一种用于PCR快速检测猪圆环病毒3型的试剂盒和方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于快速检测猪圆环病毒3型的检测试剂盒和方法。

背景技术：

猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)属于圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属(circovirus)成员。猪圆环病毒颗粒为二十面体对称、无囊膜包裹的、单股环状dna病毒。病毒粒子直径为17nm，是目前发现的最小的动物病毒。2016年之前猪圆环病毒根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，将pcv分为pcv1和pcv2。pcv1于1974年由德国学者tischer首次在连续传代的pk-15细胞培养物中作为一种污染物被发现，发现其对猪没有致病性。pcv2于1998年首次报道，发现其是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)的主要病原体。1997年在加拿大西部发现pmws以后，在世界上许多国家和地区都有该病的报道。该病主要发生在5～12周龄仔猪，患病动物表现为渐进性消瘦、皮肤苍白、淋巴结肿大、偶有黄疸等病理症状。在中国，该病是由郎洪武等首次发现的。除此之外，pcv2也能够引起猪皮炎肾病综合征(pnds)、母猪繁殖障碍、猪呼吸道综合征及仔猪先天性震颤等多种猪圆环相关疾病(pcvad)。近年来，以pcv2为主要病原引起的猪圆环病毒病在世界范围内广泛流行，该病毒主要侵害猪的免疫系统，并能够造成机体的免疫抑制，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

2016年，在美国北卡罗莱纳州的一个商品化猪场，猪场工作人员发现母猪死亡率增加了10.2％，受孕率降低了0.6％。猪场中一部分母猪表现厌食，皮肤呈现多灶性丘疹，斑点和表面皮炎，这些临床症状与传统的猪圆环病毒病引起的临床症状一致，但对所有母猪和胎儿组织进行免疫组化和荧光定量pcr检测都未检测到对pcv2、高致病性蓝耳病病毒、甲型流感病毒、猪细小病毒等。随后研究人员进行病毒分离，检测到一种新型的圆环病毒3型(pcv3)。该病毒基因组长为2000bp，其能引起猪的皮炎肾病终合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。近期，华中农业大学何启盖教授组在我国首次报到新型猪圆环病毒pcv3的分离鉴定。

目前猪圆环病毒3型为一种新发的猪传染病的病原菌，其能引起猪的皮炎肾病综合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，该病原菌对猪场疾病控制十分重要，这需要对我国pcv3感染情况进行全面的调查。由于我国新发现的猪圆环病毒3型与美国的猪圆环病毒3型有差异，所以目前尚无针对该病原菌的有效检测措施，而现有的检测方法采用在血清样品中检测抗pcv3衣壳抗体的酶联免疫吸附测定，其检测方法检测时间长，灵敏度低，易出现假阴性。因此急需建立一种可以准确检测pcv3病毒的敏感、特异、重复性好的检测方法，这对该病毒的监控以及之后的控制和预防尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一组用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的核酸，本发明的另一个目的在于提供一组用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的试剂盒。本发明的再一个目的是提供一种用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的方法。该检测方法具有快速准确灵敏，特异性强，重复性好，且操作简单成本低，可以同时进行大批量样本检测分析，适用于临床样本的检测。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一组用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如seqidno.1所示，所述下游引物的序列如seqidno.2所示。

一种用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的检测试剂盒，其含有如上所述的引物。

如上所述的试剂盒，优选地，该试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：pcr缓冲液、mgcl2、dntp、dna聚合酶、阴性对照、阳性对照。

如上所述的试剂盒，优选地，所述阳性对照为含有seqidno.3所示序列的质粒载体，所述阴性对照为无核酸酶水。

一种用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的方法，该方法是非诊断目的的检测方法，其采用上述的引物或试剂盒对待检样品进行pcr扩增，并检测扩增产物。具体包括以下步骤：

(1)准备检测样本的dna；

(2)对步骤(1)所述dna进行pcr扩增；其中，在反应体系中，采采用上下游引物的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；

