用于疟原虫多重荧光分型检测的引物探针组和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于疟原虫多重荧光分型检测的引物探针组和试剂盒。本发明的引物探针组的核酸序列如SEQ ID NO：1-12所示。本发明的检测试剂盒包括主反应液混合物和引物探针组，其核酸序列如SEQ ID NO：1-6所示，其中，SEQ ID NO：1-2所示的序列作为公共引物，用于对疟原虫的检测，SEQ ID NO：3-6所示的序列作为探针，分别用于对恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫进行分型检测。本发明的试剂盒扩增反应条件高度一致，大大提高检测效率，保证了单重、双重、三重、四重的反应环境更均一、更稳定、更高效，能简便快速对恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫分型鉴别。
【专利说明】用于疟原虫多重荧光分型检测的引物探针组和试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于疟原虫多重荧光分型检测的引物 探针组和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 目前疟疾诊断的主要方法以镜检和胶体金为主。镜检不但需要操作者具有丰富的 经验，而且有一定的局限性。当原虫密度较低（〈50个/μ 1血）时，靠镜检难以查到原虫， 容易出现漏诊；由于国内少见三日疟和卵形疟，容易将两者误判为形态和临床症状相似的 间日疟和恶性疟；当发生疟原虫混合感染时，镜检不易将恶性疟的环状体或早期滋养体与 间日疟的环状体区分开，特别是用药后虫体形态发生变化，虫种鉴别较难，容易出现误诊， 并只按单一疟原虫感染进行治疗，影响治疗效果；镜检耗时，不适用于大量人群的筛查。因 此，传统的"金标准"镜检法已不是疟疾评价效率较高的诊断方法。疟疾的胶体金虽然快速， 但对原虫密度低的血样也易漏诊，而且仅能判断恶性疟感染，不能区分间日疟、三日疟和卵 形疟感染以及混合感染。为了配合卫生部和检验检疫机构等多部委制定的"中国消除疟疾 行动计划（2010-2020年）"，有效控制输入性疟疾尤其是恶性疟的传入，检验检疫机构必须 在口岸加强对自东南亚、非洲等疟疾高流行区返乡人员疟疾的检测和监测，迫切需要建立 疟疾新型的快速、准确和高效的检测方法。
[0003] 多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该 方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规 模、快速诊断的需求。该技术采用多色荧光对多条种特异性探针进行标记，配合多重PCR技 术，可以在同一个PCR反应管中对多个病原体同时进行扩增，各色荧光的增长信号与相应 PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线 达到诊断病毒类型的目的；反应时间快，整个反应约〇. 5小时-1小时完成；不需要检测后 的电泳操作，减少了实验室污染。但目前尚未见多重荧光PCR用于疟原虫分型检测。
【发明内容】
[0004] 为克服上述技术缺陷，本发明提供了用于疟原虫多重荧光分型检测的引物探针组 和试剂盒。该引物探针组和试剂盒可以实现对恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形 疟原虫快速简便的分型检测。
[0005] 本发明的疟原虫多重荧光分型检测的引物探针组，其核酸序列如SEQ ID NO :1-12 所示。所述分型包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫四种型别。
[0006] 本发明的用于疟原虫多重荧光分型检测试剂盒，包括主反应液混合物，还包括引 物探针组，所述引物探针组的核酸序列如SEQ ID NO :1-6所示，所述核酸序列如SEQ ID NO: 1-2所示的序列作为公共引物，用于对疟原虫的检测，所述核酸序列如SEQ ID NO :3-6所示 的序列作为探针，分别用于对恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫进行分型 检测。
[0007] 具体如下：
[0008] SEQ ID NO :1 5'-TGTTGCAGTTAAAACGCTCG-3'
[0009] SEQ ID NO :2 5'-TCAATTTTGTTATTCCATGCTGT-3'
[0010] 恶性疟原虫（PF)的探针5端标记FAM、3端标记BHQ1，扩增长度为289bp，探针的 核酸序列如下：
[0011] SEQ ID NO :3PF-P 5'-FAM-CCGATGTTTCATTTAAACTGGTTTGGG-BHQl-3'
[0012] 间日疟原虫（PV)的探针5端标记VIC，3端标记BHQ2,扩增长度为264bp，探针的 核酸序列如下：
[0013] SEQ ID NO:4PV-P 5'-VIC-TGATACTTCGTATCGACTTTGTGCGCAT-BHQ2-3'
[0014] 三日疟原虫（PM)的探针5端标记ROX，3端标记BHQ2,扩增长度为300bp，探针的 核酸序列如下：
[0015] SEQ ID NO:5PM-P 5'-R0X AGAATAAACGCCAAGCGTTATATTTTTTCTG-BHQ2-3'
[0016] 卵形疟原虫（PO)的探针5端标记CY5,3端标记BHQ2,扩增长度为290bp，探针的 核酸序列如下：
[0017] SEQ ID NO:6P0 5'-CY5-ACAACGTATCTGTTCTTTGCATTCCTTATG-BHQ2-3'
[0018] 利用本发明的疟原虫多重荧光检测试剂盒按如下方法检测，多重荧光PCR反应选 用的QPCR主反应液混合物为试剂盒HR Qpcr Master Mix(中国CYbio公司产品）中的主 反应液混合物，每个反应管的反应体系如下：
[0019] 2 X QPCR 主反应混合物：12. 5 μ 1 ;
[0020] 10μΜ 正向引物：1· 25μ 1 ;
