白细胞介素-31单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了特异性结合到犬白细胞介素-31(IL-31)或猫IL-31中的至少一种上的分离的抗体。此类抗体可以是用于治疗狗和猫体内的瘙痒和/或过敏症的诊断和/或兽用组合物形式。
【专利说明】白细胞介素-31单克隆抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组单克隆抗体领域及其在临床与科学程序，包括诊断程序中的用途。本发明还提供了用于治疗狗或猫的瘙痒症或过敏症的兽用组合物形式的分离的抗-1L31抗体。
【背景技术】
[0002]特异性皮炎已经由美国兽医皮肤病学会特别工作组定义为“一种具有特征性临床表现的基因易患性炎症和瘙痒过敏性皮肤疾病(Olivry等人，Veterinary Immunologyand Immunopathology2001; 81:143-146)。该特别工作组还认识到，犬的此类疾病与变应原-特异性 IgE 相关(Olivry 等人,2001supra;Marsella&01ivry Clinics inDermatology2003; 21:122-133)。严重瘙痒伴随着继发性脱毛与红斑对宠物主人而言是最为明显和关心的症状。
[0003]因贫乏和不一致的流行病学数据，特异性皮炎的流行率尚不能精确得知，但是估计为犬类总数的 10% (Marsella&01ivry2003supra; Scott 等人，CanadianVeterinary Journal2002;43:601-603;Hi 11ier Veterinary Immunology andImmunopathology2001;81:147-151)。在全球，大约4.5亿只狗患有这种慢性和终身的疾病。发病率似乎在升高。怀疑品种和性别的偏向，但是随地理区域会发生巨大的变化(Hillier, 2001supra; Picco 等人，Vet Dermatol.2008; 19:150-155)。
[0004]过敏性皮炎中涉及的潜在因素很多，但了解甚少。食物成分可能引发特异性皮炎(Picco,2008supra)，以及环境变应原如跳蚤、尘螨、豚草、植物提取物等等。遗传因素也起着重要的作用。尽管并无证实的品种偏向，某些遗传方式被认为提高了对特异性皮炎的易感性(Sousa&Marsella Veterinary Immunology and Immunopathology2001; 81:153-157;Schwartzman 等人，Clin.Exp.Tmmunol.1971;9:549-569)。
[0005]白细胞介素-31(IL_31)是2004年克隆的细胞因子。其主要由活化的T辅助(Th) 2细胞产生(Dillon等人，Nat Immunol2004; 5:752-60)，也是也可以在肥大细胞和巨噬细胞中产生。IL-31结合由IL-31受体A(IL-31RA)和制瘤素M受体(OSMR)组成的共同受体(Dillon 等人，2004supra 和 Bilsborough 等人，J Allergy ClinImmunol.2006117(2):418-25)。受体激活导致通过JAK受体的STAT磷酸化。该共同受体的表达已经显示在巨噬细胞、角质形成细胞中和在背根神经节中。近来，已经发现IL-31涉及皮炎、瘙痒性皮肤病损、过敏和气道过敏，参见图1。
[0006]用抗⑶3和抗⑶28抗体刺激T细胞立即上调IL-31mRNA表达(Dillon等人，2004supra)。微阵列分析已经表明，IL-31诱导某些趋化基因如CXCL1、CLL17 (胸腺和活化调节的趋化因子[TARC])、CCL19(巨噬细胞炎性蛋白[ΜΙΡ]3β )、CCL22 (单核细胞衍生的趋化因子[MDC])、CCL23 (MIP3)和 CCL4 (MIP β ) (Dillon 等人，2004supra)。
[0007]过度表达IL-31的转基因小鼠表现出皮肤炎症、瘙痒、严重皮炎和脱毛(Dillon等人，2004supra)。对小鼠皮下注射IL-31触发了被炎性细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，并导致表皮增厚和皮肤黑棘。在患有自然原因导致的特异性皮炎(AD)的NC/Nga小鼠中，IL-31在皮肤损伤中过度表达并与瘙痒有关(Takaoka等人，Eur J.Pharmacol.2005;516,180-181 ；Takaoka 等人，Exp.Dermatol.2006;15,161-167)。同样，在小鼠模型中，IL-31已经显示引发了迅速发作的瘙痒(Raap等人，J Allergy ClinImmunol.2008;122(2):421-3)。
[0008]进一步的研究表明，IL-31与特应性皮炎引起的人类的皮肤炎症和瘙痒有关。在人类AD患者中，IL-31mRNA的表达在皮肤损伤中远高于在非皮损皮肤中的表达，并且在非皮损皮肤中的表达远大于在来自健康患者的正常皮肤中的表达(Sonkoly等人，J AllergyClin Immunol2006; 117:411-7)。另一研究已经报道了 AD患者皮肤内的CD45R0+(记忆)皮肤淋巴细胞抗原(CLA))阳性T细胞表达IL-31mRNA和蛋白质(Bilsborough等人，2006supra)。还已经报道了患者皮肤中的IL_31mRNA过度表达或变态反应性接触性皮炎与IL-4和IL-13mRNA表达有关，但是与干扰素(IFN)-YmRNA表达无关(Neis等A, J.Allergy Clin.1mmunol.2006; 118，930-937)。此外，IL-31 血清水平已经显示在患有慢性自发性荨麻疹的人类患者体内提高，在AD患者体内甚至更高(Raap等人，ExpDermatol.2010; 19 (5):464-6)。同样，在人体内已经观察到了 AD的严重程度与血清IL-31水平的相关性(Rapp等人,2008supra)。已经显示了在IgE交联后并在特应性个体中响应于金黄色葡萄球菌超抗原IL-31在肥大细胞中分泌提高。此外，IL-31已经显示了在人结肠肌成纤维细胞中刺激产生几种促炎介质，包括IL-6、IL-8、CXCLl、CC17和多种金属蛋白酶(Yagi 等人，International Journal of Molecular Medicine2007; 19 (6): 941-946)。
