专利名称：构建小球藻表达载体、转化小球藻和破壁小球藻的方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域。具体地，涉及利用椭圆小球藻硝酸还 原酶缺失突变体高效、安全的表达常规的基因工程表达系统(如大肠杆菌 和酵母)不适合表达的外源蛋白的体系建立及其应用。
背景技术：
小球藻((^2/0^//^属于绿藻门小球藻属的一类单细胞真核微藻，具有 真核生物基因表达的特点，富含蛋白质、氨基酸、维生素、铁、钙等营养
成分，被认为是极有价值的食品和饲料添加剂的来源(Bricknell and Dalmo,2005)，且易繁殖培养，适宜于规模化生产。
基于小球藻所具有的上述特点，以小球藻作为生物反应器表达外源基 因将具有明显的优点，多个研究小组对此已进行了探索。Dawson a a/.，(1997)利用微粒轰击转化的方法将Cv"/gw^的硝酸还原酶基因导入到 C.^rahm'mw硝酸还原酶突变体中，得到了能在含有硝酸盐培养基中生长 的藻株，这是关于小球藻中外源基因稳定转化的首例报道。Richard ef a/. (1999 )用PEG转化法将人的生长激素基因转入Cv"/gm^ C-27和 C.sorahm'a"fl ATCC-22521中，研究了随机整合与同源重组对外源基因表达 的影响。Kim " d，(2002)用PEG转化法将比目鱼生长激素基因(/G用转入到 C.e//^^0^^中，投喂试验结果表明转基因小球藻对鱼苗的生长有促进作 用，表明转基因小球藻具有较强的实用价值。中国科学院的孙勇如研究小 组克隆了椭圆小球藻(Ce/Zz^o^a)的硝酸还原酶基因及其启动子(Wang effl/.， 2003， 2004)。硝酸还原酶(NR)是氮同化过程中的一个重要的酶，能 够将硝酸盐还原为亚硝酸盐，从而使野生型小球藻能够利用硝酸盐作为氮 源进行正常的生长发育。小球藻的硝酸还原酶功能缺失突变体则不能利用硝酸盐作为氮源，但可以利用亚硝酸盐作为氮源。因此外源基因转化小球 藻硝酸还原酶功能缺失突变体时，可用硝酸还原酶基因作为筛选标记
(Wang " a/. ， 2005; Zhang " a/. ， 2006)。
防御素是广泛存在于动植物及昆虫体内的一类阳离子肽，它是长期进 化形成的生物体防御微生物入侵的天然屏障，作为潜在的新一代抗生素药 物在临床上具有很好的应用前景。兔防御素NP-1最初从兔嗜中性白细胞 分离得到(Ganz， 1989)，由33个氨基酸组成，属于a防御素。作为最早 发现的防御素之一，人们对其功能也研究得较多，NP-1是目前从生物界 分离到的30多种防御素中抗性谱最广的一个。像防御素这样的抗菌肽由 于本身对宿主有很强的毒害作用，所以很难用常规的基因工程表达系统如 大肠杆菌和酵母来生产(Li""/.， 2004)。
启动子是影响外源基因的表达的重要因素。Wu'，"/启动子对外源基 因在小球藻中的表达调控有较高的效率，Q序列对外源基因的表达有显著 的增强作用(WangWa/., 2001)。 Wang " "/.， (2004)报道小球藻的硝酸还原 酶基因启动子比f/Zn々M衍"启动子对其控制的下游基因有更强的效果。Chen "a/. (2001)在椭圆小球藻中以A^77/为筛选标记基因，以U&々W""启动 子控制A^-7基因，表达了NP-l,但获得的转基因藻株在去掉筛选压力后 检测不到NP-1的活性，在以往的小球藻转化研究中，A^n/常被用作筛 选标记基因，筛选试剂为G418。但仅利用G418筛选获得的转基因小球藻 不够稳定，去掉G418后外源基因易丢失(本实验室未发表数据)，而且在 含有G418的培养基中大规模培养转基因小球藻成本比较高。
在植物基因工程研究中常会出现外源基因不易整合到染色体基因组， 或整合后表达不稳定等现象。人们推测这一现象的发生可能是因为相同的 启动子竞争有限的转录因子，引起转录水平降低从而影响到外源基因的翻 译水平(Park etal., 1996)。通常该现象是由启动子区域内的一段同源序列 引起。己有报道指出，启动子区域内90bp的同源序列就足以抑制两个基 因的表达水平(Vaucheret, 1993)。我们构建的植物表达载体中，筛选标记 硝酸还原酶基因由小球藻的硝酸还原酶基因启动子控制，如果外源基因 iV尸-7也用硝酸还原酶基因启动子控制，再加上小球藻本身也含有硝酸还 原酶基因启动子，过多的硝酸还原酶基因启动子可能会造成外源基因启动效率不高，在小球藻中整合不稳定等问题。这在我们以前发表的论文
(Zhang "a/.， 2006)中没有给以足够关注。本研究中我们用C/^々m衍"启 动子控制A^-7，这也许是获得具有NP-1活性较强的转基因藻株的重要因
素之一。
