ALL预后相关基因突变检测方法、引物及试剂盒与流程

本发明属于医学及分子生物学技术领域，具体涉及一种ALL(Acute Lymphoblastic Leukemia，急性淋巴细胞白血病)预后相关基因突变检测方法。本发明还提供了该检测方法所使用的引物以及包含该引物的试剂盒。

背景技术：

ALL是一种起源于B系或T系淋巴祖细胞的肿瘤性疾病，原始细胞在骨髓异常增生和聚集并抑制正常造血，导致贫血，血小板减少和中性粒细胞减少；原始细胞也可侵及髓外组织，如脑膜、性腺，胸腺、肝、脾，或淋巴结等，引起相应病变。2008年WHO对ALL的诊断标准是：细胞形态、免疫表型，骨髓原始及幼稚淋巴细胞≥20％，分类为：①前体B细胞急性淋巴细胞白血病(细胞遗传学亚型)：t(9；22)(q34；q11)，(BCR/ABL)；t(4；11q23)，(MLL重排)；t(1；19)(q23；p13)，(E2A/PBX1)；t(12；21)(p12；q22)，(ETV/CBFα)；②前体T细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)；③Burkitt细胞白血病。

虽然ALL治愈率提高到了90％，但该病一旦复发，其结果常常是致命的。ALL的复发率高，成人相对于儿童预后不良，应依据疾病危险分组进行个体化治疗，防治感染和出血，以减少复发，延长无病生存时间，因此对ALL的复发及用药指导非常重要。CREBBP基因编码转录共激活因子乙酰转移酶CREB结合蛋白，在正常血细胞发育中起着重要作用，帮助开启和关闭其他基因，St.Jude儿童研究医院的研究人员称，该基因是复发危险的潜在指示器，因为复发患者的CREBBP基因突变频率高，而且诊断时就存在的那些变化或复发时白血病细胞亚群所出现的变化从一开始就持续存在着。研究人员还发现，基因的重要调节区会发生变化，并且这些变化会影响细胞功能，比如影响癌症细胞对类固醇类药物的反应，这点在癌症治疗中具有重要意义。综上所述，CREBBP基因有助于癌症病毒对类固醇类药物治疗产生抑制作用，从而助长ALL的复发。

鉴于CREBBP基因在ALL患者及正常组织中的表达特点，其基因突变情况可能为ALL复发及用药指导提供重要的分析依据，通过分析CREBBP基因相关突变进行ALL预后评估是具有前景的技术研究方向。因此，如何快速全面的获得检测对象ALL预后CREBBP基因的突变数据，成为当前需要解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明针对当前ALL预后评估的检测技术存在的准确率和便捷性不足的问题，提供了一种新的ALL预后相关基因突变检测方法及相应的引物和试剂盒，综合应用PCR扩增和基因测序技术，可准确快速的检测出检测对象ALL预后相关的CREBBP基因的突变情况，为ALL预后评估提供分析依据。

本发明实施例一种ALL预后相关基因突变检测方法，包括步骤如下：

S1.提取基因组DNA检测样本：采集血液，提取其中的基因组DNA作为检测样本；

S2.进行PCR扩增：使用特异性引物对所述检测样本中所述包含热点突变的CREBBP外显子(Expressed Region,Exon)区段的DNA分别进行PCR扩增，回收扩增产物；

