本申请要求美国临时申请序列号62/238,054的权益，通过引用将其结合在此。
技术领域：
：提供了从乙酰微小杆菌(ExiguobacteriumAcetylicum)分离的和/或纯化的α-葡聚糖转移酶、其重组工程化变体、其活性片段；编码所述α-葡聚糖转移酶的合成核酸及其变体；包含所述合成核酸的宿主细胞；以及包含所述α-葡聚糖转移酶的组合物。使用这些组合物的方法包括制造低聚糖。序列表：附加了包含SEQIDNO:1-13的序列表，并且将该序列表以其全文通过引用结合在此。
背景技术：
：：由于其有益的健康效应，异麦芽低聚糖(IMO)型的葡萄糖低聚糖(GOS)受到越来越多的关注[VitaFiberTM-IMO](1)。IMO是由具有α-(1→6)糖苷键的葡萄糖单元组成的葡萄糖低聚糖(但取决于IMO制造方式)，除了α-1,6连接的葡萄糖单元外，它们可能还含有另外的糖苷键，如α-1,3和α-1,4。异麦芽低聚糖可以通过不同的酶进行酶促产生。商业IMO主要使用来源于淀粉水解的麦芽糖糊精作为原料(2)从真菌糖基转移酶获得。另一种获得IMO的方法是用葡聚糖酶(3)水解葡聚糖。葡聚糖蔗糖酶(GTF)是细胞外酶，历史上它们因其从蔗糖合成多种α-葡聚糖多糖(如葡聚糖、变聚糖、交替糖(alternan)和罗伊氏糖(reuteran))的能力而为人所知(4)(5)，并且在适当的受体存在下，可以合成各种低聚糖，如潘糖低聚糖系列和异麦芽低聚糖系列(6)(7)(8)。与GH13的淀粉酶一起，GH70的葡聚糖蔗糖酶属于GH-H族，其含有(β/α)8筒结构。然而，GH70酶具有环形排列的(β/α)8催化结构域(9)。此外，在α-淀粉酶家族GH13成员中鉴定的四个保守区域(区域I至IV)存在于GH70酶中，但作为该环形排列的结果，区域I在GH70酶中的区域II至IV的C-末端出现。GH70成员可以分为三个不同的亚家族，如针对大的GH13家族所做的那样(10)，其中所有三个亚家族仅在乳酸菌中发现(图1A)：1)使用蔗糖为底物合成α-葡聚糖聚合物的常见的GH70GTF，(4)(5)2)使用蔗糖作为供体和葡聚糖作为受体在葡聚糖骨架中引入α-1,2和α-1,3分支而分支的GH70GTF(CBM11pers.comm.M.Remaud-Simeon)，(11)(12)3)使用MOS和淀粉作为底物引入α-(1→6)糖苷键的4,6-α-Gt，(13)(14)(15)GH70亚家族1是使用蔗糖合成各种α-葡聚糖聚合物的常见GH70酶。根据具有各种键类型的葡聚糖酶，合成支链和分子量(4)(5)。GH70亚家族2具有通过引入α-1,2和α-1,3分支来修饰葡聚糖骨架的能力(11)(12)。GH70亚家族3(4,6-α-GT酶)由MOS合成，该MOS为线性IMO-MALT，其由与α-(1→4)连接的葡萄糖单元的α-糖基偶联的α-(1→6)连接的葡萄糖部分组成(15)(16)(17)[还参见涉及多糖和低聚糖及其营养效应的PCT公开号WO2010/128859]。技术实现要素：：乙酰微小杆菌带有有效合成广泛葡萄糖低聚糖的α-葡聚糖转移酶(α-GT-E)，所述葡萄糖低聚糖含有来自MOS、麦芽糖糊精和淀粉的α-1,4和α-1,6糖苷键。提供了分离的和/或纯化的α-葡聚糖转移酶、其重组工程化变体、其活性片段；编码所述α-葡聚糖转移酶的合成核酸、其变体、或其活性片段；包含所述合成核酸的宿主细胞；以及包含所述α-葡聚糖转移酶的组合物。使用这些组合物的方法包括制造葡萄糖低聚糖。词汇表：BLAST基本局部比对搜索工具CAZy碳水化合物活性酶数据库EDTA乙二胺四乙酸MOS麦芽低聚糖IMO异麦芽低聚糖GH70糖苷水解酶的家族70GPC凝胶渗透色谱HOD信号来自水的NMR信号，在该水中一个质子被替换为氘HPAEC高效阴离子交换色谱HPLC高效液相色谱HPSEC高效尺寸排阻色谱HSQC异核单量子相干α-GT-E来自乙酰微小杆菌的推定的α-葡聚糖转移酶MALLS多角度激光散射NMR核磁共振RI折射率SEC尺寸排阻色谱TLC薄层色谱通用缓冲液乙酸、硼酸和磷酸的混合物附图说明：图1.A)显示不同GH70亚家族的示意图(1)使用蔗糖作为底物合成α-葡聚糖聚合物的常见GH70GTF，2)使用蔗糖作为供体和葡聚糖为受体在葡聚糖骨架中引入α-1,2和α-1,3分支而分支的GH70BRS，3)使用MOS和淀粉作为底物引入α-(1→6)糖苷键的4,6-α-GT。B)新的GH70亚家族4)α-GT，使用MOS和麦芽糖糊精作为底物的没有环形排列(β/α)8筒结构并因此没有保守区域的GH13顺序的唯一GH70成员。图2.pHYT-α-GT-E的质粒图图3A.(推定的)GH70亚家族4α-GT蛋白质(不具有环形排列的(β/α)8筒)的无根系统树。用MEGA4使用邻接法完成比对和系统树图构建。(以百分比计的)步长值(bootstrapvalue)显示在分支点处。比例尺对应于0.1个取代的遗传距离/位置(10％氨基酸序列差异)。黑色：来自公共数据库的推定α-GT；灰色：来自杜邦数据库的推定α-GT。图3B.来自亚家族1、2、3和4的GH70的催化结构域中保守区(I、II、III、IV)的氨基酸序列比对。GH70_1：葡聚糖蔗糖酶(GTFA、GTFO、GTF180和GTFML1)，GH70_2：分支蔗糖酶(DSRECD2和BRSA)，GH70_3：4,6-α-葡聚糖转移酶(4,6-α-GT-B、4,6-α-GT-W和4,6-α-GT-ML4)以及GH70_4：α-葡聚糖转移酶(乙酰微小杆菌DSM20416的α-GT-E、凝结芽孢杆菌(B.coagluans)2-6的α-GT-S和凝结芽孢杆菌2022696的α-GT-L)。七个严格保守的氨基酸残基，对不同GH70亚家族中的-1和+1亚位点具有重要贡献，显示为浅灰色。三个催化残基以粗体显示。ND：未确定。图4.pH对α-GT-E活性的影响(A)。在1mMCaCl2存在下在37℃下，通过在含有1mMCaCl2的186mM通用缓冲液中利用0.0375g/lα-GTE酶测量由PABAH在30分钟内从1％zulkowsky淀粉释放的还原糖的量而确定酶活性。在补充有1mMCaCl2的186mM通用缓冲液(pH5.0)中确定温度(B)的影响(平均值±S.E.M.；n＝3)。图5.α-GT-E的SDS-PAGE显示阴离子纯化后的上清液(原始的)和级分(5-13)。图6.在含有1mMCaCl2的10mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中用20mM麦芽低聚糖孵育5小时的0.0375g/lα-GT-E的反应产物的TLC分析。G2，麦芽糖；G3，麦芽三糖；G4，麦芽四糖；G5，麦芽五糖；G6，麦芽六糖；G7，麦芽七糖以及pan，潘糖。图7.(A)麦芽糖糊精DE13-17和(B)在50mM乙酸钠缓冲液(pH4.8)中用10％α-GT-E上清液孵育24小时的麦芽糖糊精DE13-17的500-MHz一维1HNMR分析。图8.在含有1mMCaCl2的50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0，45℃)中用20mM麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)和麦芽七糖(G7)孵育24小时的0.0375g/lα-GT-E的反应产物的HPAEC分析。图9.在25mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)，用A)25mM孵育16小时的来自(α-GT-E、α-GT-L、α-GT-A(无表达和无活性)和α-GT-S)的不同重组α-GT的上清液的TLC分析。