(3)对所述步骤(2)的扩增产物进行电泳；

(4)结果判定：样品出现345bp扩增条带为猪圆环病毒3型检测阳性，否则为阴性。

如上所述的方法，优选地，所述检测样本取自猪的临床病料时，病料总dna提取前还包括病料的预处理，所述病料的预处理为：取脏器组织样本时将样本在灭菌生理盐水中研磨均匀混悬并反复冻融三次后，离心取上清。

如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中的反应体系中，含所述上游引物、下游引物的终浓度为0.5μmol/l，mgcl2终浓度为2.5mmol/l、dntp终浓度为0.2mmol/l，dna聚合酶1unit。

如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中的pcr扩增条件为预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃20s，55-62℃梯度退火20s，72℃20s；最后经过72℃2min延伸。

进一步地，pcr扩增的条件为：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃20s，62℃梯度退火20s，72℃20s；最后经过72℃2min延伸。

如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中，同时设置无核酸酶水为空白对照；采用包含如seqidno.3所示的序列作为阳性对照；所述结果判定时，空白对照无相应的扩增条带时，则样品为猪圆环病毒3型检测阳性，否则为检测阴性。

如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中，可设置无核酸酶水为空白对照；采用包含如seqidno.3所示的序列作为阳性对照，采用无核酸酶水作为阴性对照；所述结果判定：当设置有阴性对照时，如果样品扩增产物出现345bp扩增条带，且阴性对照无相应的扩增条带时，则样品为猪圆环病毒3型检测阳性，否则为检测阴性；当设置阳性对照时，如果待检样品中未出现345bp扩增条带，阳性样品出现相应条带，则样品为阴性，如果阳性样品中未出现345bp扩增条带，则结果存疑，应重新检测。

在检测过程中，同时设置有阴性对照和阳性对照，用于监测检测过程中是否有污染或操作是否规范，及所用试剂是否有效，能充分保证检测结果的准确、可靠，有效避免假阳性及假阴性结果的发生。

本发明的有益效果为：

本发明提供了用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的核酸、试剂盒及方法。其中，方法快速准确灵敏，特异性强，重复性好，且操作简单成本低，可以同时进行大批量样本检测分析，适用于临床检测或流行病学调查，可在两个小时内对临床病料进行快速准确诊断。对保存的来自于河北省和北京郊区不同猪场的疑似pmws的病料进行检测，从30份临床样品中检测到6份为pcv3阳性，阳性率为16.7％。

本发明提供的用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的试剂盒及方法，对pcv2、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪流感病毒、猪细小病毒等的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。本发明的检测方法具有其检测灵敏度高、特异性强，能有效避免假阴性。

附图说明

图1为核酸序列比对分析结果。

图2为本发明方法对对猪圆环病毒3型进行检测的pcr扩增电泳图。

图3为本发明方法中pcr扩增过程中不同退火温度的电泳结果。

图4为本发明方法灵敏度检测电泳结果。

图5为本发明方法对其它常见的猪病病原进行pcr检测的电泳结果。

图6为本发明方法对临床样本检测的电泳结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下列实施例中常规的实验方法，可参见sambrook等编写的分子克隆书。仪器的使用参照仪器操作说明进行。

实施例1引物、探针的设计

本发明中，选用猪圆环病毒3型的全基因序列pcv3-μs/mn2016(kx898030.1)作为检测的靶基因，在本发明引物和探针设计中，通过对截止至2017年8月31日所公布的猪圆环病毒3型共计22株病毒的全基因进行的核酸序列比对分析，得到其保守性区域，并分析所有猪圆环病毒3型的全基因序列，寻找特异性位点，设计pcr引物，因pcv3的全基因组较小(2000bp)且g/c含量较高，在引物设计时选择一条特异性高，灵敏度好的通用型引物，需要扎实的生物信息学知识进行分析及丰富的经验，并且需要通过大量实验进一步验证摸索出引物的特异性是否是最优的，还需要通过实验确定出最佳反应条件及体系。如图1所示，其中a为上游引物、b为下游引物的比对分析图，经过大量筛选得到综合性能优异的扩增引物的序列为：