[0009]针对环境变应原的I型超敏反应被认为是犬AD的主要机制，并且Th2_介导的细胞因子，如IL-4的水平在患有AD的狗的皮肤损伤中提高(Nuttall等人，Vet.1mmunol.1mmunopathol.2002; 87, 379-384)。此外，infiltration by 炎性细胞、淋巴细胞和中性粒细胞浸润是潜在加重皮肤损伤的重要机制；趋化基因CCL17/TARC、CCR4和CCL28/黏膜相关上皮趋化因子(MEC)的过度表达在患有AD的狗体内导致皮肤损伤加重(参见Maeda 等人，Vet.1mmunol.1mmunopathol.2005; 103,83-92 ； Mae da 等人，Vet.1mmunol.1mmunopathol.2002b; 90，145-154 ;和 Maeda 等人，J.Vet.Med.Sc1.2008; 70，51-55)。
[0010]最近的证据表明，IL-31可能参与促进变态反应性炎症与变态反应性哮喘的呼吸道上皮响应特性(Chattopadhyay 等人，J Biol Chem2007; 282:3014-26 ;和 Wai 等人，Immunology,2007;122,532-541)。
[0011]这些观察结果支持了 IL-31在瘙痒与过敏症中起到显著作用的假说。合意的是提供可用于治疗狗或猫的瘙痒症和/或过敏症的针对IL-31的治疗性抗体。
[0012]发明概述
[0013]在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合到犬IL-31或猫IL-31中的至少一种上的分离的抗体。在一些实施方案中，该抗体是一种单克隆抗体。在一个实施方案中，该单克隆抗体是嵌合的。在另一个实施方案中，该抗体是犬源化的或猫源化的。
[0014]在一些实施方案中，该抗体减轻、抑制或中和狗或猫体内的IL-31活性。在优选的实施方案中，该抗体减轻、抑制或中和瘙痒症或过 敏症。瘙痒症包括例如特异性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒。过敏症包括例如变态反应性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、马喘息病、气道炎症性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺疾病和自身免疫引起的炎症过程，如肠易激综合征(IBS)。
[0015]在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合部分，其包括以下的至少一个:
[0016]具有以下氨基酸序列的可变重(Vh)链互补决定区(OTR) I =YYDIN (SEQID NO:1;11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO:2;19D07-VH-CDR1)或 NYGMS (SEQ IDN0:3;34D03-VH-CDR1)；
[0017]具有以下氨基酸序列的可变重链CDR2:WIFP⑶GGTKYNETFKG (SEQ IDN0:4;11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(SEQ ID NO:5;19D07-VH-CDR2)或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO:6;34D03-VH-CDR2)；
[0018]具有以下氨基酸序列的可变重链CDR3:ARGGTSVIRDAMDY(SEQ IDNO:7; 11E12-VH-CDR3)，ARQNWVVGLAY(SEQ ID NO:8; 19D07-VH-CDR3)或 VRGYGYDTMDY(SEQID N0:9;34D03-VH-CDR3);以及
[0019]其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
[0020]在另一个实施方案中，本发明提供包括下列基团的至少一种的分离的抗体或其抗原结合部分:
[0021]包含具有以下氨基酸序列的互补决定区(OTR) I的可变轻(Vl)链:RASESVDNYGISFMH(SEQ ID NO:10;I1E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ IDN0:11;19D07-VL-CDR1)或 KASQSVSFAGTGLMH(SEQ ID NO:12;34D03-VL-CDR1)；
[0022]具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR2:RASNLE`S(SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2)，GASTRES(SEQ ID NO:14;19D07-VL-CDR2)或 RASNLEA(SEQ ID NO:15;34D03-VL-CDR2)；
[0023]具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR3:QQSNKDPLT(SEQ IDN0:16;11E12-VL-CDR3)， QNDYSYPYT(SEQ ID NO:17;19D07-VL-CDR3)或 QQSREYPWT(SEQ IDN0:18;34D03-VL-CDR3);以及
[0024]其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
[0025]在又一个实施方案中，具有上述可变轻链⑶R的至少一种的抗体可以进一步包括下列可变重链⑶R的至少一种:
[0026]具有以下氨基酸序列的可变重链互补决定区(OTR) I =YYDIN (SEQ IDNO:1;11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO:2;19D07-VH-CDR1)或 NYGMS (SEQ IDN0:3;34D03-VH-CDR1)；
[0027]具有以下氨基酸序列的可变重链CDR2:WIFP⑶GGTKYNETFKG (SEQ IDN0:4;11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(SEQ ID NO:5;19D07-VH-CDR2)或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO:6;34D03-VH-CDR2)；
[0028]具有以下氨基酸序列的可变重链CDR3:ARGGTSVIRDAMDY(SEQ IDNO: 7 ; 11E12-VH-CDR3)，ARQNWVVGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3)或 VRGYGYDTMDY (SEQID N0:9;34D03-VH-CDR3);以及
