专利名称：松材线虫pcr检测特异引物对的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域。具体来说，提供了利用PCR技术快速检测松材线虫的引物对A与引物对B，适合于林业部门、外检部门、森林保护研究机构应用。
背景技术：
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是一种引起松树毁灭性传染病害的病原。从松树感病到死亡仅仅需要2-3个月时间。因其危害严重且防治非常困难而被世界上许多国家列为检疫对象。目前，松材线虫病在世界上的分布区有北美洲的美国、加拿大和墨西哥，亚洲的日本、韩国和中国，以及欧洲的葡萄牙等七个国家。在北美洲三个国家，松材线虫并未造成松树的严重危害。然而，在亚洲该病引起大量的松树死亡。我国于1982年在南京首次发现松材线虫病。二十多年来，该病相继在江苏、安徽、浙江、广东、山东、台湾、香港等多省(区)发生，面积达8.7万hm2，累计枯死松树3500万株，直接经济损失25亿元，间接经济损失达250亿元。松材线虫病已对我国松林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏。近几年松材线虫病在我国每年以6000公顷的速度增加。目前，距离黄山最近的松材线虫病疫点至黄山的直线距离不超过70Km，如不采取有效措施遏制其蔓延势头，必将对我国生态环境建设、经济建设造成更大的损失。但到目前为止，还没有找到一种经济、有效的防治方法。由于松材线虫病自然传播的距离很有限，造成其远距离、大面积扩散的主要原因是人为因素，即人为运输疫木或疫木制品。在2000-2003年，深圳口岸从美国输华木质包装中截获松材线虫131批(其中，113批有美国动植物健康检验局热处理证书)，从日本输华木质包装中截获松材线虫81批(其中，73批有日本植物检疫协会和日本政府植物防疫所热处理证书)。因此，加强对松材线虫病的检疫，防止其远距离传播是治理松材线虫病工作的主要任务之一。准确诊断松材线虫病具有重要意义。
目前，松材线虫的主要检疫技术是形态学观察，但形态学观察存在以下不足第一，松材线虫与其同属的其它几种伞滑刃线虫之间非常相似。一种是拟松材线虫(B.mucronatus)，在田间条件下，拟松材线虫对松树没有致病性，但在松树胁迫时会表现致病作用。两种线虫的主要形态区别在于拟松材线虫的雌成虫有一尾尖突。另一种在形态上类似于松材线虫的是假伞滑刃线虫(B.fraudulentus)。由于一些形态学鉴别特征---雌虫尾尖突、尾形、雄虫交合伞形状等在种间存在一定的重叠现象，给准确鉴定带来很大难度。对于一些不具备典型特征的种，形态鉴定存在错检、漏检情况。第二，各检疫检查站主要是截获一些松木包装板或垫板、电缆盘等，这些材料一般较为干燥，其中线虫含量少，且大多数是幼虫，要准确鉴定是很困难的。要获得成虫鉴定需要做进一步的培养，这一过程需要7-10d，满足不了检疫检查站快速检疫的要求。第三，一些检疫检查站的检疫技术人员在松材线虫的形态鉴定技术上还有待进一步提高。
由于形态鉴定存在不足，不少学者开始在遗传学、免疫学、病理学和生理生化(酶学、血清学、性外激素、染色体数)等方面做了大量工作，对于松材线虫的检测起到了积极的作用。但是，这些方法在检测过程中由于受到松材线虫生长发育期、寄主和地理来源、实验条件的稳定性等方面的限制，在实际应用过程中具有一定的局限性。为有效地开展检疫工作，将松材线虫控制在一定区域，需要为松材线虫建立一套有效的松材线虫分子检测方法。
目前在松材线虫分子检测方面，南京农业大学注册有“松材线虫检测试剂盒及其检测方法”专利(专利申请号200310106109.5)，公开了采用PCR方法检测松材线虫的试剂与方法。但该专利所提供的检测方法存在一些缺陷，主要有(1)产生假阳性，引物的特异性不强；(2)检测时间较长，全检测过程大于5小时。上海市林业站注册有“松材线虫检测试剂盒及其检测方法”专利(专利申请号200510026710.2)，公开了采用实时PCR方法检测松材线虫的特异引物、探针以及检测方法。但该专利所提供的引物存在的主要问题是稳定性不高。此外，检测所需仪器设备价值约60万元，该方法难于在基层单位推广应用。
本领域迫切需要特异性强、稳定性高、方便、准确的检测引物与方法。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供用于检测松材线虫的特异引物对。
本发明用于检测松材线虫的引物对序列为1、引物对A上游引物(F)5’-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3’；
下游引物(R)5’-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3’。
2、引物对B上游引物(F)5’-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3’；下游引物(R)5’-TCCAC CGGAG TAACT AAAGC-3’。