[0021] 10μΜ 反向引物：1· 25μ 1 ;
[0022] 10μΜ 探针：0· 625μ 1 ;
[0023] 模板DNA:5yl;
[0024] 超纯水补足到反应总体积25 μ L。
[0025] 扩增和检测选用ABI7500HT Fast荧光定量PCR仪器上进行。
[0026] 疟原虫多重荧光PCR反应程序如下：95°C 5min，95°C 10秒一58°C 45秒，40次循 环，在58°C收集荧光。荧光检测通道在FAM、VIC、CY5和R0X。
[0027] 本试剂盒在阴性对照和阳性对照成立的前提下，根据以下条件进行结果判定：
[0028] (1)某种种类疟原虫探针对应的检验样本无明显扩增曲线，且检测不到Ct值时， 判断为该种类疟原虫荧光PCR检测阴性；
[0029] (2)某种种类疟原虫探针对应的检验样本Ct值< 35,并有明显扩增曲线，判断为 该种类疟原虫荧光PCR检测阳性；
[0030] (3)某种种类疟原虫探针对应的检验样本Ct值大于35且小于40的标本应重做。
[0031] 若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判断为该种类疟原虫荧光PCR检测阳性，否 则为阴性。
[0032] 本发明的恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫的多色定量PCR检测 (Q-PCR)试剂盒使用一对通用的"公共引物"与四条具备分型能力的"特异探针"，且扩增反 应条件也高度一致，大大提高检测效率，保证了单重、双重、三重、四重的反应环境更均一、 更稳定、更1?效。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1是恶性疟原虫（PF)的单重荧光PCR反应与恶性疟原虫（PF)、间日疟原虫 (PV)、三日疟原虫（PM)、卵形疟原虫（PO)多重反应的结果比较图；其中，虚线是PF单色，实 线是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0034] 图2是间日疟原虫（PV)的单重荧光PCR反应与恶性疟原虫（PF)、间日疟原虫 (PV)、三日疟原虫（PM)、卵形疟原虫（PO)多重反应的结果比较图；其中，虚线是PV单色，实 线是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0035] 图3是卵形疟原虫（PO)的单重荧光PCR反应与恶性疟原虫（PF)、间日疟原虫 (PV)、三日疟原虫（PM)、卵形疟原虫（PO)多重反应的结果比较图；其中，虚线是PO单色，实 线是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0036] 图4是三日疟原虫（PM)的单重荧光PCR反应与恶性疟原虫（PF)、间日疟原虫 (PV)、三日疟原虫（PM)、卵形疟原虫（PO)多重反应的结果比较图；其中，虚线是PM单色，实 线是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0037] 图5为疟原虫多重荧光PCR的特异性分析实验结果图。
【具体实施方式】
[0038] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。
[0039] 本发明所用的试剂来源情况如下：
[0040] 痕原虫核酸提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Extraction Minikit):购自德国 Qiagen 公司；
[0041] SYBR 荧光 PCR 试剂（QuantiTect SYBR Green PCR Kit):购自德国 Qiagen 公司；
[0042] 探针法荧光PCR试剂（TaqMan? Fast Universal PCR Master Mix)购自美国 ABI 公司；
[0043] HR Qpcr Master Mix 购自中国 CYbio 公司；
[0044] PCR 试剂盒 HotStarTaq PCR Master Mix 购自德国 QIAGEN 公司；
[0045] LAMP检测试剂购自广州迪澳公司；
[0046] 吉氏染色液购自珠海贝索生物公司。
[0047] 实施例1 :用于疟原虫多重荧光分型检测的引物探针组的设计
[0048] 本发明中的PCR检测引物和探针由发明人设计，设计公共引物实现对疟原虫的检 测，通过四个特异性探针，实现对恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫四种型 别的分型检测。引物探针委托广州裒源生物公司合成。
[0049] 引物探针组序列见表1。
[0050] 表 1
[0051]
【权利要求】
1. 用于疟原虫多重荧光分型检测的引物探针组，其特征在于， 所述分型包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫四种型别； 所述引物探针组的核酸序列如SEQ ID N0:l-6所示。
2. 用于疟原虫多重荧光分型检测的试剂盒，包括主反应液混合物，其特征在于，还包括 引物探针组，所述引物探针组的核酸序列如SEQ ID NO :1-6所示， 所述核酸序列如SEQ ID NO :1-2所示的引物用于疟原虫的检测； 所述核酸序列如SEQ ID NO :3所示的探针用于恶性疟原虫的检测； 所述核酸序列如SEQ ID NO :4所示的探针用于间日疟原虫的检测； 所述核酸序列如SEQ ID NO :5所示的探针用于三日疟原虫的检测； 所述核酸序列如SEQ ID NO :6所示的探针用于卵形疟原虫的检测。
【文档编号】C12Q1/68GK104263847SQ201410583682
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】师永霞, 黄吉城, 李燕, 李小波, 苏锦坤, 郑夔, 方盛藩, 冯庆文 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心