G2，麦芽糖；G3，麦芽三糖；G4，麦芽四糖和(B)G5，麦芽五糖；G6，麦芽六糖；G7，麦芽七糖。标准品14mMG1-G7。图10A：在42℃在含有0.5mMCaCl2的25mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中用纯化的α-GT-E孵育过夜的麦芽七糖酶(DP7)(B)麦芽七糖(0.0375g/l)的700-MHz一维1HNMR分析。B：用如上所述的α-GT-E孵育的麦芽七糖酶(DP7)的500-MHz一维13CNMR分析。具体实施方式：披露了来自乙酰微小杆菌的推定的α-葡聚糖转移酶(α-GT-E)、其重组工程化变体及其活性片段。独特的α-GT-E酶活性的组合，合成来自MOS的葡萄糖低聚糖与含有α-(1→4)和α-(1→6)键的葡萄糖低聚糖的混合物，并同时合成异麦芽低聚糖(IMO)，如异麦芽糖和异麦芽三糖(图6和8)，与结构域组织(图3B)一起促使我们创建了另外一个GH70亚家族4(图1B和图3A)。接下来来自乙酰微小杆菌的α-GT-E，表征了(α-GT-S)和(α-GT-L)的两个其他GH70亚家族4的成员都来自凝结芽孢杆菌物种。这两种酶还清楚地显示了对合成各种葡萄糖低聚糖的MOS的活性(图9)。α-GT-E的全长序列由SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列组成。当作为成熟酶表达时，α-GT-E可以由SEQIDNO:2的氨基酸序列的氨基酸31-731组成。当作为成熟酶表达时，α-GT-S可以由SEQIDNO:7的氨基酸序列的氨基酸33-736组成。当作为成熟酶表达时，α-GT-L可以由SEQIDNO:11的氨基酸序列的氨基酸22-726组成。重组α-GT-E酶是来自亚家族4的GH70同源物(与罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)121GH70_1的GTFA约27％同一性，并且与罗伊氏乳杆菌121GH70_3的4,6-α-GT-B约30％同一性)，没有能够歧化麦芽低聚糖(MOS)、合成IMO并且还在形成的产物中引入α-1,6糖苷键的环形排列(β/α)8筒。通过α-GT-E，使用不同的α-1,4连接的糖底物以引入α-1,6键。1H-NMR显示：将来自麦芽七糖(DP7)的21％的α-1,6键引入产物中(图10A)，没有通过13CNMR光谱检测到分支的迹象(图10B)；将来自麦芽糖糊精DE13-17的19％的α-1,6键引入产物中(图7)。将来自麦芽糖糊精DE4-7的12％的α-1,6键引入产物中，通过13CNMR光谱没有检测到分支的迹象(数据未显示)。将来自可溶性淀粉(Zulkowsky)的10％的α-1,6键引入产物中，通过13CNMR光谱没有检测到分支的迹象(数据未显示)。α-GT-E可以包含由SEQIDNO:2的氨基酸31-731组成的多肽，其中另外的氨基酸序列可以与由SEQIDNO:2的氨基酸31-731组成的多肽的N-末端和/或C-末端融合。在任一末端融合的氨基酸序列可以含有通常不与天然存在的α-GT-E有关的氨基酸序列。例如，这样的氨基酸序列可用于标记或纯化蛋白质。这样的氨基酸序列还包括对所表达的α-GT-E赋予新功能的多肽。例如，可以将异源碳水化合物结合结构域与重组α-GT-E的羧基末端融合。α-GT-E可以是“分离的”，这意味着它与自然界中与其相关的至少一些生物材料分离，并且然后纯化并浓缩成在自然界中未发现的形式，例如，处于冷冻干燥的粉末形式、包入胶囊内的形式、包衣形式、颗粒形式、或液体配制品。α-GT-E可以被“重组表达”，这意味着它在重组宿主细胞中从DNA或类似的合成核酸中表达。信号肽可以可操作地连接到N-末端以促进重组表达的蛋白质从宿主细胞内的表达载体的分泌。例如，信号肽可以具有SEQIDNO:2的氨基酸1-30的序列。可替代地，α-GT-E可以连接到不同的信号序列，如来自另一个细菌物种的信号序列，例如，另一个微小杆菌属物种信号序列。信号肽可以在重组表达期间进行蛋白水解切割，以产生成熟形式的推定的α-葡聚糖转移酶。“重组α-GT-E”包括由SEQIDNO:2的氨基酸31-731组成的重组表达的α-GT-E、以及其重组工程化变体或其活性片段。与SEQIDNO:2的氨基酸31-731相比，“重组工程化变体”含有至少一个氨基酸取代或来自N-或C-末端的缺失。重组工程化变体的氨基酸序列与SEQIDNO：2的天然存在的α-葡聚糖转移酶的氨基酸序列相差至少一个氨基酸。重组工程化变体可以显示出与SEQIDNO：2的氨基酸序列的氨基酸31-731至少60％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性。α-GT-E的变体可以由SEQIDNO：2的氨基酸序列的氨基酸31-731组成，其中不同一的氨基酸可以是来自C-或N-末端的氨基酸取代或缺失。例如，具有SEQIDNO：2的残基728-731的缺失的变体将与SEQIDNO：2的氨基酸序列的氨基酸31-731具有至少98％序列同一性。重组α-GT-E包括但不限于具有1、2、3、或4个随机选择的氨基酸修饰的多肽。氨基酸取代也可以选自表1中所示的保守性氨基酸取代：表1残基保守取代残基保守取代AlaSerLeuIle；ValArgLysLysArg；GlnAsnGln；HisMetLeu；IleAspGluPheMet；Leu；TyrGlnAsnSerThr；GlyCysSerThrSer；ValGluAspTrpTyrGlyProTyrTrp；PheHisAsn；GlnValIle；LeuIleLeu，Val使用本领域熟知的肽合成技术(如固相肽合成等)，或通过重组DNA操作，可容易地进行氨基酸取代、缺失、和/或插入。操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法为本领域所熟知的，并且包括例如定点诱变。还提供了重组表达的α-GT-E的活性片段。α-GT-E的活性片段是α-GT-E的一部分，其保留可测量的α-葡聚糖转移酶活性，并且能够催化麦芽低聚糖(MOS)的歧化和延伸、改性淀粉以及另外在形成的产物中引入(α1→6)糖苷键。如在此所用，“百分比序列同一性”意指当使用具有默认参数的CLUSTALW算法进行比对时，变体具有至少一定百分比的与野生型酶同一的氨基酸残基。参见Thompson等人，(1994)NucleicAcidsRes.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTALW算法的默认参数为：空位开放罚分：10.0空位延伸罚分：0.05蛋白质权重矩阵：BLOSUM系列DNA权重矩阵：IUB延迟发散序列％：40空位分隔距离：8DNA转换权重：0.50列表亲水残基：GPSNDQEKR使用负性矩阵：关切换特殊残基罚分：开切换亲水罚分：开切换结束空位分隔罚分关。与参比序列相比，缺失被视为不同一的残基。包括在任一末端发生的缺失。例如，相对于SEQIDNO:2的氨基酸序列的氨基酸31-731，具有SEQIDNO:2的残基728-731的缺失的变体将具有至少98％序列同一性，但不具有至少99％序列同一性(417/422同一的残基×100得到98.8％序列同一性)。α-GT-E变体中的氨基酸修饰可以包括与其他GH70酶相比保守的序列基序中的残基。α-GT-E可以是组合物的组分。组合物可以包含从乙酰微小杆菌的培养物获得的纯化的α-GT-E或可以包含纯化的重组α-GT-E，该重组α-GT-E可以在包含编码重组α-GT-E的核酸的重组修饰的宿主细胞中表达。