[0029]其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
[0030]在一些实施方案中，该抗体可以包括下列的至少一种:
[0031]a)可变轻链，包含:
[0032]DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQP PKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQS NKDPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:19;MU-11E12_VL)，
[0033]DI VMTQTPLSLSVSPGEPAS I SCRASESVDNYG I SFMHffYQQKPGQP PKLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQ SNKDPLTFGAGTKLEIK(SEQ IDNO:20;CAN-1IEI2-VL-cUn-Fff2)， DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHffFQQKPGQS PQLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQ SNKDPLTFGAGTKLEIK(SEQ IDN0:21;CAN-llE12-VL-cUn-13)，
[0034]DIVMSQSPSSLSVSAGDKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQK PWQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVY YCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:22;MU-19D07-VL),
[0035]EI VMTQSPASLSLSQEEKVT I TCKSSQSLLNSGNQKNYLAffYQQKPG QAPKLLIYGASTRESGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQ NDYSYPYTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO:23;CAN-19D07-VL-998-1)，DILLTQSPASLAVSLGQRA11SCKASQSVSFAGTGLMHffYQQKPGQQ PKLLIYRASNLEAGVPTRFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQS REYPffTFGGGTKLEIK(SEQ IDN0:24;MU-34D03-VL)，或
[0036]EI VMTQSPASLSLSQEEKVT I TCKASQSVSFAGTGLMHffYQQKPGQ APKLLIYRASNLEAGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQ SREYPffTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO:25;CAN-34D03-VL-998-1)；
[0037]b)可变重链，包含:
[0038]QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFKYYDINWVRQRPEQGL EffIGffIFPGDGGTKYNETFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSA VYFCARGGTSVIRDAMDYffGQGTSVTVSS(SEQ IDN0:26;MU-11E12-VH)，
[0039]EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFKYYDINWVRQAPGAGL DffMGffIFPGDGGTKYNETFKGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRA⑶I AVYYCARGGTSVIRDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27 ；CAN-11E12-VH-415-1)，
[0040]EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQIPEKRLE WVATITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAV YYCARQNffVVGLAYffGQGTLVTVSA (SEQ ID N0:28 ；MU-19D07-VH),
[0041]EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQ WVATITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTA VYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID N0:29 ；CAN-19D07-VH-400-1)，
[0042]EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLE WVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTA MYYCVRGYGYDTMDYffGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:30;MU-34D03-VH)，或
[0043]EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGL QffVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDT AMYYCVRGYGYDTMDYffGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:31;CAN-34D03-VH-568-1);和
[0044]c)其具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