小球藻的转化方法目前大致分为四种1、 PEG转化法(Richard " a/.,1999)。 2、电穿孑L导入基因法(Ladygin and Boutanave , 2002; Maruyama "a/.，1994)。 3、基因枪法(Boynton"a/., 1988; Kindle""/., 1989)。 4、玻 璃珠搅拌法(Kindlee a/.,1991， 1990)。利用电击方法和基因枪转化方法进 行遗传转化时需要昂贵的仪器设备，玻璃珠搅拌法效率很低。小球藻遗传 转化多采用PEG方法，但PEG法因为其操作步骤较多而容易染菌。本研 究改进了PEG转化方法，与Richard a/.， ( 1999)用的PEG方法相比， 节省了酶的用量，节约了转化成本，并且减少了操作步骤，进而减少了染 菌的几率。
影响NP-1活性检测的重要因素之一是转基因小球藻的破壁。普通小球 藻的破壁多采用超声破碎法，但转NP-l小球藻如果超声破碎时间过长则可 能导致NP-1二硫键的断裂而影响NP-1的活性。如果超声破碎时间过短则不 能完全破碎转基因藻细胞，使得单位藻液NP-1产量过低。本试验经过多次 摸索得出湿藻重与玻璃珠的质量比为1:1时超声9 s，循环90次破碎时的效 果最好。
本研究以椭圆小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体为受体，以iVP7Y/和 硝酸还原酶基因为筛选标记，以t/W^^/"启动子控制A^-7，采用经济实用 的小球藻PEG转化方法进行转化，在初筛时利用7V尸27/和硝酸还原酶基因 作为双重筛选标记，用G418和硝酸盐进行双重筛选压力筛选(3次固体培 养平板筛选和3次液体培养筛选)，然后再仅利用硝酸盐进行筛选，获得了 能够在硝酸盐培养基上培养而且具有较强NP-1活性的转基因小球藻，目前 尚未见报道到去掉G418筛选压力能够具有较强NP-l活性的iV/M的转基因 藻株。
发明内容
本发明在一个方面提供了一种用于小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因的表达载体，其是通过将NR表达框(SEQIDNO:6)， C/Z^i^/w启动子(SEQIDNO:l)和Q序列(SEQIDNO:5)依次首尾连 接克隆入载体质粒的多克隆位点中而获得，其中所述载体质粒适于在小球 藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因。
在本发明的一个优选实施方案中，所述载体质粒选自由pBinl9， pGreen0029， pCABIA1300， pBinl21， pbin221和pBADW组成的组。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述载体质粒是如图l所示的 pbin221质粒。
在本发明的一个具体实施方案中，所述表达载体是如图4所示的 pbin-NR-UQ或如图8所示的pGreen-NR-UQ。
在本发明的一个优选实施方案中，所述外源基因是A73-/基因，其核 苷酸序列为SEQ IDNO:12所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述小球藻藻种为普通或者椭圆小球藻。
在本发明的另一个方面，提供了上述表达载体在小球藻硝酸还原酶基 因缺失突变体中表达外源基因中的应用。特别地，其中所述载体质粒、外 源基因和小球藻藻种如上所定义。
在本发明的另一个方面，提供了一种构建在小球藻硝酸还原酶基因缺 失突变体中表达外源基因的表达载体的方法，包括将NR表达框(SEQID NO: 6) t/Z^M"/w启动子(SEQIDNO:l)和Q序列(SEQIDNO:5)依 次首尾连接克隆入载体质粒的多克隆位点中的步骤，其中所述载体质粒适 于在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因。特别地，其中所 述载体质粒、外源基因和小球藻藻种如上所定义。
在本发明的另一个方面，提供了一种小球藻PEG转化方法，其包括 将小球藻细胞用酶解液(山梨醇0.6M， CaClr12H20 50 mM， R-10纤维 素酶(lU/mg)3X—6%， R-10果胶酶(lU/mg)1 % — 4 % ， Y-23果胶酶 (lU/mg)0.1%。一1.5%。)悬浮后置于25t:，遮光培养，其中所述百分比为质 量/体积。
在本发明的一个优选实施方案中，所述R-10纤维素酶(lU/mg)含量为 4%， R-10果胶酶(lU/mg)含量为2X， Y-23果胶酶(lU/mg)含量为1%。。
7在本发明的另一个方面，提供了一种高效的转基因小球藻破壁方法， 其特征在于利用超声破碎的方法，按小球藻湿重(g):玻璃珠(g):水(ml) 二h 1: l的比例加入玻璃珠和水。
在本发明的一个优选实施方案中，所述超声波破碎的条件是超声破碎
7-12 s，间隔2-6s，破碎次数70-90次。
由本发明的内容可知，本发明的表达载体安全、高效，不用抗生素筛 选，利用该表达载体转化的藻株可在无抗生素存在的条件下高效表达外源基因。
同时本发明的小球藻PEG转化方法降低了现有技术中PEG转化的成 本和步骤，使该转化体系更加有利于小球藻和其他单细胞藻类细胞转化的 应用。
本发明提供的转基因小球藻高效破壁技术，大大提高了转基因小球藻 的破壁率，提高了表达产物的得率。