S3.扩增产物测序：对S2中获得的所述扩增产物进行测序，得到测序结果；

S4.基因突变比对：将所述测序结果与数据库中公开的对应基因序列进行比对，获取基因突变检测结果；

其中，所述包含热点突变的CREBBP基因外显子包括：第25号、第26号、第27号和第28号外显子。

优选的，与所述包含热点突变的CREBBP基因外显子区段对应的特异性引物在序列表中分别为：

CREBBP基因外显子：

第25号 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；

第26号 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；

第27号 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；

第28号 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18。

优选的，所述包含热点突变的CREBBP基因外显子还包括：第4号、第6号、第10号、第14号、第16号、第31a号、第31b号、第31c号和第31d号外显子。

进一步优选的，与所述包含热点突变的CREBBP基因外显子区段对应的特异性引物在序列表中分别为：

CREBBP基因外显子：

第4号 上游引物：SEQ ID NO.1下游引物：SEQ ID NO.2；

第6号 上游引物：SEQ ID NO.3下游引物：SEQ ID NO.4；

第10号 上游引物：SEQ ID NO.5下游引物：SEQ ID NO.6；

第14号 上游引物：SEQ ID NO.7下游引物：SEQ ID NO.8；

第16号 上游引物：SEQ ID NO.9下游引物：SEQ ID NO.10；

第25号 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；

第26号 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；

第27号 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；

第28号 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18；

第31a号 上游引物：SEQ ID NO.19下游引物：SEQ ID NO.20；

第31b号 上游引物：SEQ ID NO.21下游引物：SEQ ID NO.22；

第31c号 上游引物：SEQ ID NO.23下游引物：SEQ ID NO.24；

第31d号 上游引物：SEQ ID NO.25下游引物：SEQ ID NO.26。

对步骤S1优选的，采集浓度为50～100ng/μL的DNA溶液50μL，使用所述特异性引物配制引物浓度为5pmol/μL的引物使用液用于PCR扩增。

优选的，执行所述步骤S3前对所述扩增产物进行电泳检测。

对步骤S3优选的，使用3500XL测序仪对所述扩增产物进行上机测序；对步骤S3优选的，使用Mutation Surveyor软件和VECTOR NTI软件将所述测序结果与NCBI数据库中序列进行比对分析，寻找发生突变的基因位点，获得所述基因突变检测结果。

本发明实施例还提供了一种用于前述ALL预后相关基因突变检测方法的引物，包括多对特异性引物，每对所述特异性引物均包括一上游引物和一下游引物，每对所述特异性引物均对应一个所述包含热点突变的CREBBP基因外显子区段，所述特异性引物在序列表中的序列分别为：

CREBBP基因外显子：

第25号 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；

第26号 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；

第27号 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；

第28号 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18。

优选的，所述引物进一步包括的特异性引物在序列表中的序列分别为：

CREBBP基因外显子：

第4号 上游引物：SEQ ID NO.1下游引物：SEQ ID NO.2；

第6号 上游引物：SEQ ID NO.3下游引物：SEQ ID NO.4；

第10号 上游引物：SEQ ID NO.5下游引物：SEQ ID NO.6；

第14号 上游引物：SEQ ID NO.7下游引物：SEQ ID NO.8；

第16号 上游引物：SEQ ID NO.9下游引物：SEQ ID NO.10；

第31a号 上游引物：SEQ ID NO.19下游引物：SEQ ID NO.20；

第31b号 上游引物：SEQ ID NO.21下游引物：SEQ ID NO.22；

第31c号 上游引物：SEQ ID NO.23下游引物：SEQ ID NO.24；

第31d号 上游引物：SEQ ID NO.25下游引物：SEQ ID NO.26。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，其试剂包含了前述用于所述的ALL预后相关基因突变检测方法的引物。

本发明应用PCR和测序两项技术，主要通过特异性引物扩增基因组DNA中的CREBBP基因的特定外显子区段，通过测序反应对扩增所得到的目的片段进行测序，再通过与标准基因序列进行比较，检测是否存在突变；其有益效果如下：

1.检测过程快速灵敏，操作简单且准确性高，检测结果明确清晰；

2.检测特异性强，采用目前最准确的基因突变检测方法，目的性强；

3.检测标本采血量少，利于检测对象自身，使用的实验器材较少，节约成本。

附图说明

图1为本发明ALL预后相关基因突变检测方法的基本流程图；

图2为本发明实施例中CREBBP基因第4号外显子突变分析结果；

图3为本发明实施例中CREBBP基因第6号外显子突变分析结果；

图4为本发明实施例中CREBBP基因第10号外显子突变分析结果；

图5为本发明实施例中CREBBP基因第14号外显子突变分析结果；

图6为本发明实施例中CREBBP基因第16号外显子突变分析结果；

图7为本发明实施例中CREBBP基因第25号外显子突变分析结果；

图8为本发明实施例中CREBBP基因第26号外显子突变分析结果；

图9为本发明实施例中CREBBP基因第27号外显子突变分析结果；

图10为本发明实施例中CREBBP基因第28号外显子突变分析结果；

图11为本发明实施例中CREBBP基因第31号外显子突变分析结果，包括31a、31b、31c和31d。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明针对当前ALL预后评估的检测技术存在的准确率和便捷性不足的问题，提供了一种新的ALL预后相关基因突变检测方法及相应的引物和试剂盒，综合应用了PCR扩增和基因测序技术。