例如，组合物可以包含表达编码重组α-GT-E的核酸的宿主细胞。α-GT-E可以在组合物中具有至少50％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少98％的纯度。例如，α-GT-E可以被纯化至同质。组合物可以包括其他组分。例如，α-GT-E组合物可以包含作为冷冻干燥的粉末的α-GT-E和任选的一种或多种运载体，如不具α-葡聚糖转移酶活性的另一种蛋白质。组合物还可以包含稀释剂中的α-GT-E，如蒸馏水、蒸馏/去离子水、或缓冲盐水溶液。提供了编码重组α-GT-E的合成核酸，例如，DNA、包含这些核酸的载体、和包含该载体或这些核酸的宿主细胞。“合成”核酸含有至少一个在SEQIDNO:1中所描绘的天然存在的序列中未发现的核苷酸残基。编码重组α-GT-E的核酸序列可以包含可用于同源或异源表达的表达调节区域(例如，启动子、增强子和终止子)。这些表达调节序列与编码多肽的核酸序列可操作地连接。如本领域技术人员所熟知的，遗传密码是简并的，这意味着在某些情况下多个密码子可以编码相同的氨基酸。编码重组α-GT-E的合成核酸包括所有可能的密码子简并性。编码重组α-GT-E的核酸可以包括SEQIDNO:1的多核苷酸，该SEQIDNO:1的多核苷酸是乙酰微小杆菌的α-gt-E基因。载体可以包含编码重组α-gt-E的合成核酸。例如，载体可以是能够表达重组α-GT-E的表达载体。载体可以包含一个或多个选择性标记物，例如抗生素抗性基因。包含α-gt-E编码核酸的载体可以包括包含SEQIDNO:1的91-2676bp多核苷酸的那些载体。其他载体可以包含由SEQIDNO:1的核苷酸序列组成的多核苷酸。提供了含有一个或多个拷贝的核酸构建体的重组宿主细胞，如植物、动物、真菌、或细菌细胞。宿主细胞可以是细菌细胞，例如，微小杆菌属物种，该细菌细胞能够表达并分泌重组α-GT-E。其他宿主细菌细胞可以不是乙酰微小杆菌。宿主细胞可以包含含有由SEQIDNO:2的核苷酸序列组成的多核苷酸的载体。用于制备和使用编码重组α-GT-E的核酸、载体、包含该核酸的表达构建体、和宿主细胞的合适技术是本领域熟知的。还提供了使用α-GT-E(例如，重组α-GT-E)来生产葡萄糖低聚糖产物的方法。该方法可以包括使α-GT-E与合适的底物(如MOS、麦芽糖糊精、直链淀粉或淀粉)接触。可以在包含纯化α-GT-E或重组α-GT-E的组合物中提供α-GT-E。α-GT-E能以组合物的形式提供，该组合物包含表达α-GT-E的细胞，例如，包含编码重组α-GT-E的核酸的宿主细胞。在这种情况下，该细胞可以处于非生长状态。这允许该产物的生产继续进行而没有必要提供用于支持细胞生长的营养物和其他材料。可以通过使底物源(如MOS、麦芽糖糊精、直链淀粉或淀粉)与细胞接触并从培养基中回收糖来进行生产。表达α-GT-E的细胞可以固定在运载体上，如固体颗粒、过滤器和反应器壁。除了α-GT-E之外，细胞还能够共表达至少一种酶，如淀粉酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶。例如，可以与α-GT-E共表达的酶，例如异构酶，可以利用在α-GT-E催化的反应期间产生的低聚糖或修饰的淀粉作为底物。低聚糖或修饰的淀粉产物可以在生产过程之后进行化学修饰，其取决于低聚糖或修饰的淀粉产物的所希望的应用。淀粉的化学改性通常涉及构成淀粉聚合物的α-D-吡喃葡萄糖基单元上的可用羟基的酯化、醚化或氧化。能够表达重组α-GT-E的重组宿主细胞可以用于能够充当益生菌的组合物中。重组宿主细胞可以产生葡萄糖低聚混合物。摄入这种葡萄糖低聚混合物后，会促进肠道中可以代谢低聚糖的菌株(像，乳酸杆菌和双歧杆菌)的生长。组合物可以进一步包含食品级、饲料级、工业级、或可药用的载体、稀释剂或赋形剂。在这种情况下，“药学上可接受的”意指该组分对于由动物和/或人的摄取是安全的。可以将组合物施用于动物或人。益生菌组合物可以直接与食物一起摄取。术语“约”通常是指参考值的±15％。当定义温度时，“约”是指过程期间的平均温度。本领域技术人员将预期过程的温度可以围绕设定温度稍微变化，例如距离设定值±1℃。因此，“约40℃”的温度将涵盖40℃±1℃的温度，并且还包括在该过程中可能发生的温度瞬态峰值。例如，过程的温度可以在几分钟内高出40℃若干度。这些瞬态峰值被“约40℃”所涵盖。实例实例1乙酰微小杆菌DSM20416推定的α-葡聚糖转移酶(α-GT-E)的克隆选择乙酰微小杆菌DSM20416菌株(得自Leibniz-InstitutDSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH公司)作为可用于各种工业应用的酶的潜在来源。通过合成技术使用测序对乙酰微小杆菌DSM20416菌株的整个基因组进行测序。基因组测序和序列数据的集合由碱基清理(BaseClear)(莱顿市(Leiden)，荷兰)进行。重叠群通过BioXpr(那慕尔(Namur)，比利时)进行注释。在乙酰微小杆菌DSM20416中以这种方式鉴定的基因之一(SEQIDNO:1)编码在此鉴定为“α-GT-E”的推定的α-葡聚糖转移酶。由α-GT-E编码的全长酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。由α-GT-E编码的成熟α-葡聚糖转移酶的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。在N-末端，如使用SignalP-NN(Emanuelsson等人，NatureProtocols[自然试验方案]，2:953-971,2007)所确定的，α-GT-E具有预测长度为30个氨基酸(在SEQIDNO:2中以粗体斜体表示)的信号肽。信号序列的存在表明该推定的α-葡聚糖转移酶是分泌的酶。如通过在芽孢杆菌中由α-GT-EAA31-731[FAPS…KAPV](约79009Da)编码的表达蛋白的质谱分析所确定的，C-末端截短的成熟α-葡聚糖转移酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。实例2α-GT-E、α-GT-S和α-GT-L的异源表达使用由枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE启动子、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列、成熟推定的α-葡聚糖转移酶和BPN'终止子组成的表达盒在枯草芽孢杆菌中产生α-GT-Eα-葡聚糖转移酶。将这个表达盒克隆到pHYT复制穿梭载体中并转化。通过使用BstEII和EcoRI位点在四环素抗性基因后添加终止子，从pHY300PLK(宝生物公司(Takara))衍生pHYT载体(终止子序列：GGTTACCTTGAATGTATATAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATGCATCGATGGAATTC)。还使用克隆到BamHI和HindIII位点的连接子去除pHY300PLK中的HindIII位点(连接子序列：GGATCCTGACTGCCTGAGCTT)。图1中显示了用于表达推定的α-葡聚糖转移酶的pHYT载体(pHYT-α-GT-E)的图谱。将编码通过引入几个沉默密码子改变而被修饰的α-GT-E的成熟区的合成基因克隆到pHYT载体中。该替代性α-GT-E基因的核苷酸序列示于SEQIDNO:5中。