[0045] 在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到SEQ ID NO: 32的犬IL-31氨基酸序列的大约氨基酸残基95位至125位之间的区域或猫IL-31中的相应区域上的单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体特异性结合到SEQ ID NO: 32的犬IL-31氨基酸序列的大约氨基酸残基102位至122位之间的区域或猫IL-31中的相应区域上。
[0046]本发明还提供包括治疗有效量的至少一种上述抗体的兽用组合物。
[0047]在其它实施方案中，本发明提供能产生上述抗体的宿主细胞。
[0048]在再其它实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸包括编码以下至少一种的核酸序列:
[0049]具有以下氨基酸序列的可变重(Vh)链互补决定区(OTR) I =YYDIN (SEQ IDN0:1 ;11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO:2 ; 19D07-VH-CDR1)或 NYGMS(SEQ ID NO: 3 ；34D03-VH-CDR1)；
[0050]具有以下氨基酸序列的可变重链CDR2:WIFP⑶GGTKYNETFKG (SEQ IDN0:4 ；11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(SEQ ID NO: 5 ；19D07-VH-CDR2)或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID N0:6 ;34D03-VH_CDR2)；
[0051]具有以下氨基酸序列的可变重链CDR3:ARGGTSVIRDAMDY(SEQ ID NO:7 ；I IE 12-VH-CDR3)，ARQNWVVGLAY (SEQ ID NO: 8 ; 19D07-VH-CDR3)或 VRGYGYDTMDY (SEQ IDNO: 9 ;34D03-VH-CDR3);以及
[0052]其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
[0053]在进一步实施方案中，上述分离的核酸可以进一步包括编码下列至少一种的核酸序列:
[0054]包含具有以下氨基酸序列的互补决定区(OTR) I的可变轻(Vl)链:RASESVDNYGISFMH(SEQ ID NO:10 ;11E12-VL_CDR1)，KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:11 ；19D07-VL-CDR1)或 KASQSVSFAGTGLMH(SEQ ID NO:12 ;34D03-VL_CDR1)；
`[0055]具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR2:RASNLES(SEQ ID NO: 13 ;11E12-VL_CDR2)，GASTRES(SEQ ID NO:14 ;19D07-VL_CDR2)或 RASNLEA(SEQ ID NO:15 ;34D03-VL_CDR2)；
[0056]具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR3:QQSNKDPLT(SEQ ID NO: 16 ；11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17 ; 19D07-VL-CDR3)或QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18 ；34D03-VL-CDR3);以及
[0057]其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
[0058]本发明进一步提供包括至少一种上述核酸的载体。
[0059]在其它实施方案中，本发明提供了制造抗体的方法，包括在导致产生该抗体的条件下培养上述宿主细胞，并从该宿主细胞或该宿主细胞的培养介质中分离该抗体。
[0060]还提供了治疗症状或疾病的方法，所述症状或疾病选自瘙痒症或过敏症，包括施用治疗有效量的上述抗体。在一些实施方案中，该瘙痒症选自特异性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒。在其它实施方案中，待治疗的过敏症至选自变态反应性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、马喘息病、气道炎症性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺疾病和自身免疫引起的炎症过程，如肠易激综合征(IBS)。
[0061]进一步提供了通过施用上述抗体抑制狗或猫体内的IL-31活性的方法。
[0062]还提供了检测或定量样品中IL-31的方法，该方法包括在上述抗体的存在下培养含有IL-31的临床或生物样品；并检测结合到样品中的IL-31上的抗体。在一个实施方案中，可检测地标记该抗体。在另一个实施方案中，该抗体是未标记的，并与标记过的第二抗体组合使用。[0063]附图概述
[0064]图1是IL-31途径(pathway)的示意图。
[0065]图2是突出抗原结合位点的小鼠免疫球蛋白G(IgG)分子的一般结构的示意图。
[0066]图3是小鼠:犬嵌合IgG的一般结构的示意图。
[0067]图4是显示小鼠IgG的形态或“犬源化”的图解，小鼠⑶R接枝到由序列数据库识别的犬框架上。
[0068]图5是配对具有完全犬源化重链的嵌合轻链的“杂源嵌合(heterochimeric) ”单克隆抗体的图解。
[0069]图6相对于预先放血和阳性的对照物小鼠的来自IL-31免疫小鼠(CF_1MU#1 - 4)的 ELISA Titers0
[0070]图7是显示对恒定区的引物和指向小鼠可变区的简并引物的抗体可变链的图解。
[0071]图8是安慰剂对照、单剂量、SC研究(76A60)中嵌合11E12的药效试验的图。
[0072]图9是显示研究76A60中登记的狗的个体瘙痒评分的表。
[0073]图10是显示11E12的嵌合的(Blot#l)、犬源化的(Blot#2)和杂源嵌合的(Blots#3和4)版本结合到犬IL-31的Western蛋白质印迹。Blot#3中的杂源嵌合体(heterochimera)具有与嵌合重链配对的犬源化轻链。Blot#4中的杂源嵌合体具有与犬源化重链配对的嵌合轻链。各硝化纤维素印迹含有预染蛋白质标准品(Seeblueplus2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)(左泳道)和 800ng 的犬 IL-31 (右泳道)。