用引物对A或引物对B对待测样品DNA进行扩增，若结果产生一条特异谱带(引物A谱带大小为600bp，引物B谱带大小为860bp)，则该样品含有松材线虫；若扩增结果没有出现谱带，则该样品中不含有松材线虫。
与现有技术比较，本发明的进步在于(1)检测结果准确性高。在开发与检验该发明引物对的过程中，共验证了来自美国、日本、加拿大、韩国以及我国十多个省份的184个样品。其中包括173个松材线虫株系、8个拟松材线虫株系、1个霍夫曼尼伞滑刃线虫(B.hofmanni)株系和1个大核滑刃线虫(Aphelenchoides macronucleatus)株系，检测样品数量非常大，对松材线虫的检测准确性达100％。
(2)稳定性好。通过大量样品检验，松材线虫样品均能够稳定地扩增出特异谱带。
(3)检测方法安全。电泳过程用GOLDVIEW染料代替溴化乙锭(EB)染色，避免了EB对环境的污染与人体的损害。
(4)检测结果易于判读。用引物对A或引物对B对待测样品DNA进行扩增，若结果产生一条特异谱带(引物对A产生谱带大小为600bp，引物对B产生谱带大小为860bp)，则该样品含有松材线虫；若扩增结果没有出现谱带，则该样品中不含有松材线虫。
(5)检测灵敏度高。两引物对均可检测出任一松材线虫片段。
(6)检测仪器简单。仅需普通PCR仪、离心机、电泳仪等，检测仪器价值不超过10万元。适合于在县级检疫检查站推广应用。
图1为引物对A检测结果泳道1-173 Bursaphelenchus xylophilus 松材线虫泳道174-181B.mucronatus 拟松材线虫泳道182B.hofmanni 霍夫曼尼伞滑刃线虫泳道183Aphelenchoides macronucleatus大核滑刃线虫泳道184Seinura sp. 长尾属线虫泳道M Marker DNA分子量标准泳道1-173为松材线虫样本，均能够扩增出一条长度为600bp的谱带，而泳道174-184分别为拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫，均未扩增出谱带。
图2为引物对B检测结果泳道1-173 Bursaphelenchus xylophilus松材线虫泳道174-181B.mucronatus 拟松材线虫泳道182B.hofmanni霍夫曼尼伞滑刃线虫泳道183Aphelenchoides macronucleatus 大核滑刃线虫泳道184Seinura sp. 长尾属线虫泳道M Marker DNA分子量标准泳道1-173为松材线虫样本，均能够扩增出一条长度为860bp的谱带，而泳道174-184分别为拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫，均未扩增出谱带。
具体实施例方式
引物对检测方法在常规的PCR扩增检测时，引物采用松材线虫特异的引物对A或者采用松材线虫特异的引物对B。将扩增产物进行凝胶电泳后，在紫外光下下观察结果。根据扩增产物是否产生特异的松材线虫条带(引物对A产生谱带大小为600bp，引物对B产生谱带大小为860bp)，即可判定样品中是否含有松材线虫。
引物设计1、引物对A根据松材线虫的RAPD特异片段克隆的结果，用Oligo5.0软件设计松材线虫的特异引物对。
0061AAAAAGTTTC GCGCGGAAAT TGAATCTTGG CATTCCGTTG CAACTCGGAA TGAAAAAACA0121AAATTTTTTC TGGGTTTTTT GCTCGGCCCA AAATTGCTTC CAATGGGCCG GCTTGGTGTT0181CGTTTTGTTT TGAAATGCTC TATCCGCTTT CATGTAGCAT CATTGATGTC TTTGACATCA0241AAAACGTCCG AGATTTATAA CATTGAGGGC TTCTTTTGGG AAGAGGAAAA GGAACTTTTT0301TTATTTTTTA AATCCGTTCT GGCATGATAA TTCATCTATT ATATTCGCAT TTTTGAGAGT0361TGCGTTCTAA CCTTTCAACC GCGATGCCAT CTAAGTTATA TTATTTTAGC TCAAAATGGC0421TAGTGTTATC CTGCCAAATC AGCCAGTGGT CATCGACAAT GGCTCGGGCT CAATCAAGGC0481CGGCTTTGCG GGTGAGGATG GACCTCGAGT AGTGTTCCCG AATTATGTGG GGGTTGTGAA0541ACATTCGCGG GTCATGGCTG GAGGTATCGTTAAGGATAGC TTGGTCGGTA AGTACACTTT上游引物(F)0601ATTTTATTTT TTTTTGCGTT TTTAGGTATA AAGTCTTCTG