类似地，制备pHYT中来自凝结芽孢杆菌2-6的α-GT-S和来自凝结芽孢杆菌2022696的α-GT-L的构建体，它们的合成核苷酸序列分别示于SEQIDNO:9和13中。α-GT-E基因表达和α-GT-E的纯化为了产生α-GT-E，在胰胨大豆肉汤(Oxoid有限公司，英国)和格兰特II培养基(Grant’sIImedium)中培养含有pHYT-α-GT-E的枯草芽孢杆菌转化体。参见美国专利号8,507,244B2。使用心浸液琼脂板(Difco实验室，MI)来选择转化体。通过添加25μg/mL四环素维持质粒完整性。孵育(在32℃下3天)后，在生长培养基中检测到α-GT-E。离心和过滤后，将具有α-GT-E的培养上清液用于测定和纯化。将类似的方法用于表达α-GT-S和α-GT-L。使用配备有5mlHiTrapQHP柱(GE医疗集团)的AKTAExplorer系统(GE医疗集团)和100mL的1MNaCl(在20mMTris缓冲液中，pH7.5)作为洗脱液的线性梯度，以5mlmin-1的流速，通过阴离子交换色谱，将上清液中存在的酶纯化至同质。如通过SDS-PAGE所判断的，将洗脱峰中存在的蛋白质使用10mMNaAc(pH5.0)进行脱盐(Slide-A-Lyzer透析盒10kDaMWCO，皮尔斯公司(Pierce))。使用伯乐试剂和BSA(牛血清白蛋白)作为标准品(伯乐公司)的布雷德福方法(Bradfordmethod)确定蛋白质浓度。蛋白质质谱分析将纯化的蛋白质沉淀并溶解于8M尿素中并用DTT还原，用碘乙酰胺(IAA)烷基化并使用胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和胞内蛋白酶GluC消化，作为质谱分析的准备。在PhenomenexAerisPeptideXB-C18柱(150x2.1mm，3.6μ)上通过RP-HPLC分离胰蛋白酶消化物(10μl)。洗脱梯度由在水中的0.1％(v/v)甲酸(溶剂A)和在乙腈中的0.1％(v/v)甲酸(溶剂B)以0.3ml·min-1的流速形成。柱室在50℃下运行。使用α-GT-E蛋白质序列作为检索模型来鉴定蛋白质片段。来自乙酰微小杆菌DSM20416的α-GT-E的氨基酸序列比对与系统树构建用MEGA版本4(www.megasoftware.net)中的ClustalW界面进行了α-GT-E和同源物(没有环形排列的(β/α)8筒)的多个氨基酸序列比对，其空位开放罚分和空位延伸罚分分别为10和0.2。同样的程序被用来构建αGTE和同源物的系统树。使用αGTE作为检索模型从blast检索获得氨基酸序列。系统发育的步长测试(bootstraptest)是使用500次重复通过邻接法进行的。最适pH和温度在范围从pH2至pH12的186.5mM通用缓冲液中，通过测量在37℃、在30分钟内由0.0375g/lα-GT-E从2％Zulkowsky淀粉释放的还原糖的量增加，而确定α-GT-E最适pH。与最适pH相似，使用186.5mM通用缓冲液(pH5.0)确定α-GT-EpH最适温度(22℃-74℃)。如下制备通用缓冲液，使用4MNaOH将1M乙酸、1M硼酸和1M磷酸调节至pH7.0并且终浓度为0.75M。将该溶液用4MNaOH或4MHCl调节以制备范围从pH2-12的pH缓冲液。。PAHBAH还原糖试剂(针对100ml试剂：1g对羟基苯甲酸酰肼(西格玛公司#H9882)、16g溶于2％NaOH中的酒石酸钾钠四水合物)(Lever,AnalBiochem[分析生物化学],47:273-279,1972)。将5μl孵育样品添加到100μlPABAH试剂中，在99℃孵育3分钟。用分光光度计在410nm处测量吸光度(终点)。用α-GT-E孵育麦芽低聚糖(MOS)和其他糖底物A)纯化的酶：i)TLC和HPAEC分析：将α-GT-E(0.0375g/l)和20mM蔗糖(数据未显示)和具有不同聚合度的MOS(G2-G7)以及潘糖单独地在45℃下在含有1mMCaCl2的50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中孵育5小时。ii)NMR分析：将α-GT-E(0.0375g/l)和0.83％III型直链淀粉(用1MNaOH溶解并用1MHCL中和)、0.83％Zulkowsky淀粉、0.83％麦芽糖糊精DE4-7和麦芽七糖(G7)单独地在42℃下在含有0.5mMCaCl2的25mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中孵育过夜。B)上清液ii)NMR分析，将在50mM乙酸钠缓冲液(pH4.8)中的表达α-GT的10％枯草芽孢杆菌上清液与50g/l麦芽糖糊精DE13-17一起在30℃孵育24小时。薄层色谱(TLC)和高效阴离子交换色谱(HPAEC)对于糖产物混合物的TLC分析，将1-3μl样品施加到硅胶60F254板(默克公司(Merck)，达姆施塔特(Darmstadt)，德国)上，并且在干燥后，将板在丁醇/乙醇/H2O(5/5/3(v/v/v))中运行6小时或ON。然后，将板干燥，用在甲醇中的50％H2SO4进行喷雾，并在110℃下显影10分钟。对于HPAEC，使淬灭(10分钟，95℃)的酶反应混合物的适当稀释液(在H2O中)经受分析。使用MOS(DP1-DP7)和麦芽糖糊精DE4.0-7.0溶液的混合物作为标准品。使用CarbopacPA200柱(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))用超纯水(洗脱液A)、1MNaOH(洗脱液B)和0.5MNaAc(洗脱液C)作为溶剂来分离糖，流速为0.50mL/min，注射体积为5-10μL，柱温为30℃，并且检测器温度为20℃。使用以下梯度的洗脱液A、B和C：洗脱液A(0分钟，95％)；(15分钟，90％)；(30分钟，72％)；(40分钟，40％)；(45.1分钟，95％)；洗脱液B(0分钟，5％)；(15分钟，10％)；(45.1分钟，5％)；以及洗脱液C(0分钟，0％)；(30分钟，18％)；(40分钟，50％)；(45.1分钟，0％)。用电化学检测器(赛默飞世尔科技公司)用Au工作电极和Ag/AgCl参比电极进行检测。波形：金标准PAD(标准四电位)：+0.1伏(0-0.40s)；-2.0伏(0.41-0.42s)；0.6伏(0.43s)；-0.1伏(0.44-0.50s)。使用Chromeleon软件(赛默飞世尔科技公司)整合数据。(ii)核磁共振(NMR)光谱。在针对1H的500MHz下操作的AgilentDD2光谱仪上，使用5mm低温三共振脉冲场梯度探头(安捷伦技术公司(AgilentTechnologies,Inc.)，圣克拉拉(SantaClara)，加利福尼亚州)，获得用麦芽糖糊精DE13-17样品[和其他样品？]孵育的α-GT-E的一维1HNMR谱。通过在“presat”实验中小心地将观测发射机频率置于残余水信号的共振，并且然后使用具有全相循环(32的倍数)和10ms混合时间的NOESY-presat实验的第一切片来获得水峰抑制。一维1H谱获得的谱宽为6410Hz，采集时间为5.1s，数据点数为65536，预饱和度为4s，以及观测脉冲为90度。信号平均法涉及64次扫描的累积。样品温度保持在25℃。通过将50μL反应混合物与60μL含有12.4mM作为内部化学位移参考物的4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸钠盐(DSS)的D2O一起添加到5mmNMR管中来制备样品，并且余量(450μL)为D2O，总体积为560μL。将DSS甲基共振设定为0ppm。