本发明的一个实施例提供了一种ALL预后相关基因突变检测方法，如图1所示，包括以下步骤：

S1.提取基因组DNA检测样本：采集血液，提取其中的基因组DNA作为检测样本；

S2.进行PCR扩增：使用特异性引物对所述检测样本中包含热点突变的CREBBP基因外显子区段的DNA分别进行PCR扩增，回收扩增产物；包含热点突变的CREBBP基因外显子包括第25至28号，作为优选，还可以进一步包括第4、6、10、14、16和31a至31d号；

S3.扩增产物测序：对S2中获得的所述扩增产物进行测序，得到测序结果；

S4.基因突变比对：将所述测序结果与数据库中公开的对应基因序列进行比对，获取基因突变检测结果。

本实施例中，CREBBP基因的基因序列来源于NCBI(美国国家生物技术信息中心)基因库，其NCBI序列号为NG_009873.1，染色体定位为16p13.3。

CREBBP基因突变见于约19％的复发ALL，特别易见于复发的超二倍体ALL，该突变可削弱组蛋白乙酰化作用和对CREBBP靶基因的转录调控，包括糖皮质激素反应基因。热点突变区域位于组蛋白乙酰转移酶(HAT)结构域，CREBBP基因突变者对激素疗效差可能是ALL复发的原因，用组蛋白去乙酰基酶抑制剂可能有效。

具体的实施方式如下：

步骤S1中，采集临床标本确诊的ALL患者的血液，提取其中的基因组DNA；提取基因组DNA可使用常规的试剂盒柱提法，按照所用试剂盒的说明书进行操作，收集到50μL浓度为50～100ng/μL的DNA溶液，可直接用于检测或在-20℃下保存；

步骤S2中，使用所述试剂盒中的特异性引物配制溶液，其中特异性引物浓度为5pmol/μL；每对所述特异性引物均包括一条上游引物和一条下游引物，用于对与其对应的包含热点突变的CREBBP基因外显子特定区段分别进行PCR扩增，引物序列及扩增对应的外显子具体见下表1：

在满足PCR引物的设计要求的前提下，特异性引物可根据引物设计原理，设计为不同的序列；

步骤S2中可使用上表中第11至18号引物对相应的CREBBP基因第25至28号外显子特定区段的DNA分别进行扩增；作为优选的实施方式，使用上表中全部引物，对相应的CREBBP基因第4、6、10、14、16、25至28、31a至31d号外显子特定区段的DNA分别进行扩增，可获得更全面的检测结果；

步骤S3中，进行PCR扩增的扩增反应体系见下表2：

使用的特异性引物序列参见上表1，PCR扩增可使用普通PCR仪，扩增反应程序见下表3：

为保证PCR扩增结果，可在测序前先对PCR扩增产物进行电泳检测，空白对照为无扩增条带，如样本条带大小正确(参照上表1中记载的扩增产物大小)且条带单一，即可将PCR扩增产物送检测序；

步骤S3中，使用3500XL测序仪，依常规操作方法，对PCR扩增产物进行上机测序；

步骤S4中，使用Mutation Surveyor软件和VECTOR NTI软件对PCR扩增产物测序所得待测序列与NCBI数据库中序列进行比对分析，寻找基因突变位点，获得检测结果。

如图2至图11所示为采用本实施例检测方法对一病例进行检测得到的ALL预后CREBBP基因突变的分析谱图，根据图示结果，若存在一个杂合点突变，如CREBBP P928，则该对应位置会出现两个峰，如下图所示。

通过对上述基因突变检测结果的进一步分析，可以对ALL患者的预后进行评估。

本发明的另一实施例还提供了前述技术方案所述的ALL预后相关基因突变检测方法中所使用的引物，所述引物包括多对特异性引物，具体序列参见上表1；作为不同的实施方式，所述引物可包括表1中第11至18号共四对特异性引物，也可以包括表1中全部十三对特异性引物，用于扩增对应的CREBBP基因不同数量的外显子区段。

本发明的另一实施例还提供了包含前述技术方案所述的引物的试剂盒。

本发明旨在通过对CREBBP基因突变的准确检测获得可供急性淋巴细胞白血病用药指导及预后评估的分析数据，对急性淋巴细胞白血病用药指导和预后评估具有特异性的指导意义，属于目前最先进的诊疗手段，可在医学检测领域发挥重大的作用。

应理解，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于供本领域技术人员了解本发明的内容并据以实施，并非具体实施方式的穷举，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。