[0074]图11是犬源化11E12轻链框架替换工作的示意图。
[0075]图12是显示具有单一回复突变的11E12的犬源化版本结合到小鼠框架2轻链残基上的Western蛋白质印迹。各硝化纤维素印迹含有预染蛋白质标准品(Seeblueplus2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)(左泳道)和 800ng 的犬 IL-31 (右泳道)。
[0076]图13是采用全长和截短的犬IL-31蛋白质的Western蛋白质印迹。个体硝化纤维素印迹用A)抗-His B)34D03和C)11E12抗体探测。印迹的泳道1_9对应如下:泳道I——
预染蛋白质标准品(Seeblue plus2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA);泳道 2-全长犬
IL-31 ;泳道3——N-末端截短-20N ;泳道4——N-末端截短-40N ;泳道5——N-末端截短-60N ;泳道6——C-末端截短-20C ;泳道7——C-末端截短-40C ;泳道8——C-末端截短-60C ;和泳道9——β -半乳糖苷酶(1acZ)。注意:全长IL-31和具有C-末端截短的蛋白质(_20、_40C和-60C)在这些条件下没有显示可检测的表达。
[0077]图14是采用截短的犬IL-31蛋白质的Western蛋白质印迹。个体硝化纤维素印迹用A)抗-His、B) 11E12和C) 34D03抗体探测。印迹的泳道1_5对应如下:泳道1——预染
蛋白质标准品(Seeblue plus2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA);泳道2-在 20-122 位
置处的C-末端截短；泳道3—在位置20-100处的C-末端截短；泳道4—在位置20-80处的C-末端截短；和泳道5-β -半乳糖苷酶(IacZ)。
[0078]图15是采用表达具有替换各氨基酸位置(76-122)的丙氨酸的犬IL-31的大肠杆菌(E.coli)菌株的裂解物的Western蛋白质印迹片段。如图中所示,个体硝化纤维素印迹用抗-His、llE12和34D03抗体探测。
[0079]图16是在犬IL-31中具有双重和三重突变的Western蛋白质印迹的片段。-20N蛋白质裂解物作为阳性对照物运行。[0080]图17是显示皮下注射犬源化的34D03抗体(1.0mg/kg)的狗的瘙痒评分的图。在用1.5 μ g/kg犬IL-31激发的前一天(基线响应)和后一天(2h响应)对每次研究测量瘙痒评分。
[0081]图18是含有提纯的犬和猫IL-31蛋白质的4_12%Bis Tris SDS PAGE。板A显示了在还原性条件下运行的蛋白质的考马斯亮蓝染色。板B显示了在非还原性条件下运行的蛋白质的考马斯亮蓝染色。板C和D是分别与A和B相同的凝胶的Western蛋白质印迹，用抗-His抗体探测。泳道I—犬IL-31 ;泳道2—猫IL-31 ;泳道3——预染蛋白质标准
品(Seeblue plus2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA);泳道 4-犬 IL-31 ;和泳道 5-
猫 IL_31。 [0082]图19是大肠杆菌(E.coli)中制造的犬和猫IL-31诱导的在犬DH-82单核细胞中的pSTAT信令的图。犬IL-31(CH0)是用于所有先前的基于细胞的测定，狗瘙痒模型和作为抗体初步鉴定的免疫原的参比蛋白质。
[0083]图20是显示在涉及11E12和34D03抗体(用加号标注)的结合的区域中猫与犬IL-31之间的序列保守性的对比。
[0084]图21是采用IL-31蛋白质的Western蛋白质印迹。个体硝化纤维素印迹用A)抗-把8、8)1比12和034003抗体探测。注意:犬IL-31 (CHO)不含6_His tag。
[0085]图22是比较猫源化和犬源化抗体34D03的显示犬DH82单核细胞中pSTAT信令引发的犬IL-31抑制的图。
[0086]图23是用猫源化抗体34D03探测的在还原性条件下猫和犬IL-31的Western蛋白质印迹。
[0087]序列概述
[0088]SEQ ID NO:1是在本文中称为11E12-VH-CDR1的可变重链CDRl ；
[0089]SEQ ID N0:2是在本文中称为19D07-VH-CDR1的可变重链CDRl ；
[0090]SEQ ID NO: 3是在本文中称为34D03-VH-CDR1的可变重链CDRl ；
[0091]SEQ ID N0:4是在本文中称为11E12-VH-CDR2的可变重链CDR2 ；
[0092]SEQ ID NO: 5是在本文中称为19D07-VH-CDR2的可变重链CDR2 ；
[0093]SEQ ID NO:6是在本文中称为34D03-VH-CDR2的可变重链CDR2 ；
[0094]SEQ ID N0:7是在本文中称为11E12-VH-CDR3的可变重链CDR3 ；
[0095]SEQ ID N0:8是在本文中称为19D07-VH-CDR3的可变重链CDR3 ；
[0096]SEQ ID NO:9是在本文中称为34D03-VH-CDR3的可变重链CDR3 ；
[0097]SEQ ID NO: 10是在本文中称为11E12-VL-CDR1的可变轻链CDRl ；
[0098]SEQ ID NO: 11是在本文中称为19D07-VL-CDR1的可变轻链CDRl ；
[0099]SEQ ID NO: 12是在本文中称为34D03-VL-CDR1的可变轻链CDRl ；
[0100]SEQ ID NO: 13是在本文中称为11E12-VL-CDR2的可变轻链CDR2 ；
[0101]SEQ ID NO: 14是在本文中称为19D07-VL-CDR2的可变轻链CDR2 ；
[0102]SEQ ID NO: 15是在本文中称为34D03-VL-CDR2的可变轻链CDR2 ；
[0103]SEQ ID NO: 16是在本文中称为11E12-VL-CDR3的可变轻链CDR2 ；
[0104]SEQ ID NO: 17是在本文中称为19D07-VL-CDR3的可变轻链CDR3 ；
[0105]SEQ ID NO: 18是在本文中称为34D03-VL-CDR3的可变轻链CDR3 ；[0106]SEQ ID NO: 19是在本文中称为MU-11E12-VL的可变轻链序列；
