I !PamyQ-SamyQ片段4 y I ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y I ;ddH20 4. 5 y I ； 所述的重叠PCR的初次扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，5 个循环；72°C延 伸 2min ; 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25 y I : 上游引物 PHT-up 2ul ;下游引物 SamyQ-down 2ul ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y I ；ddH20 8. 5 y I ； 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，30 个循环；72°C延 伸 lOmin，-20°C保存； (vii) 将步骤（vi)制得的 PHT-PamyQ-SamyQ 片段连接到 pTOPO-T vector 上，制得PTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ ;然后用限制性内切酶KpnI和BamHI对 PTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ和PHT43进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒 PamyQ-PHT43； (viii) 以Arthrobacter nicotinovorans基因组DNA为模板，分别设计扩增麦芽寡糖 基海藻糖合成酶TreY的引物Fl和Rl、扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶TreZ的引物F2和R2 ; Fl: 5 ' -GGATCCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC-3 ' R15' -CCTCGGGGGTGAACGTGC-3' F2:5 ' -ATGAGTTCGCCATTCGAGGT-3 ' R2:5 ' -GACGTCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG-3， 以Arthrobacter nicotinovorans基因组为模板，Fl和Rl为引物，通过PCR过程获得 产物TreY ; 所述PCR体系为50yl : 2XHiFi-PCR master 25yl;上游引物F12.5yl;下游引物 R12.5yl;模板 2.5yl; ddH20 17. 5 y I ； 所述PCR程序如下： 95°C变性 5min ;95°C变性 30sec，54°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 个循环；72°C 延伸lOmin，-20°C保存； (ix) 以Arthrobacter nicotinovorans基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR过程 获得产物TreZ ; 所述PCR体系为50yl : 2XHiFi-PCR master 25yl;上游引物F12.5yl;下游引物 R12.5yl;模板 2.5yl; ddH20 17. 5 y I ； 所述PCR程序如下： 95°C变性 5min ;95°C变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C延伸 2min，共 30 个循环；72°C延 伸 lOmin，-20°C保存； (X)将获得的产物1和产物2通过重叠PCR方法实现两基因间的拼接，得到产物 TreY-TreZ ； 所述的重叠PCR的初次扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，5 个循环； 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25 y I : 上游引物 F12 y 1 ;下游引物 R22 y I ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y I ;ddH20 8. 5 y 1 ; 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下： 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，30 个循环；72°C延 伸 lOmin，-20°C保存； (xi)将TreY-TreZ基因片段连接至pZERO-Blunt载体上，制得重组质粒 PZERO-TreY-TreZ ;用限制性内切酶BamHI和AatII对重组质粒pZERO-TreY-TreZ和步骤 (vii)制得的重组质粒PamyQ-PHT43进行双酶切，用T4连接酶进行连接，制得重组质粒 PamyQ-PHT43-TreY-TreZ〇3. -种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将权利要求1所述重组质粒 PamyQ-PHT43-TreY-TreZ转化枯草芽孢杆菌获得。4. 如权利要求3所述的淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆 菌为枯草芽孢杆菌WB800n。5. 权利要求3所述淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤如下： 将感受态细胞在2500V、25uF的条件下电击转化，氯霉素筛选，即得。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氯霉素筛选步骤如下： 在含有氯霉素抗生素的平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有氯霉素 的液体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有氯霉素抗生素的LB培养基上生长的菌液进 行PCR验证，将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证， 含有目的条带的，即得； 含有氯霉素的液体LB培养基，每升组分如下： IOg蛋白胨、IOg NaCl、5g酵母浸粉、5mg氯霉素。7. 权利要求3所述的淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌在制备海藻糖合成酶中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用。该淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌含有重组载体，重组载体为在PHT43质粒的BamHI酶切位点前通过连续三次重叠PCR方式将Pgrac启动子替换成α-淀粉酶启动子PamyQ，然后在BamHI酶切位点后插入麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因。本发明所用的α-淀粉酶启动子和淀粉酶信号肽与表达基因麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因结合时，淀粉诱导其表达效果优于其它诱导型表达效果。
【IPC分类】C12R1/125, C12N9/90, C12N15/63, C12N15/75, C12N1/21, C12N15/66
【公开号】CN105039374
【申请号】CN201510486544
【发明人】王腾飞, 王瑞明, 刘强
【申请人】齐鲁工业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月10日