专利名称：一种快速简便的基因克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种快速简便的基因克隆方法，适合于从基因组DNA，cDNA文库和含有基因的载体上通过PCR方法克隆基因到目的载体上，属于基因工程和分子生物学领域。
背景技术：
基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段与能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行进一步研究的分子操作的过程， 又称DNA克隆，分子克隆，基因操作或重组DNA技术。基因克隆主要包括目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞和重组子的筛选。目前PCR产物的克隆方法主要有粘性末端克隆，平末端克隆和T-末端克隆。在获得PCR产物和选择好目的载体之后，通常的方法都是用限制性内切酶同时酶切PCR产物和目的载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒分离纯化酶切好的PCR产物和载体， 进而继续后面的连接，转化和筛选等步骤。整个基因克隆的过程耗时较长，然而现在一些公司推出了商业化的快速限制性内切酶和快速DNA连接酶以后，使酶切和连接的时间都能缩短到十分钟左右的时间完成，这时琼脂糖凝胶电泳和胶回收就成为基因克隆耗时最长的步骤了 ο另外，目前最方便快捷的基因克隆方法是A-T克隆法。商业化的T载体是能较快的用于克隆基因，但是采用T载体克隆一方面增加了基因克隆的步骤，还需要进一步把目的DNA片段克隆到目的载体上，增加了整个基因克隆的步骤和时间；另一方面不仅增加了成本，而且不适合于用单一的具有3’ 5’校正酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物进行克隆。
发明内容
本发明目的是解决现有基因克隆过程耗时较长的问题，提供一种快速简便的基因克隆方法。本发明提供的快速简便的基因克隆方法首先利用快速限制性内切酶系统酶切目的DNA (PCR产物)和载体DNA，酶切体系如下
载体(或PCR产物)5 20ng (或5_20ul)
IOX酶切缓冲液2.5μ1
内切酶11.5μ1
内切酶21. 5μ1
双蒸水补足至25μ1
然后利用苯酚和氯仿抽提、乙醇和醋酸钠沉淀DNA的方法来回收酶切的DNA片段，其抽提沉淀体系如下
载体酶切产物抽提上清20μ1 (依据上面的酶切体系大小而定)
基因片段酶切产物抽提上清20μ1 (依据上面的酶切体系大小而定)乙酸钠4μ1 (1/10上清总体积)
冷乙醇80μ1 (2倍上清总体积)
进而离心沉淀得到目的DNA和载体DNA酶切产物的混合物，室温干燥后进行连接，其连接体系如下
沉淀ομl
5 X连接缓冲液2. Ομl
连接酶0. 5μ1
双蒸水补足至ιομ
最后，连接产物转化大肠杆菌，第二天用菌落PCR方法筛选阳性克隆。
本发明方法的具体操作步骤如下 第1、通过PCR获得目的DNA片段并选择好目的载体；
第2、取载体DNA和PCR产物分别进行快速的限制性内切酶反应，酶切完成后分别加入等体积的苯酚氯仿异戊醇=25 24 1的混合液，然后涡旋混勻进行抽提；
第3、将第2步抽提得到的上清取出置于一个新的离心管中混合，再加入ρΗ5. 2的乙酸钠和冷乙醇沉淀酶切后的DNA，混勻后置于_20°C或者_70°C放置半个小时，然后离心去上清，于室温晾干DNA沉淀，加入适量的去离子水溶解DNA，再加入连接缓冲液和DNA连接酶， 然后继续后面的连接、转化和筛选等步骤。
本发明方法可用于各种基因克隆或者亚克隆实验的中间步骤。
本发明的优点和积极效果
本发明是利用生物化学的方法，找到了一种替换琼脂糖凝胶电泳和胶回收分离纯化 DNA片段的方法，简化了基因克隆的步骤，使整个基因克隆的过程更加简便快速。在本发明中，不需要对酶切产物进行切胶回收，而是采用抽提沉淀DNA的方法。本发明的原理是利用了酚和氯仿能使蛋白质变性，通过抽提沉淀除去内切酶，然后利用醋酸钠和冷乙醇能沉淀DNA的原理，改变了以往通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切DNA 产物的方法，该方法既简单方便，又节省了实验时间。
图1是克隆人MPP7基因片段的菌落PCR产物电泳图。图2是克隆人Elp3基因的菌落PCR产物电泳图。
具体实施例方式实施例1 人MPP7基因片段克隆到pCMV-Myc载体
1.以含有全长人MPP7基因的载体DNA为模板，设计特异的引物通过PCR扩增得到所需要的人MPP7基因片段；2.取一定量的pCMV-Myc载体和人MPP7基因片段PCR产物(摩尔比最好在1 10左右)，分别用i^rmentas公司的快速限制性内切酶系统进行酶切10分钟左右； (1) pCMV-Myc载体25μ1酶切体系
pCMV-Myc IOX酶切缓冲液 EcoR I Xho I 双蒸水
5 20ng 2. 5μ1 1. 5μ1 1. 5μ1
补足至25μ1 (2)人ΜΡΡ7基因片段PCR产物25μ1酶切体系 PCR 产物ΙΟμΙ
IOX酶切缓冲液 2.5μ1 EcoR I1. 5μ1
Xho I1. 5μ1
双蒸水补足至25μ1
3.分别加入等体积(25μ1)的苯酚氯仿异戊醇=25 24 1的混合液涡旋混勻， 抽提15秒左右，然后12000转离心5分钟后，分别取两管中的上清于一个新的离心管中混合；