1.HuY,Ketabia.,Buchkoa.,MG.2013.Metabolismofisomalto-oligosaccharidesbyLactobacillusreuteriandbifidobacteria.Lett.Appl.Microbiol.57:108-114.2.PanYC,LeeWC.2005.Productionofhigh-purityisomalto-oligosaccharidessyrupbytheenzymaticconversionoftransglucosidaseandfermentationofyeastcells.Biotechnol.Bioeng.89:797-804.3.AslanY,TanrisevenA.2007.ImmobilizationofPenicilliumlilacinumdextranasetoproduceisomaltooligosaccharidesfromdextran.Biochem.Eng.J.34:8-12.4.HijumSAFTVan,KraljS,OzimekLK,DijkhuizenL,Geel-schuttenIGHVan.2006.Structure-FunctionRelationshipsofGlucansucraseandFructansucraseEnzymesfromLacticAcidBacteria70:157-176.5.LeemhuisH,PijningT,DobruchowskaJM,vanLeeuwenSS,KraljS,DijkstraBW,DijkhuizenL.2013.Glucansucrases:Three-dimensionalstructures,reactions,mechanism,α-glucananalysisandtheirimplicationsinbiotechnologyandfoodapplications.J.Biotechnol.163:250-272.6.RobytJF,EklundSH.1983.Relative,quantitaveeffectsofacceptorsinthereactionofLeuconostocmesenteroidesB-512Fdextransucrase.Carbohydr.Res.121:279-286.7.HellmuthH,WittrockS,KraljS,DijkhuizenL,HoferB,SeibelJ.2008.EngineeringtheglucansucraseGTFRenzymereactionandglycosidicbondspecificity:towardtailor-madepolymerandoligosaccharideproducts.Biochemistry47:6678-6684.8.KraljS,VanGeel-SchuttenIGH,FaberEJ,VanDerMaarelMJEC,DijkhuizenL.2005.RationaltransformationofLactobacillusreuteri121reuteransucraseintoadextransucrase.Biochemistry44:9206-9216.9.VujicicA,PijningT,KraljS,LópezCA,EeuwemaW.2010.Crystalstructureofa117kDaglucansucrasefragmentprovidesinsightintoevolutionandproductspecificityofGH70enzymes.Proc.Natl.Acad.Sci.10.StamMR,DanchinEGJ,RancurelC,CoutinhoPM,HenrissatB.2006.Dividingthelargeglycosidehydrolasefamily13intosubfamilies:Towardsimprovedfunctionalannotationsofa-amylase-relatedproteins.ProteinEng.Des.Sel.19:555-562.11.BozonnetS,Dols-LaffargueM,FabreE,PizzutS,Remaud-SimeonM,MonsanP,WillemotRM.2002.MolecularcharacterizationofDSR-E,anα-1,2linkage-synthesizingdextransucrasewithtwocatalyticdomains.J.Bacteriol.184:5753-5761.12.PasseriniD,VuilleminM,UfartéL,MorelS,LouxV,Fontagné-FaucherC,MonsanP,Remaud-SiméonM,MoulisC.2015.InventoryoftheGH70enzymesencodedbyLeuconostoccitreumNRRLB-1299-identificationofthreenovelα-transglucosylases.FEBSJ.n/a-n/a.13.KraljS,GrijpstraP,vanLeeuwenSS,LeemhuisH,DobruchowskaJM,vanderKaaijRM,MalikA,OetariA,KamerlingJP,DijkhuizenL.2011.4,6-Α-Glucanotransferase,aNovelEnzymeThatStructurallyandFunctionallyProvidesanEvolutionaryLinkBetweenGlycosideHydrolaseEnzymeFamilies13and70.Appl.Environ.Microbiol.77:8154-63.14.LeemhuisH,DijkmanWP,DobruchowskaJM,PijningT,GrijpstraP,KraljS,KamerlingJP,DijkhuizenL.2013.4,6-α-GlucanotransferaseactivityoccursmorewidespreadinLactobacillusstrainsandconstitutesaseparateGH70subfamily.Appl.Microbiol.Biotechnol.97:181-93.15.DobruchowskaJM,GerwigGJ,KraljS,GrijpstraP,LeemhuisH,DijkhuizenL,KamerlingJP.2012.Structuralcharacterizationoflinearisomalto-/malto-oligomerproductssynthesizedbythenovelGTFB4,6α-glucanotransferaseenzymefromLactobacillusreuteri121.Glycobiology22:517-528.16.LeemhuisH,DobruchowskaJM,EbbelaarM,FaberF,BuwaldaPL,MaarelMJECVanDer,KamerlingJP,DijkhuizenL.2014.Isomalto/Malto-Polysaccharide,ANovelSolubleDietaryFiberMadeViaEnzymaticConversionofStarch.17.2010.gluco-oligosaccharidescomprisinga1,4anda1,6glycosidicbonds,usethereof,andmethodsforprovidingthem.