上游引物seqidno.1：5’-gtgccgtagaagtctgtcatt-3’；

下游引物seqidno.2：5’-tacactcagccctgtaatttct-3’；

其扩增片段大小为345bp，即扩增的阳性产物为345bp，序列如seqidno.3所示：gtgccgtagaagtctgtcattccagttttttcagggacataaatgctccaaagcagtgctccccattgaacggtggggtcatatgtgttgagccatggggtgggtctggagaaaaagaagaggctttgtcctgggtgagcgctggtggttcccgccagaattggtttgggggtgaagtaacggctgtgtttttttttagaagtcataactttacgagtggaactttccgcataagggtcgtcttggagccaagtgtttgtggtccaggcgccgtctagatctatggctgtgtgcccgaacatagtttttttttgctgagccggagaaattacagggctgagtgta。

实施例2目的片段的pcr扩增

包括以下步骤：

(1)准备pcv3病毒的dna模板；

(2)对步骤(1)中dna样品进行pcr扩增：反应体系采用：样品中提取的dna2μl、10μm的上游引物1μl、10μm的下游引物1μl、2×pcr预混液10μl、ddh2o6μl加入到0.2mlpcr反应管中，并充分均匀。

(3)反应：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃20s，采用55-62℃范围内梯度退火20s，72℃20s，最后经过72℃2min延伸，其中退火温度分别设为55℃、58℃、60℃、62℃。

(4)反应结束后，取5μlpcr产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察并拍照，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带。在345bp处见一特异性条带，与预期的大小一致。结果如图2所示，其中，点样顺序分别为：1、2、3、4、分别代表退火温度为55℃、58℃、60℃、62℃的pcv3扩增产物；m:dnamarker。

将pcr产物按照dna凝胶回收试剂盒说明书的要求进行切胶回收目的条带，回收产物送去生物公司进行测序，测序的结果与genbank中的pcv3序列进行比较，结果显示扩增的条带为pcv3序列。

实施例3用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的方法

用于pcr快速检测猪圆环病毒3型方法的建立，具体包括以下步骤：

(1)准备检测样本的dna；

组织样本处理：采集有pmws症状的发病猪的小肠、肝脏、肺脏等病变组织，取一克脏器组织加入0.5ml灭菌生理盐水并用研磨器进行研磨混悬，放入-80℃低温冰箱中反复冻融三次，组织悬液4℃3000rpm离心10min后取上清用于检测。组织悬液上清按照基因组dna快速抽提试剂盒(qiagen)的说明书进行操作。提取的dna模板-20℃保存备用。

(2)对步骤(1)中dna样品进行pcr扩增：反应体系采用：pcr缓冲液；

mgcl2终浓度为2.5mmol/l，dntp终浓度为0.2mmol/l，taqdna聚合酶1unit；上游引物终浓度为0.5μmol/l，下游引物终浓度为0.5μmol/l，模板dna为2.0μl，加ddh2o至总体积为20μl。

其中，taqdna聚合酶的终浓度为本领域常规参数，模板的终浓度可以由本领域技术人员经实验确定，以能获得有效的pcr扩增反应为目标。所述的有效的pcr扩增反应是指当dna模板中含有足量目标dna序列可以进行pcr扩增反应时，扩增产物的量足以被检出，电泳显示结果为阳性。

(3)由实施例2中的结果表明采用退火温度为62℃时，效果最优，所用pcr扩增反应的条件为预变性94℃5min；94℃20s,62℃梯度退火20s，72℃20s，30个循环；最后经过72℃2min延伸。

(4)反应结束后，取5μlpcr产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果如图3所示，其中点样顺序为：样本1(河北隆尧株)；m：dnamarker；n:阴性对照。

本发明建立的方法中为了避免所用试剂失效或受到污染，还设置有作为阳性对照、阴性对照试剂。

阳性对照采用携带有扩增产物的质粒dna，扩增产物的核苷酸序列含有如seqidno.3所示的序列；阴性对照采用无核酸酶去离子水；

空白对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生；阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