TTCCAAATAT GTATTGAGAC0721CCATGGTGTA AATCTTACAA AATCTTTTTT CAGGATCTGA TGCGCAGAAG TACAGAGGCC0781TGTTGGCTCT TAGATATCCT ATGGAGCACG GTATAGTTAC AGATTGGAAT GCTATGCAGC0841AAATATGGGA GTTTGCGTAT TCCCCCGAGC AATTAAATGT AAGTTAAACC TCATGCCGTT0901ATTTATTTTT TAGTGTAATT CCGCTGACCA TCCGGTACTT CTATCAGAGG CTCCTCTGAA0961TCCTCTGCAA AATAGAGAGA AGGCAATGGA GATCTTCTTT GAGACCTTTG GAGTCCCTTC1021CATTCACGTA CAGATGCAGG CCGTTCTAAG TTTATATGCT GCTGGACGAA CAACTGGAGT1081TGTCCTAGAC TCGGGAGACG GTGTGACACA TTCAGTACCG GTTTACGAAG GATTTGCCAT下游引物(R)1141TGAGCCAGCG TACGTTGTGC TATATTTGTG GCCAATGATA ATATGGGATG TTACGAATAA1201TATAATTATT TAGAATCCAA CGGATTGATG TCGCTGGACG CGATGTAACA AACTATCTGA1261AGCTTCTACT GCGAAAGGAA GGCCATATTT TCCATCGATC CAATGAATTT GAACTGGTCC2、引物对B上游引物(F)与引物对A相同，下游引物(R)是选择松材线虫的ITS1区与其他线虫有较大差异的区段，并经过Oligo5.0软件分析与上游引物相匹配的序列。
001CGTAACAAGG TAGCTGTAGG TGAACCTTCG GCTGGATCAT TACCGATCCT ATGACACATT061TATTCGTGCT CGTCACGATG ATGCGATTGG TGACTTCGGT TGCCGCGCAT GATGGCGGTT121CGATTCGCGT CGTTCCGCCT ACTGATGGTT CGCATGGAAG CCGAGAGGCG ACCGTGCAAC181GGTGAAGTCT GGGTTTCTAC GTGCTGTTGT TGAGTTGGCG TTTTACCGTG CCGACAGATG241AGACCAGCCA GCTGCTTGCC GATTCGTTCT GGCGAGCGTA GGATTGAAAA GCCCGAGAGG301CTGCCCTGAC AAAACATTCA TTTTACATTT ATTTTGTTGG AAAAGAGCTT TAGTTACTCC下游引物(R)361GGTGGATCAC TTGGCTCGCG GGTCGATGAA GAACGCAGTG AATTGCGATA ATAAGTACGA试剂和设备扩增仪器为PTC-200 DNA Engine。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。DNA聚合酶(Taq、Z-Taq)购自大连宝生物公司(Taq扩增需2小时，Z-Taq扩增仅需1小时)。
标本来源本发明所采用的松材线虫(B.xylophilus)173个株系，拟松材线虫(B.mucronatus)8个株系，霍夫曼尼伞滑刃线虫(B.hofmanni)1个株系，大核滑刃线虫(Aphelenchoides macronucleatus)1个株系，长尾属线虫(Seinura sp.)1个株系，见下表
实施例1用引物对A检测松材线虫每条线虫，加入8μl预冷的线虫裂解液(含2.5mmol/L DDT，1.125％Tween20，0.025％Gelatin，2.5倍PCR Buffer)和2μL 2mg/mL预冷的蛋白酶K，将线虫与裂解液置于Eppenddorf管中。在PCR仪上，于65℃条件下保温处理50分钟，以钝化内源核酸酶的活性。在95℃条件下保温处理7-10分钟，以变性蛋白酶K。14000rpm离心2分钟，上清液即可用于扩增。
1-173号样品为松材线虫模板，174-181号样品为拟松材线虫模板，182号样品为霍夫曼尼伞滑刃线虫，183号样品为大核滑刃线虫，184号样品为长尾属线虫。
反应体系。每反应的混合液总体积为20μL，其中(1)2.0μL 10×Z-Taq PCR缓冲液；(2)2μL 2.5mM的dNTP；(3)0.3μL Z-Taq酶；(4)1.5μL 10mM的引物对A；(5)3.5μL的模板DNA；(6)补充高压灭菌重蒸水至20μL。以上加样过程均在冰盒上进行。
反应程序。反应混合液在98℃预变性2min，进入循环98℃变性3s，52℃退火3s，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸3min。