[[序列表：]]SEQIDNO:1：[核苷酸序列α-GT-E]ATGAACAAGGCGAAAAAAGTCTCAACAGGTTTGCTTGCGGCATTGGTAGCGACAAGCGGACTGACGTATGCACCAGAAAGCGCAAAGGCTTTCGCACCAAGTGAAAAACTCGATAACCGCGTTATTTTCCAAAGCTTCAGCCTGTATCAACCATACGAAAGCAACATGTACCGGACGCTTGCTAAAAAAGGTGAGTTGCTCAATTCGTGGGGTGTGACAGATGTGTGGTTACCACCTGCATATCGTTCATTCGATATGGCACGTTACATGGAAGGATATGCAATCGCTGACCGTTATGACCTTGGTGAATTCCCACAAGGACCAGGTGGATCGGTTGCGACGAAATACGGAAAAGCCACACAACTCGAGATGATGGTCGACATGTTGCATGACGACAACATCAAAGTCCAGATGGACCTCGTTCCAAACCAAATGCTCGGTCTCAACAAACGTGAAGCTGTCTTCGTTCGTCGTGCGACAAGTTCAGGTGAGCCGTTCATGAACCCATTCACAGGTGGAGAAAAAACGAAGACCCTCGCAACGCCTTACCTCGCTTACACAAAAGGTGGCGGTATGGGACAAGAGAAGTACGGTTACCTCAAAGAGTGGAACAAATCATTCATCAATGGAACATCACTGCAAGGGCAGGGTATGGGGCGCGTCATGACGGACAAAGACGGTAAACCGTACCGTTACTTCGGTAAAGACGATGCGAACAACTACTTACCAGAATGGTTGCTTGACGCAGCGAAGACACAGAACTTGAATGTCGTCGATACGTACCTCGCAGCAGACGGTTGGTATGAAGTCTCACCAGAGAACTGGAAGCCGATGCTTTCGCAATATGCGAAGGATGAAGGATACCTCGAGTACATGAAACAAAACGGCTTCGAAACAAAAGAAGCTTTGCTTACTTCAACGGAAAACACCAAGATCGCTTCGTTGACGGAAGAATACATGAAGACACAAGCTGCGTACGGTTATGGGTCAGAAGAACGTTCATACCAAAACGATAACTCAGGAATCGATATCGAAGATCAGTTCCTCTTCGTTGATGAGACTGGTTTCCCAACACAGGCATACAACAAAACGATGACGAACAACGATGAGTTCTTGATCGGTGTCGACCTTGCGAACTCGAACCCAGAAGTCATCAAGGAACAAAAGAACTGGATGAAGTGGATGCTTGAAACGTACAAGTTCGACGGTTTCCGGATTGATGCTGCGTCGCACTACGATACGGCGATCCTCAAAGCAGAAGCGGAAATTTCAAAAGCACACTTCGGGAAACAAGATTACCTCAGCTATATCGAGAGCTATAAAACAGAACAGAATGCTTACATGAAAGCAAACAATAACGAGCAACTCGTCATGGACGGAGAGCTTTACTTCACGCTCCGTTCAGCACTCACACCATCGAACAAACGTGCACTCCGTGACTTAGCGAAAGTCTCAGTCGTTAACCGTGAAGGTGACGGCGCGACAAACGTTCAAGCGAACTGGTCATTCGTCAACAACCATGACCAAGAGAAAAACCGCGTCAACCAAATCATGCTTGATGCGTACGGCATCAAAACGAATACGCAGTACGGAAAAGACGGCGAGCCGAAATCGTTCGAGAAGCTCTACAATAAAGAAGATGAAGCGAAGGCACTTGCGATCTACAACAAAGAACTCGCAAGTCCAACGAAGAAATACTCGACGGAAAACGTCGTCGCGCAATACGCGTTCCTTCTTTCGAACAAAAACACGGTGCCAACGGTCTACTACGGTGATCTCTACCAGACGGATGCATCGTACATGTCGAAAACGACACCGTACTATGATGAAATCACGAATCTCCTAAAAGTCCGTAAACAGTATGCGTATGGTAAACAACACGTTGCGTACCACACATCGAACACGTCAAAAGAAGCGGGTAAAGACTTGATCTCAAGCGTCCGTTTCGGAAAAGACCGCAACACAGGTGTCGCGACAGTCATCGGGAAAAACGCAGCGCTTGATACGACGGTTCAAGTCAACATGGGTAAAACACACGCGAACCAAGTCTTCGTTGATGCTAGTGGCGTTACGAACACGAAACTCGTCACAGATAAGAACGGTATCTTGACGGTTCCAGTCAAAGGTATCAAAACAGCAGAAGTCAACGGTTACGTCGGCGTCTTCGTTCCACAAGCAACAAAAGCGCCAGTTGCAGCAATCAAAGCAGGTGCTGTCTACCAAGGAAAAGCACTCGACTTGAAAACGACAGTTACGAACACGACATCAGCAGTTGCGTCAACACGCTACCGTGTCCTTGATACGAAAAAAGCGACAGTTGATTCAAAAGGTCGTCTGACAGGTAAAGCAACAGGTAAGACGACGGTTGAAGCAACAGTTACGTTAAAAGACGGTTTTGTCTTGAAAACAGTTTTACCGATCGAAACAAAAGCGAACAGCGTCACGCTGAAAGCAACAAAAGCAACACTCAAGAAGAACCAGACGACACGTATCGCGTATACGTCAGCAACGGATAAGATCAAATCTGTTCAGTATGCGTCAGCGAACAAAAAAGTCGCGCAAGTCTCGTCACGTGGTAACGTGAAAGGGATCAAAGCAGGCAAAACGACGATCCGTGTCACATACACGACAGTAGGAAACTACAAAGTCGTCAAAACGTTCACAGTCACAGTCAAGSEQIDNO:2-[氨基酸序列α-GT-E]FAPSEKLDNRVIFQSFSLYQPYESNMYRTLAKKGELLNSWGVTDVWLPPAYRSFDMARYMEGYAIADRYDLGEFPQGPGGSVATKYGKATQLEMMVDMLHDDNIKVQMDLVPNQMLGLNKREAVFVRRATSSGEPFMNPFTGGEKTKTLATPYLAYTKGGGMGQEKYGYLKEWNKSFINGTSLQGQGMGRVMTDKDGKPYRYFGKDDANNYLPEWLLDAAKTQNLNVVDTYLAADGWYEVSPENWKPMLSQYAKDEGYLEYMKQNGFETKEALLTSTENTKIASLTEEYMKTQAAYGYGSEERSYQNDNSGIDIEDQFLFVDETGFPTQAYNKTMTNNDEFLIGVDLANSNPEVIKEQKNWMKWMLETYKFDGFRIDAASHYDTAILKAEAEISKAHFGKQDYLSYIESYKTEQNAYMKANNNEQLVMDGELYFTLRSALTPSNKRALRDLAKVSVVNREGDGATNVQANWSFVNNHDQEKNRVNQIMLDAYGIKTNTQYGKDGEPKSFEKLYNKEDEAKALAIYNKELASPTKKYSTENVVAQYAFLLSNKNTVPTVYYGDLYQTDASYMSKTTPYYDEITNLLKVRKQYAYGKQHVAYHTSNTSKEAGKDLISSVRFGKDRNTGVATVIGKNAALDTTVQVNMGKTHANQVFVDASGVTNTKLVTDKNGILTVPVKGIKTAEVNGYVGVFVPQATKAPVAAIKAGAVYQGKALDLKTTVTNTTSAVASTRYRVLDTKKATVDSKGRLTGKATGKTTVEATVTLKDGFVLKTVLPIETKANSVTLKATKATLKKNQTTRIAYTSATDKIKSVQYASANKKVAQVSSRGNVKGIKAGKTTIRVTYTTVGNYKVVKTFTVTVKSEQIDNO:3-[成熟氨基酸序列α-GT-E]FAPSEKLDNRVIFQSFSLYQPYESNMYRTLAKKGELLNSWGVTDVWLPPAYRSFDMARYMEGYAIADRYDLGEFPQGPGGSVATKYGKATQLEMMVDMLHDDNIKVQMDLVPNQMLGLNKREAVFVRRATSSGEPFMNPFTGGEKTKTLATPYLAYTKGGGMGQEKYGYLKEWNKSFINGTSLQGQGMGRVMTDKDGKPYRYFGKDDANNYLPEWLLDAAKTQNLNVVDTYLAADGWYEVSPENWKPMLSQYAKDEGYLEYMKQNGFETKEALLTSTENTKIASLTEEYMKTQAAYGYGSEERSYQNDNSGIDIEDQFLFVDETGFPTQAYNKTMTNNDEFLIGVDLANSNPEVIKEQKNWMKWMLETYKFDGFRIDAASHYDTAILKAEAEISKAHFGKQDYLSYIESYKTEQNAYMKANNNEQLVMDGELYFTLRSALTPSNKRALRDLAKVSVVNREGDGATNVQANWSFVNNHDQEKNRVNQIMLDAYGIKTNTQYGKDGEPKSFEKLYNKEDEAKALAIYNKELASPTKKYSTENVVAQYAFLLSNKNTVPTVYYGDLYQTDASYMSKTTPYYDEITNLLKVRKQYAYGKQHVAYHTSNTSKEAGKDLISSVRFGKDRNTGVATVIGKNAALDTTVQVNMGKTHANQVFVDASGVTNTKLVTDKNGILTVPVKGIKTAEVNGYVGVFVPQATKAPVAAIKAGAVYQGKALDLKTTVTNTTSAVASTRYRVLDTKKATVDSKGRLTGKATGKTTVEATVTLKDGFVLKTVLPIETKANSVTLKATKATLKKNQTTRIAYTSATDKIKSVQYASANKKVAQVSSRGNVKGIKAGKTTIRVTYTTVGNYKVVKTFTVTVKSEQIDNO:4-[如通过质谱分析确定的、C-末端截短的、由α-GT-EAA31‐731[FAPS….KAPV]编码的成熟α-葡聚糖转移酶的氨基酸序列(约79009Da)]FAPSEKLDNRVIFQSFSLYQPYESNMYRTLAKKGELLNSWGVTDVWLPPAYRSFDMARYMEGYAIADRYDLGEFPQGPGGSVATKYGKATQLEMMVDMLHDDNIKVQMDLVPNQMLGLNKREAVFVRRATSSGEPFMNPFTGGEKTKTLATPYLAYTKGGGMGQEKYGYLKEWNKSFINGTSLQGQGMGRVMTDKDGKPYRYFGKDDANNYLPEWLLDAAKTQNLNVVDTYLAADGWYEVSPENWKPMLSQYAKDEGYLEYMKQNGFETKEALLTSTENTKIASLTEEYMKTQAAYGYGSEERSYQNDNSGIDIEDQFLFVDETGFPTQAYNKTMTNNDEFLIGVDLANSNPEVIKEQKNWMKWMLETYKFDGFRIDAASHYDTAILKAEAEISKAHFGKQDYLSYIESYKTEQNAYMKANNNEQLVMDGELYFTLRSALTPSNKRALRDLAKVSVVNREGDGATNVQANWSFVNNHDQEKNRVNQIMLDAYGIKTNTQYGKDGEPKSFEKLYNKEDEAKALAIYNKELASPTKKYSTENVVAQYAFLLSNKNTVPTVYYGDLYQTDASYMSKTTPYYDEITNLLKVRKQYAYGKQHVAYHTSNTSKEAGKDLISSVRFGKDRNTGVATVIGKNAALDTTVQVNMGKTHANQVFVDASGVTNTKLVTDKNGILTVPVKGIKTAEVNGYVGVFVPQATKAPVSEQIDNO:5-[编码α-GT-E的成熟基因的合成核苷酸序列]TTTGCGCTGACACTGATTTTTACAATGGCGTTTTCAAATATGAGCGCTAGCGCATTTGCACCGTCAGAAAAACTGGATAATCGCGTTATTTTTCAGAGCTTTTCACTGTATCAACCGTATGAAAGCAACATGTATAGAACACTGGCAAAAAAAGGCGAACTGCTTAATTCATGGGGAGTTACAGATGTTTGGCTGCCTCCGGCATATAGATCATTTGATATGGCAAGATATATGGAAGGCTATGCGATTGCGGATAGATATGATCTGGGCGAATTTCCGCAAGGCCCTGGCGGATCAGTTGCAACAAAATATGGCAAAGCAACACAGCTGGAAATGATGGTTGATATGCTGCATGATGACAACATCAAAGTCCAAATGGATCTGGTTCCGAATCAAATGCTGGGCCTGAATAAAAGAGAAGCAGTTTTTGTTAGACGCGCAACATCATCAGGCGAACCGTTTATGAATCCGTTTACAGGCGGAGAAAAAACAAAAACACTGGCAACACCGTATCTGGCGTATACAAAAGGCGGAGGCATGGGCCAAGAAAAATATGGCTATCTGAAAGAATGGAACAAATCATTTATCAACGGCACATCACTGCAAGGCCAAGGCATGGGCAGAGTTATGACAGATAAAGATGGCAAACCGTATCGCTATTTTGGCAAAGATGATGCGAATAACTATCTGCCGGAATGGCTGCTGGATGCAGCAAAAACACAAAATCTGAATGTCGTCGATACATATCTGGCAGCAGATGGCTGGTATGAAGTTTCACCGGAAAATTGGAAACCGATGCTGTCACAATATGCAAAAGATGAAGGCTACCTGGAATATATGAAACAGAACGGCTTTGAAACAAAAGAAGCACTGCTGACAAGCACGGAAAATACAAAAATCGCGAGCCTGACGGAAGAATACATGAAAACACAAGCAGCGTATGGCTATGGCTCAGAAGAAAGATCATATCAGAATGATAACAGCGGCATCGATATTGAAGATCAGTTTCTGTTTGTTGATGAAACAGGCTTTCCGACACAAGCGTATAACAAAACAATGACGAACAATGATGAATTTCTGATCGGCGTTGATCTGGCAAATTCAAATCCGGAAGTTATTAAAGAACAGAAAAATTGGATGAAATGGATGCTGGAAACATACAAATTTGACGGCTTTAGAATTGATGCAGCGAGCCATTATGATACAGCAATTCTGAAAGCAGAAGCGGAAATTAGCAAAGCGCATTTTGGCAAACAAGACTATCTGAGCTATATTGAAAGCTATAAAACGGAACAGAATGCGTATATGAAAGCGAACAATAATGAACAGCTGGTCATGGATGGCGAACTGTATTTTACACTGAGATCAGCACTGACACCGAGCAATAAAAGAGCACTGAGAGATCTGGCAAAAGTTAGCGTTGTTAATAGAGAAGGTGATGGCGCAACAAATGTTCAAGCAAATTGGAGCTTTGTCAATAATCATGATCAAGAAAAAAACCGCGTCAATCAGATTATGCTGGATGCGTATGGCATCAAAACAAATACACAGTATGGCAAAGATGGCGAACCGAAATCATTTGAAAAACTGTATAACAAAGAAGATGAAGCGAAAGCGCTGGCGATTTACAATAAAGAACTGGCATCACCGACGAAAAAATACAGCACAGAAAATGTTGTTGCGCAGTATGCATTTCTGCTGAGCAATAAAAACACAGTCCCGACAGTTTATTATGGCGATCTGTATCAGACAGATGCAAGCTATATGTCAAAAACGACGCCGTATTATGACGAAATCACAAATCTGCTGAAAGTCCGCAAACAATATGCTTATGGCAAACAACATGTCGCGTATCATACAAGCAACACATCAAAAGAAGCAGGCAAAGACCTGATTAGCTCAGTCAGATTTGGAAAAGATAGAAATACAGGCGTTGCAACAGTCATTGGCAAAAATGCAGCACTGGATACAACAGTCCAAGTCAATATGGGCAAAACACATGCGAATCAAGTTTTTGTCGACGCATCAGGCGTCACAAATACAAAACTGGTCACAGATAAAAACGGCATTCTGACAGTTCCGGTCAAAGGCATTAAAACAGCGGAAGTTAATGGCTATGTTGGCGTTTTTGTTCCGCAAGCAACAAAAGCACCGGTTGCAGCAATT1AAAGCAGGCGCAGTTTATCAAGGCAAAGCACTGGATCTGAAAACAACAGTGACAAATACAACATCAGCAGTTGCGAGCACAAGATATAGAGTTCTGGATACAAAAAAAGCGACGGTTGATTCAAAAGGCAGACTGACAGGCAAAGCGACAGGCAAAACAACAGTTGAAGCAACAGTTACACTGAAAGATGGCTTTGTTCTGAAAACAGTTCTGCCGATCGAAACAAAAGCAAATTCAGTTACACTTAAAGCCACAAAAGCGACACTGAAAAAAAACCAGACAACACGCATTGCATATACAAGCGCGACAGATAAAATCAAAAGCGTTCAATATGCAAGCGCGAACAAAAAAGTTGCACAAGTTTCATCAAGAGGCAACGTCAAAGGCATCAAAGCGGGAAAAACAACAATTCGCGTTACATATACAACGGTCGGCAACTATAAAGTCGTCAAAACATTTACAGTCACAGTCAAASEQIDNO:6-[凝结芽孢杆菌2-6的α-GT-S的核苷酸序列]TTGGAAAAGAAATTTTTTAGCAGATTGTCAATATTGATGTTGTCTTTGTTACTGGTTGCCGGCTCGATCAGTTATTTTCCTAAATCTGCCAAGGCTTATACATCCGGCACATCGCTCGATAACCGCGTGATTTTCCAAAGTTTTAGCCTGTACATGCCATATGAAAGCAATATGTACAAAATTCTTTCAACGAAAGGCAACGAATTGAAAGATTGGGGGATTACGGATATATGGCTTCCGCCGGCTTACCGTTCTTTCAATGCGGCACGTTACATGGAAGGCTACGCCATTGCCGACCGTTATGACCTCGGTGAATTTAACCAGGGGCCGAATAACACTCGGCCGACCAAATACGGAACAAGCGATGAATTGAAAAGTATGGTTTCCGTGCTTCACGCAAATGGTTTAAAAGTACAGGAAGACCTTGTGCCCAACCAGGTTCTCGGATTGAGCAAAAGGGAAGCAGTTTACGTCACACGCGTAGATCAAGACGGAAATTTGTTTAAAAATCCTTATACAACAGGACTTGCAACGCAAATCAGGGCCAACCTTTATCTCGCTTACACAAAAGGTGGCGGCGAAGGACAGGCAAAATATGGCTATATCAAAGAATGGAACAAAAAATATTTTAACGGTACCTCCTTACAAGGGCAGGGTATGGATCGCGTGATGAAAGACAGCGAGGGCAATCCGTACCGTTATTTTGGGCCAAACAACCCGAAAAACTACTTGCCAAGCTGGCTTGATGAAGCTGCAGCAGCAAATAAAATCAATACAGTTGATACTTATTTGCCAGTAGACGGCTGGTATGCTGCAAAAGACGCTTCGACTTCGGATAATTATTGGAAACCGATGTTAATGCATGACCCTGGCTATTTAAAGTACATGAAAAGCCATGGCTATTCATCTGTTGACGATATACTGAACGGCGACAACGGGCAAATCGCAAGTTTAACAGATGCGTATATTGCATCCCAGCCCGGGTACGGCTTCGGATCGGAAGAAAGGTCGTTTAAAAATGATGATTCCGGATCAGATGACCAGGATCAATTTTTATTTGTGAAAAAGAATGGGACAACTGTTCACAACCTTTACAACACGATCAGCGGGCATAACCAGTTTCTGGTAGGAATGGACATAGACAACGGGAATCCAACTGTCCAAAAAGAACAGATCCACTGGATGAACTGGCTACTTGATACGTATCAGTTTGACGGCTTCAGAATTGATGCGGCAGGCCATTACGATAAGCAAGTGCTGCTGGATGAAGGTGACGTTATGAAACAGCATTTTGGCAGCCATTTAAACGACCATTTAAGCTATATTGAGAGTTATCAAAGTGCCGGGACAGATTTTGAAAATGCAAACGGGAATCCGCAGTTAATGATGGATTATGCCCTGTTCTATTCTTTGCAAAATGCTTTGGGCAAAAATTCGCCATCAAACAGCCTGTCAACCATTGCTACAAACGCTGTTGTCAACAGGGCAAGCGCAGGCACGGCGAATCCAACGCCTAACTGGTCATTTGTGAATAATCATGACCAGGAAAAGAACCGTGTGAATAAAATCATGATGGACCTGTACGTCATTAAGCCGGGTATACATTACGGCACATCCGCACCGAAATCTTTCCAAGATCTGTATGATAAAAAGACAGAGGCAAAAGCTTTGGATATTTATGAAAAAGACATGGAAAGAACGGT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