图l.pbin221质粒结构图。 图2. pbinUGUS质粒结构图。 图3. pbinUQGUS质粒结构图。 图4. pbin-NR-UQ质粒结构图。 图5. pGreen0029质粒的结构图。 图6. pGreen0029nos质粒结构图。 图7. pGreenUQNos质粒结构图。 图8. pGreen-NR-UQ质粒结构图。 图9. pbin-NR-UQ-NP-l质粒结构图。
图IO. PEG融合方法转化椭圆小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体得到 的抗G418的藻落。
图ll. 7V尸7Y/基因PCR检测结果。1-7，转化藻株l-7; 8，未转化藻株 4; 9，阳性质粒。
图12.7V尸-7基因PCR检测结果。1，阳性质粒；2，未转化藻株"rw-4; 3-9，转化藻株l-7。图13.转基因小球藻粗蛋白提取液在液体培养基中对大肠杆菌的抑菌
效果。上图Ck， LB培养基；1/2 1/64，分别为转基因m7n-4粗蛋白提取 液用LB培养基稀释的比例(V/V);下图Ck， LB培养基；1/2 1/64，分 别为w，-4E蛋白提取液用LB培养基稀释的比例(V/V)。
图14.转基因小球藻粗蛋白提取液在固体培养基上对大肠杆菌的抑菌
效果。1， 3:分别为"rm一可溶性蛋白提取液和无菌水；2， 4:转基因藻
株可溶性蛋白提取液。
具体实施例方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以 理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本 发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
各种限制性内切酶，DNA上样缓冲液(6x Loading Buffer)购自TaKaRa 公司；普通Taq酶，plus 2000 Maker, DNA纯化回收试剂盒，购自北京全 式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；葡萄糖及其他无 机试剂均购自北京经科宏达生物技术有限公司；鲑鱼精DNA购自 Invitrogen公司；RNA提取试剂盒购于Qiagen公司，反转录试剂盒购于 TOYOBO公司；纤维素酶(Onozuka R-10),果胶酶(Onozuka R-IO)，果胶 酶Y-23购自鼎国公司；玻璃珠购于Sigma公司。
实施例1.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体构建方法
根据Wz々m淑"启动子序列(SEQ ID NO:l)设计引物，上游引物 5， CCGGAAGCTTGTGCAGCGTGACCCG3， (SEQ ID NO:2);下游引物5， GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3， (SEQ IDN0:3)，其中在上游引物中加入历>^111 酶切位点，下游引物中加入B"m//I酶切位点，用PCR方法从玉米基因组 中得到t/W^加"启动子，测序结果显示为W^w加"启动子序列(SEQ ID NO:4，其在SEQ ID NO;l的5'端及3'端分别添加了历"d III酶切位点和 Sam/7 I酶切位点)。将PCR产物用/Z/"d in和&m//I内切酶双酶切，质粒 pBI221 (Clontech)(图l)也经州>^111和^ 附//1内切酶双酶切161:连接过 夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上
937。C倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行酶切鉴定，能够得到
1987bp大小片段(即Wu一/^启动子)的质粒即命名为pbinUGUS(图2)。 根据Q序列(SEQ ID NO:5)，人工合成该基因，并在其上游加入S"w// I酶切位点，在下游加入Sm"I酶切位点。将合成基因用Sm"I和Sflm/ZI 内切酶双酶切，质粒pbinUGUS也经5>w" I和Saw// I内切酶双酶切16°C 连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5ct，在含有50mg/L氨苄霉素的LB 培养基上37t:倒置培养过夜，对长出的抗性菌落测序鉴定为Q序列，则 将上述连接产物命名为pbinUf2GUS (图3)。
将pbinUQGUS用历W III内切酶酶切，用同样的酶切pSK-NR质粒 (含有硝酸还原酶表达框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank， 接收号为AY275834， NR表达框序列如SEQ IDN0:6所示，涉及pSK-NR质 粒及NR表达框的专利
发明者孙勇如, 洋 安, 尹维波, 张丽华, 军 胡, 胡赞民, 赵世民, 陈宇红 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所