[0107]SEQ ID NO:20是在本文中称为CAN-llE12-VL-cUn_FW2的可变轻链序列；
[0108]SEQ ID NO:21是在本文中称为CAN-llE12-VL-cUn_13的可变轻链序列；
[0109]SEQ ID NO:22是在本文中称为MU-19D07-VL的可变轻链序列；
[0110]SEQ ID NO:23是在本文中称为CAN-19D07-VL-998-1的可变轻链序列；
[0111]SEQ ID NO:24是在本文中称为MU-34D03-VL的可变轻链序列；
[0112]SEQ ID NO:25是在本文中称为CAN-34D03-VL-998-1的可变轻链序列；
[0113]SEQ ID NO:26是在本文中称为MU-11E12-VH的可变重链序列；
[0114]SEQ ID NO:27是在本文中称为CAN-11E12-VH-415-1的可变重链序列；
[0115]SEQ ID NO:28是在本文中称为MU-19D07-VH的可变重链序列；
[0116]SEQ ID NO:29是在本文中称为CAN-19D07-VH-400-1的可变重链序列；
[0117]SEQ ID NO:30是在本文中称为MU-34D03-VH的可变重链序列；
[0118]SEQ ID NO:31是在本文中称为CAN-34D03-VH-568-1的可变重链序列；
[0119]SEQ ID NO: 32是对应GenBank登录号C7G0W1的氨基酸序列并相应于犬IL-31全长蛋白质；
[0120]SEQ ID NO: 33是对应GenBank登录号C7G0W1的核苷酸序列并相应于该核苷酸序列编码的犬IL-31全长蛋白质；
[0121]SEQ ID NO:34是编码在本文中称为MU-11E12-VL的可变轻链序列的核苷酸序列；
[0122]SEQ ID NO:35是编码在本文中称为MU-11E12-VH的可变重链序列的核苷酸序列；
[0123]SEQ ID NO:36是编码在本文中称为MU-19D07-VL的可变轻链序列的核苷酸序列；
[0124]SEQ ID NO:37是编码在本文中称为MU-19D07-VH的可变重链序列的核苷酸序列；
[0125]SEQ ID NO:38是编码在本文中称为MU-34D03-VL的可变轻链序的核苷酸序列；
[0126]SEQ ID NO:39是编码在本文中称为MU-34D03-VH的可变重链序列的核苷酸序列；
[0127]SEQ ID NO:40是在本文中称为HC-64的犬重链恒定区的氨基酸序列(GenBank登录号 AF354264)；
[0128]SEQ ID NO:41是编码在本文中称为HC-64的犬重链恒定区的核苷酸序列(GenBank 登录号 AF354264)；
[0129]SEQ ID NO:42是在本文中称为HC-65的犬重链恒定区的氨基酸序列(GenBank登录号 AF354265)；
[0130]SEQ ID N0:43是编码在本文中称为HC-65的犬重链恒定区的核苷酸序列(GenBank 登录号 AF354265)；
[0131]SEQ ID NO:44是在本文中称为kappa的犬轻链恒定区的氨基酸序列(GenBank登录号 XP_532962)；
[0132]SEQ ID NO:45是编码称为kappa的犬轻链恒定区的核苷酸序列(GenBank登录号XP_532962)；
[0133]SEQ ID NO:46是编码在本文中称为CAN-19D07-VL-998-1的可变轻链序列的核苷酸序列；
[0134]SEQ ID NO:47是编码在本文中称为CAN-19D07-VH-998-1的可变重链序列的核苷酸序列；
【权利要求】
1.特异性结合到犬IL-31或猫IL-31中的至少一种上的分离的抗体。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求2的抗体，其中所述抗体是嵌合的。
4.权利要求2的抗体，其中所述抗体是犬源化的或猫源化的。
5.权利要求1至4中任一项的抗体，其中所述抗体减轻、抑制或中和狗或猫体内的IL-31活性。
6.权利要求5的抗体，其中所述抗体减轻、抑制或中和瘙痒症或过敏症。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其包含以下的至少一个: 具有以下氨基酸序列的可变重(Vh)链互补决定区(⑶R)1 =YYDIN (SEQ ID NO:1 ；11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO: 2 ；19D07-VH-CDR1)或 NYGMS(SEQ ID N0:3 ；34D03-VH-CDR1)； 具有以下氨基酸序列的可变重链⑶R2:WIFP⑶GGTKYNETFKG(SEQ ID NO:4 ；11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(SEQ ID NO: 5 ； 19D07-VH-CDR2)或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID N0:6 ;34D03-VH_CDR2)； 具有以下氨基酸序列的可变重链⑶R3:ARGGTSVIRDAMDY(SEQ ID NO:7 ；11E12-VH-CDR3)，ARQNWWGLAY(SEQ ID NO:8 ; 19D07-VH-CDR3)或 VRGYGYDTMDY(SEQ IDNO: 9 ;34D03-VH-CDR3);以及 其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
8.如权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，包含以下的至少一个: 包含具有以下氨基酸序列的互补决定区(CDR) I的可变轻(\)链:RASESVDNYGISFMH(SEQ ID NO:10 ;11E12-VL_CDR1)， KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:11;19D07-VL-CDR1)或 KASQSVSFAGTGLMH(SEQ ID NO:12 ;34D03-VL_CDR1)； 具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR2:RASNLES(SEQ ID NO: 13 ；11E12-VL-CDR2),GASTRES(SEQ ID NO:14 ; 19D07-VL-CDR2)或 RASNLEA(SEQ ID NO:15 ;34D03-VL_CDR2)； 具有以下氨基酸序列的可变轻链⑶R3:QQSNKDPLT(SEQ ID NO: 16 ;11E12-VL_CDR3)，QNDYSYPYT(SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3)或QQSREYPWT(SEQ ID NO: 18 ;34D03-VL_CDR3)；以及 其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
