r>[0050] (3)具有简单、方便、快速、灵敏的优点，仅需90分钟即可得到准确结果，易于在临 床开展；
[0051] (4)分2管进行PCR反应能检测6种K-Ras突变基因，操作简单、经济高效、可进行高 通量样本检测；
[0052] (5)血液样本具有取材简便，减少了检测样本获取的困难度。
【附图说明】：
[0053] 图1显示试剂盒质控品在扩增试剂A和B中的扩增曲线；
[0054] 图2显示野生型在扩增试剂A中的扩增曲线；
[0055] 图3显示野生型在扩增试剂B中的扩增曲线。
【具体实施方式】：
[0056] 图1显示试剂盒质控品在扩增试剂A和B中的扩增曲线，其中，横坐标为PCR循环数， 纵坐标为荧光值；
[0057]图2显示野生型在扩增试剂A中的扩增曲线，其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为 荧光值；
[0058]图3显示野生型在扩增试剂B中的扩增曲线，其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为 荧光值。
[0059] 下面结合具体实施例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
[0060] (1)引物探针的设计
[0061] 根据Cosmic数据提供的K-Ras基因12密码子的野生型基因序列及6种突变基因序 列，进行序列分析;利用分子生物学软件包primer express进行引物探针辅助设计，Blast 分析验证所设计引物的特异性，同时设计好的引物和探针在NCBI的dSNP库中进行比对，验 证在序列中是否存在SNP位点。引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
[0062] (2)ARMS_PCR反应体系的配置
[0063]利用步骤（1)中设计的引物探针进行PCR反应液的配制，具体的反应体系如下表1 所示：
[0064] 表1扩增试剂反应体系
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] (3)血液样本基因组DNA抽提
[0069]采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提 肿瘤患者血液样本DNA，按照试剂盒说明书进行操作。DNA提取后，取样2yL，用0.5 %琼脂糖 凝胶电泳检测基因组DNA的质量，再用紫外分光光度计检测纯度和浓度，以灭菌纯化水调整 终浓度为25ng/yL。
[0070] ⑷加样
[0071]分别向准备好PCR反应液的PCR反应管中加入已提取样本的DNA提取液5yL，盖紧管 盖如有气泡，可用手指弹击，去除气泡。2000转/分钟离心30秒至管壁无明显液珠。
[0072] (5)PCR 扩增
[0073] 将PCR管放入ABI7500扩增仪样品槽，按对应顺序设置待检样本、空白样本。
[0074] 每个样品选择?六1、1?(^、冊乂、0￥54个通道。参比荧光(？388丨￥6 1^€6^1^6)设置为 none。其PCR反应程序如下表2所示：
[0075] 表2 PCR扩增程序
[0076]
[0077]
[0080] 将Baseline设为3-15(根据实际情况，Baseline Cycler可在一定范围内变化），焚 光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线）的 最高点，且Ct值显示为undet。对FAM、HEX、R0X和CY54个通道分别进行观察曲线的形状和记 录Ct值。
[0081 ]质控对照：阴性对照在2种PCR反应管的4个通道Ct值均显示Undet;阳性对照在4种 PCR反应管的4个通道均Ct < 32;样本内对照野生型在扩增试剂A和B的CY5荧光通道Ct < 40。 同时符合以上三个条件，此反应视为有效。
[0082] 判断：一种以上PCR扩增试剂中Ct值< 37判定为检测到相应突变体;37〈Ct < 40时， 重复检测一次，仍为37〈Ct < 40的判定为检测到相应突变体，否则为没有检测到突变体;Ct> 40或显示为Undet，判定结果为没有检测到突变体。4种不同荧光探针标记在2种PCR扩增试 剂中检测的靶基因见表3所示：
[0083]表3 4种不同荧光探针标记在2种PCR扩增试剂中检测的靶基因 [0084] _5]~以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术^ 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
【主权项】
1. 一种用于检测κ-ras基因突变的引物、探针，其特征在于:其引物探针序列如下： (1) 12GGT>GAT置换突变的引物探针信息： 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 ' 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 ' 探针PI: 5 ' -FAM-ACTAGTTGGAGCTGATC-BHQ-3， (2) 12GGT>AGT置换突变的引物探针信息： 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 ' 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 ' 探针P2:5 ' -HEX-ACTAGTTGGAGCTGATGC-BHQ-3 ' (3) 12GGT>GTT置换突变的引物探针信息： 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 ' 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 ' 探针P3:5 ' -R0X-ACTAGTTGGAGCTGGTTC-BHQ-3 ' (4) 12GGT>GCT置换突变的引物探针信息： 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 ' 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 ' 探针P4:5 ' -FAM-ACTAGTTGGAGCTGGCTC-BHQ-3 ' (5) 12GGT>TGT置换突变的引物探针信息： 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 ' 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 ' 探针P5:5 ' -HEX-ACTAGTTGGAGCTGTGTC-BHQ-3 ' (6) 12GGT>CGT置换突变的引物探针信息： 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 ' 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 ' 探针P6:5 ' -R0X-ACTAGTTGGAGCTGCGTC-BHQ-3 ' (7) 野生型的引物探针信息： 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 ' 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 ' 探针P7:5 ' -CY5-ACTAGTTGGAGCTGGGTC-BHQ-3 '。2. 根据权利要求1中所述的一种用于检测K-ras基因突变的引物、探针，其特征在于:利 用权利要求1中所述的引物、探针检测K-ras基因突变的检测方法:采用AMRS-PCR法检测K-ras基因突变情况:利用设计的特异性引物探针配置PCR反应液，加入人血液样本中提取的 DNA，通过荧光实时定量PCR仪检测K-ras基因12密码子2155位GGT碱基突变为GAT、AGT、GTT、 GCT、TGT、CGT〇3. 根据权利要求2中所述的一种用于检测K-ras基因突变的引物、探针，其特征在于:鉴 定K-ras密码子12突变情况方法，它是使用上述引物、探针鉴定K-ras密码子12突变情况，包 括如下步骤： (1) 引物探针的设计； (2) 配置ARMS-PCR反应体系； (3) 肿瘤患者血液样本基因组DNA抽提； (4) 利用步骤（1)特异引物对突变靶序列进行PCR扩增放大，利用探针对扩增产物进行 检测； (5) 结果分析。
【专利摘要】一种用于检测K-ras基因突变的引物、探针及检测方法，采用AMRS-PCR法检测K-ras基因突变情况：利用设计的特异性引物探针配置PCR反应液，加入人血液样本中提取的DNA，通过荧光实时定量PCR仪检测K-ras基因12密码子2155位GGT碱基突变为GAT、AGT、GTT、GCT、TGT、CGT。本发明具有更高特异性和灵敏度，可检测出样品中含量低至0.1-1.0％突变基因；结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物后处理，能最大程度地避免交叉污染和环境污染；具有简单、方便、快速、灵敏的优点，仅需90分钟即可得到准确结果，易于在临床开展；分2管进行PCR反应能检测6种K-Ras突变基因，操作简单、经济高效、可进行高通量样本检测；血液样本具有取材简便，减少了检测样本获取的困难度。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105441535
【申请号】CN201510534767
【发明人】宋冬梅, 刘代新, 何胜祥, 李昂
【申请人】安徽同科生物科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年8月25日