结果1-173样品均能够扩增出一条长度为600bp的谱带，而174-184样品均未扩增出谱带。松材线虫检测结果为阳性，而其他线虫检测结果为阴性。结果表明，本发明引物对A的特异性强，可以从拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等中检测出松材线虫。见图1。
实施例2用引物对B检测松材线虫每条线虫，加入8μl预冷的线虫裂解液(含2.5mmol/L DDT，1.125％Tween20，0.025％Gelatin，2.5倍PCR Buffer)和2μL 2mg/mL预冷的蛋白酶K，将线虫与裂解液置于Eppenddorf管中。在PCR仪上，于65℃条件下保温处理50分钟，以钝化内源核酸酶的活性。在95℃条件下保温处理7-10分钟，以变性蛋白酶K。14000rpm离心2分钟，上清液即可用于扩增。
1-173号样品为松材线虫模板，174-181号样品为拟松材线虫模板，182号样品为霍夫曼尼伞滑刃线虫，183号样品为大核滑刃线虫，184号样品为长尾属线虫。
反应体系。每反应的混合液总体积为20μL，其中(1)2.0μL 10×Z-Taq PCR缓冲液；(2)2μL 2.5mM的dNTP；(3)0.3μL Z-Taq酶；(4)1.5μL 10mM的引物对B；(5)3.5μL的模板DNA；(6)补充高压灭菌重蒸水至20μL。以上加样过程均在冰盒上进行。
反应程序。反应混合液在98℃预变性2min，进入循环98℃变性3s，52℃退火3s，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸3min。
结果1-173样品均能够扩增出一条长度为860bp的谱带，而174-184样品均未扩增出谱带。松材线虫检测结果为阳性，而其他线虫检测结果为阴性。结果表明，本发明引物对B的特异性强，可以从拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等中检测出松材线虫。见图2。
序列表<110>叶建仁，陈凤毛，汤坚<120>松材线虫PCR检测特异引物对<140>2006100390493<141>2006-03-24<160>3<210>1<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据松材线虫特异片段测序结果，用Oligo5.0软件设计，以用作引物对A或引物对B的上游引物。
<400>1cgggtcatgg ctggaggtat cgt 23<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据松材线虫特异片段测序结果，用Oligo5.0软件设计，以用作引物对A的下游引物。
<400>2tggctcaatg gcaaatcctt cgta 24<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据松材线虫的ITS区与其他线虫有较大差异的区段，用Oligo5.0软件设计，以用作引物对B的下游引物。
<400>3tccaccggag taactaaagc 20
权利要求
1.一种用于松材线虫检测的特异性扩增引物对A，其特征在于，序列为上游引物(F)5’-CGGGTCATGGCTGGAGGTATCGT-3’；下游引物(R)5’-TGGCT CAATG GCAAATCCTT CGTA-3’。
2.一种用于松材线虫检测的特异性扩增引物对B，其特征在于，序列为上游引物(F)5’-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3’；下游引物(R)5’-TCCAC CGGAG TAACTAAAGC-3’。用引物对A或引物对B对待测样品DNA进行扩增，若结果产生一条特异谱带(引物A产生谱带大小为600bp，引物B产生谱带大小为860bp)，则该样品为松材线虫；若扩增结果没有出现谱带，则该样品中不含有松材线虫。
全文摘要
本发明公开了两对PCR引物，这两对引物均可以安全、准确、快速、稳定地检测出松材线虫。两引物对均适合于简易方法提取的线虫DNA扩增。引物对A尤其适合于较纯的线虫DNA扩增。根据扩增产物是否产生特异的松材线虫条带(引物对A产生谱带大小为600bp，引物对B产生谱带大小为860bp)，即可判定样品中是否含有松材线虫。本发明的特异引物对具有特异性强，准确性高。检测过程操作简便，仅需一套普通的PCR仪即可进行检测。从线虫DNA的简易提取到检测结果的出现，全过程仅需2.5小时。适合于林业部门的各检疫检查站、森防机构、外检部门、森林保护研究机构等应用。
文档编号C12Q1/68GK101041851SQ200610039049
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日
发明者叶建仁, 陈凤毛, 汤坚, 吴小芹, 叶学斌 申请人:叶建仁, 陈凤毛, 汤坚