9.权利要求8的抗体，进一步包括以下的至少一个: 具有以下氨基酸序列的可变重链互补决定区(CDR) I =YYDIN(SEQ ID NO:1 ；11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO: 2 ；19D07-VH-CDR1)或 NYGMS(SEQ ID NO:3 ；34D03-VH-CDR1)； 具有以下氨基酸序列的可变重链⑶R2:WIFP⑶GGTKYNETFKG(SEQ ID NO:4 ；11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(SEQ ID NO: 5 ； 19D07-VH-CDR2)或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO:6 ;34D03-VH_CDR2)； 具有以下氨基酸序列的可变重链⑶R3:ARGGTSVIRDAMDY(SEQ ID NO:7 ；11E12-VH-CDR3)，ARQNWWGLAY(SEQ ID NO:8 ;19D07-VH_CDR3)或 VRGYGYDTMDY(SEQ IDN0:9 ;34D03-VH-CDR3);以及 其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
10.权利要求9的抗体，包含以下的至少一个: a)可变轻链,包含:
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLL IYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKDPLTFG AGTKLELK(SEQ ID NO: 19 ;MU-11E12_VL)，DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLL IYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTF GAGTKLEIK (SEQ ID NO:20 ；CAN-llE12-VL-cUn-FW2),DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWFQQKPGQSPQLLI YRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTF GAGTKLEIK(SEQ ID NO:21 ；CAN-llE12-VL-cUn-13),DIVMSQSPSSLSVSAGDKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPWQP PKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSY PYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:22 ；MU-19D07-VL),
EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQAP KLLIYGASTRESGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQNDYSYPY TFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:23 ；CAN-19D07-VL-998-l),DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLL IYRASNLEAGVPTRFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPffTF GGGTKLEIK(SEQ ID NO:24 ;MU-34D03_VL)，或
EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKL LIYRASNLEAGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTF GQGTKLEIK(SEQ ID NO:25 ；CAN-34D03-VL-998-l)； b)可变重链,包含:QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFKYYDINWVRQRPEQGLEWIG WIFP⑶GGTKYNETFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARG GTSVIRDAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:26 ;MU-11E12_VH)，EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFKYYDINWVRQAPGAGLDWM GffIFPGDGGTKYNETFKGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRAGDIAVYYCAR GGTSVIRDAMDYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27;CAN-11E12-VH-415-1)，