4.再加入1/10体积的3Μ的乙酸钠(ρΗ5.2)和2倍体积的冷乙醇，混勻后置于_20°C 或者-70°C放置半个小时；
(3)抽提沉淀体系 载体酶切产物抽提上清基因片段酶切产物抽提上清乙酸钠冷乙醇
20μ1 20μ1 4μ1
80μ1。5.然后12000转离心5分钟，移走上清后于室温晾干10分钟，加入7. 5μ1去离子水溶解DNA，再加入2μ1 5 X连接缓冲液和0. 5μ1全式金公司的快速Τ4 DNA连接酶，连接 10分钟；
6.连接产物转化大肠杆菌，过夜培养后进行常规菌落PCR筛选阳性克隆，菌落PCR结果见图1。结论从操作步骤可以看出，基因克隆关键的三个步骤酶切，回收和连接的时间缩短到1个小时之内就可以完成，这大大缩短了实验时间，另外目的基因片段较短，比较容易克隆，从菌落PCR结果图中可以看到，只挑取了 5个克隆，其中4个是阳性克隆，说明克隆效率挺高的。
实施例2 人Elp3基因克隆到pFastbac HT A载体
1.采用Trizol法提取细胞的总RNA，反转录得到总的cDNA文库，然后以此作为模板，设计特异的引物通过PCR扩增得到所需要的人Elp3全长基因；
2.取一定量的pFastbacHT A载体和人ELP3基因的PCR产物(摩尔比最好在1 10 左右)，分别用i^rmentas公司的快速限制性内切酶系统进行酶切10分钟左右；(DpFastbac HT A载体25μ1酶切体系
pFastbac HT A5 20ng
IOX酶切缓冲液2.5μ1
EcoR I1. 5μ1
Xho I1. 5μ1
双蒸水补足至25μ1
(2)人ELP3基因的PCR产物25μ1酶切体系
PCR 产物ΙΟμΙ
IOX酶切缓冲液2.5μ1
EcoR I1. 5μ1
Xho I1. 5μ1
双蒸水补足至25μ1
3.分别加入等体积(25μ1)的苯酚氯仿异戊醇=25 24 1的混合液涡旋混勻， 抽提15秒左右，然后12000转离心5分钟后，分别取两管中的上清于一个新的离心管中混合；
4.再加入1/10体积的3Μ的乙酸钠(ρΗ5.2)和2倍体积的冷乙醇，混勻后置于_20°C
或者-70°C放置半个小时； (3)抽提沉淀体系
载体酶切产物抽提上清20μ1
基因酶切产物抽提上清20μ1
乙酸钠4μ1
冷乙醇80μ1
5.然后12000转离心5分钟，移走上清后于室温晾干10分钟，加入7.5μ1去离子水溶解DNA，再加入2μ1 5 X连接缓冲液和0. 5μ1全式金公司的快速Τ4 DNA连接酶，连接10分钟；
6.连接产物转化大肠杆菌，过夜培养后进行常规菌落PCR筛选阳性克隆，菌落PCR结果见图2。 结论无论是短片段的目的DNA还是长片段的目的DNA，都适用本发明中的方法， 同样能使酶切，回收和连接的时间缩短到1个小时之内完成，另外虽然目的基因片段相对较长，也能很好的进行克隆，从菌落PCR结果图中可以看到，挑取了 7个克隆，其中5个是阳性克隆，说明克隆效率也挺高的。
权利要求
1.一种快速简便的基因克隆方法，其特征在于首先利用快速限制性内切酶系统酶切载体DNA或目的DNA，酶切体系如下载体或目的DNA5 20ng或5 20ulIOX酶切缓冲液2.5μ1内切酶11.5μ1内切酶21. 5μ1双蒸水补足至25μ1然后利用苯酚和氯仿抽提、乙醇和醋酸钠沉淀DNA的方法来回收酶切的DNA片段，其抽提沉淀体系如下载体酶切产物抽提上清20μ1基因片段酶切产物抽提上清20μ1乙酸钠4μ1冷乙醇80μ1进而离心沉淀得到目的DNA和载体DNA酶切产物的混合物，室温干燥后进行连接，其连接体系如下沉淀ομ 5 X连接缓冲液2. Ομ 连接酶0. 5μ1双蒸水补足至ιομ 最后，连接产物转化大肠杆菌，第二天用菌落PCR方法筛选阳性克隆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下 第1、通过PCR获得目的DNA片段并选择好目的载体；第2、取载体DNA和PCR产物分别进行快速的限制性内切酶反应，酶切完成后分别加入等体积的苯酚氯仿异戊醇=25 24 1的混合液，然后涡旋混勻进行抽提；第3、将第2步抽提得到的上清取出置于一个新的离心管中混合，再加入ρΗ5. 2的乙酸钠和冷乙醇沉淀酶切后的DNA，混勻后置于_20°C或者_70°C放置半个小时，然后离心去上清，于室温晾干DNA沉淀，加入适量的去离子水溶解DNA，再加入连接缓冲液和DNA连接酶， 然后继续后面的连接、转化和筛选步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法用于各种基因克隆或者亚克隆实验的中间步骤。
全文摘要
一种快速简便的基因克隆方法，包括目的DNA片段和目的载体的快速酶切，简便的抽提沉淀方法回收DNA，快速的连接酶连接得到环形DNA分子，然后将连接产物转化细菌后培养，菌落PCR筛选得到正确的基因克隆。本发明的特点在于发明了一种简便快速的抽提沉淀方法来回收酶切好的目的DNA和载体DNA，加上使用Fermentas公司的快速限制性内切酶系统和全式金公司的快速连接酶系统，使整个基因克隆关键步骤的时间缩短了4～5h。本发明提供的克隆方法，适用于各种自备载体、插入片断和酶切位点；适用于各种PCR酶(常规Taq酶及各种高保真酶)的扩增产物；操作简单；精确定向克隆；重组效率高；重复性好；可靠性高。
文档编号C12N15/09GK102174511SQ201110009139
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者周浩, 龙加福 申请人:南开大学