实施例4灵敏度的检测

1.dna标准品的制备

dna标准品采用生物公司合成的seqidno.3序列，将其进行稀释，稀释后的dna含量为10ng/μl。

2.采用实施例3中的pcr方法检测灵敏度检测

取1μl系列稀释的dna标准品作为模板，采用实施例3中优选地方法进行检出限分析。

检测结果，扩增曲线如图4所示，其中1号0.1ng/μl，2号1ng/μl，3号10ng/μl。结果显示，pcr方法对猪圆环病毒3型基因的检出限为0.1ng/μl。

实施例5特异性的检测

采用实施例3中所建立的方法，对保存于北京市农林科学院畜牧兽医研究所高新技术实验室-80度低温冰箱中保存的pcv2、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪流感病毒、猪细小病毒等进行检测。

结果是上述病毒检测结果均为阴性。扩增曲线如图5所示，其中，点样顺序为：p：阳性对照；m：dnamarker；n：阴性对照；1：pcv2、2：猪瘟病毒、3：猪流行性腹泻病毒、4：猪繁殖与呼吸综合征病毒、5：猪脑心肌炎病毒、6：猪伪狂犬病毒、7：猪流感病毒、8：猪细小病毒。

结果表明，本发明提供的pcr检测方法能够特异性的检测pcv3。

实施例6对临床病料检测的应用

1.病毒株和临床样品的来源

本申请的发明人对保存的最近几年从河北省和北京郊区不同猪场的疑似pmws的病料进行检测，其来源见表1。

表1病料来源

2.病毒dna的提取

组织样本处理：采集有pmws症状的发病猪的小肠、肝脏、肺脏等病变组织，取一克脏器组织加入0.5ml灭菌生理盐水并用研磨器(上海森信实验仪器有限公司)进行研磨混悬，放入-80℃低温冰箱中反复冻融三次，组织悬液4℃3000rpm离心10min后取上清用于检测，其中离心采用低温台式离心机为eppendorf公司产品。

明书进行操作。提取的dna模板-20℃保存备用。

3.pcr方法的检测

采用实施例3所述方法对上述提取的dna模板进行检测。

4.结果

30份临床样品中检测到6份为pcv3阳性，电泳结果见图6所示，并对其阳性样品进行了全基因测序，全基因测序的结果与genbank中序列进行比对，获得与genbank登录号中序列一致的结果，说明本发明所建立的方法检测准确性达100％。检测结果具体见下表2。图6中，m:dnamarker；n:阴性对照；其中9号(河北隆尧)、10号(河北邯郸)、13号(河北新集)、21号(河北保定)、28号(北京密云)、29号(北京延庆)为检测阳性。由此可以看出，本申请建立的快速猪圆环病毒3型的特异性pcr检测方法与测序结果相符，准确性高，同时对来自不同采样时间和地点的不同部位的病料样本均使用。

表2检测结果

pcr技术作为一种经典的检测方法，已在多个领域中得到广泛应用，因其具有较强的准确度、灵敏度和特异性，能够对临床样品进行快速的检测，技术含量要求低，这弥补了传统检测方法的费力和费时的缺点。本发明根据genbank中已发布的pcv3的序列设计了一对特异性检测引物，通过对反应条件进行摸索和优化，建立了pcv3的特异性pcr检测方法，具有较好的准确性和特异性，并用此方法对保存的30份最近几年从河北省和北京郊区不同猪场的疑似pmws的病料进行检测，阳性率可达16.7％，说明pcv3在该地区存在一定的危害性。检测准确性可达100％，说明该方法的建立有助于进一步对我国猪场的pcv3感染情况进行全面的调查，这对该病的监控以及之后的控制和预防尤为重要。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>一种用于pcr快速检测猪圆环病毒3型的试剂盒和方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtgccgtagaagtctgtcatt21

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tacactcagccctgtaatttct22

<210>4

<211>345

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtgccgtagaagtctgtcattccagttttttcagggacataaatgctccaaagcagtgct60

ccccattgaacggtggggtcatatgtgttgagccatggggtgggtctggagaaaaagaag120

aggctttgtcctgggtgagcgctggtggttcccgccagaattggtttgggggtgaagtaa180

cggctgtgtttttttttagaagtcataactttacgagtggaactttccgcataagggtcg240

tcttggagccaagtgtttgtggtccaggcgccgtctagatctatggctgtgtgcccgaac300

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