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQIPEKRLEWVAT ITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCARQN WVVGLAYffGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:28 ；MU-19D07-VH),EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQWVA TITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQ NffVVGLAYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29 ；CAN-19D07-VH-400-1)， EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVA TISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRG YGYDTMDYffGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:30 ；MU-34D03-VH)，或 EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVA TISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRG YGYDTMDYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:31;CAN-34D03-VH-568-1);和 c)其具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
11.包含治疗有效量的如权利要求1至10中任一项所述的抗体的兽用组合物。
12.制造如权利要求1至10中任一项所述的抗体的宿主细胞。
13.包含编码下列至少一种的核酸序列的分离的核酸: 具有以下氨基酸序列的可变重(Vh)链互补决定区(⑶R)1 =YYDIN(SEQ ID NO:1 ；11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO: 2 ；19D07-VH-CDR1)或 NYGMS(SEQ ID N0:3 ；34D03-VH-CDR1)； 具有以下氨基酸序列的可变重链⑶R2:WIFP⑶GGTKYNETFKG(SEQ ID NO:4 ；11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(SEQ ID NO: 5 ； 19D07-VH-CDR2)或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID N0:6 ;34D03-VH_CDR2)； 具有以下氨基酸序列的可变重链⑶R3:ARGGTSVIRDAMDY(SEQ ID NO:7 ；11E12-VH-CDR3)，ARQNWWGLAY(SEQ ID N0:8 ;19D07-VH_CDR3)或 VRGYGYDTMDY(SEQ IDN0:9 ;34D03-VH-CDR3);以及 其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
14.权利要求13的核酸，进一步包含编码下列至少一种的核酸序列: 包含具有以下氨基酸序列的互补决定区(CDR) I的可变轻(')链:RASESVDNYGISFMH(SEQ ID NO:10 ;11E12-VL_CDR1)，KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:11 ；19D07-VL-CDR1)或 KASQSVSFAGTGLMH(SEQ ID NO:12 ;34D03-VL_CDR1)； 具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR2:RASNLES(SEQ ID NO: 13 ;11E12-VL_CDR2)，GASTRES(SEQ ID NO:14 ; 19D07-VL-CDR2)或 RASNLEA(SEQ ID NO: 15 ;34D03-VL_CDR2)；具有以下氨基酸序列的可变轻链⑶R3:QQSNKDPLT(SEQ ID NO: 16 ;11E12-VL_CDR3)，QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17 ; 19D07-VL-CDR3)或QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18 ;34D03-VL_CDR3)；以及 其在⑶Rl、⑶R2或⑶R3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。
15.包含权利要求13或权利`要求14的核酸的载体。
16.制造抗体的方法，包括在导致产生该抗体的条件下培养权利要求12的宿主细胞，并从该宿主细胞或该宿主细胞的培养介质中分离该抗体。
17.治疗症状或疾病的方法，所述症状或疾病选自瘙痒症或过敏症，包括施用治疗有效量的如权利要求1至10中任一项所述的抗体。
18.权利要求17的方法，其中所述瘙痒症选自特异性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒。
19.权利要求17的方法，其中所述过敏症选自变态反应性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、马喘息病、气道炎症性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺疾病和自身免疫引起的炎症过程。
20.通过使用如权利要求1至10中任一项所述的抗体抑制狗或猫体内的IL-31活性的方法。
21.检测或定量样品中IL-31的方法，该方法包括: (a)在如权利要求1至10中任一项所述的抗体的存在下培养含有IL-31的临床或生物样品；并 (b)检测结合到该样品中的IL-31上的抗体。
22.权利要求21的方法，其中可检测地标记所述抗体。
23.权利要求21的方法，其中所述抗体是未标记的，并与标记过的第二抗体组合使用。
24.如权利要求1至10中任一项所述的抗体，其特异性结合到SEQID NO:32的犬IL-31氨基酸序列的大约氨基酸残基95位至125位之间的区域或猫IL-31中的相应区域上。
25.权利要求24的抗体，其中该抗体特异性结合到SEQ ID NO: 32的犬IL-31氨基酸序列的大约氨基酸残基102位至12 2位之间的区域或猫IL-31中的相应区域上。
【文档编号】C07K16/24GK103890009SQ201280046131
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年7月5日 优先权日:2011年7月21日
【发明者】G.F.巴莫特, S.A.敦哈姆 申请人:佐蒂斯有限责任公司