一种用于检测猪圆环病毒2型和3型的试剂盒、引物对、探针及方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种用于检测猪圆环病毒2型(pcv-2)和3型(pcv-3)的试剂盒、引物对、探针及方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcinecircovirus2,pcv-2)广泛存在于自然界中，对猪有很强的感染力，各种品种、年龄、不同性别的猪只均可感染。pcv-2主要侵害猪的免疫系统，降低机体的抵抗力和免疫应答反应，导致被感染的猪产生免疫抑制和其它病原微生物的继发感染。该病毒与猪群中发生的许多疾病关系密切，这些相关疾病统称为猪圆环病毒相关疾病(pcvad)。pcv-2在世界范围内广泛分布并且在猪群中存在至少有50多年，血清学和病原学调查己证实全世界范围内许多国家和地区的猪群均存在pcv-2感染，几乎100％的商品化养猪场感染过pcv-2，严重影响世界养猪业的发展。自2000年猪圆环病毒病首次在我国报道以来，除西藏、新疆、澳门未见报道外，其余各省、市、自治区均有pcv-2病毒分离和发生感染的报道。王佳慧利用pcr方法对中国16个省市75个规模化猪场2010-2011年间的688份样品进行检测，被检猪场pcv-2阳性率为58.67％。

2016年美国学者phan等报道了一种新的猪圆环病毒亚型-猪圆环病毒3型(porcinecircovirus3,pcv-3)，携带该病原的猪呈现生长发育不良、心脏和多系统炎性浸润等病理变化，随后palinski等也从表现皮炎肾病综合症的猪体内检测到了pcv-3，这些研究结果意味着新出现的pcv-3作为一种新的致病病原必须引起人们的重视。随后，中国、韩国、波兰、巴西等国家陆续报道了该病，表明该病已经在世界各地广为传播。2017年我国学者deng等采用间接elisa对我国猪群开展了pcv3的血清学调查，结果发现，2015-2017年间，我国猪群pcv3的感染率从22.35％上升到51.88％，表明pcv3已经在我国猪群流行和扩散，防控形势非常严峻。

据报道，pcv-3可导致母猪厌食、皮炎肾病综合征、繁殖障碍，如流产、产木乃伊胎、死胎、弱仔等症状，其症状与pcv-2相似；由于pcv-3可从患有pdns症状母猪及其流产胎儿体内检出，间接证明pcv-3具有垂直传播的特性；同时有研究表明该病毒可通过公猪精液传播。fan等报道从湖北和广东发生繁殖障碍的母猪和急性死亡仔猪体内发现了该病毒。shen等和ku等报道表明我国已有13个省的猪群中都感染了pcv-3，主要分布在中东部地区。ku等报道的通过普通pcr从辽宁、重庆3个猪场中的22份样品中发现，pcv-3和pcv-2单独感染率各为62.29％和34.7％，混合感染率为15.8％。鉴于pcv-3和pcv-2所引起的疾病症状非常相似，在临床上很难区分，且pcv-3呈现多地域感染的现状，建立快速、准确的鉴别pcv-3和pcv-2的方法是有效诊断和防控我国猪群感染pcv-3和pcv-2的基础。

目前多有检测pcv-2或者pcv-3的单通道荧光定量pcr(郭慧娟,李秀丽,张国伟等.猪圆环病毒2型taqman荧光定量pcr检测方法的建立[j].中国畜牧兽医,2014,41(5):39-45.；张志,郝占武,张美晶,等.猪圆环病毒3型实时荧光定量pcr方法的建立和应用[j].中国兽医科学,2018,48(065):686-691.)，然而其检出量高从而导致检测的敏感性较低，且每次仅能检出一种病毒，检测速度慢、效率低。尽管也有专利申请(cn108265126a)公开了可同时检测pcv-2和pcv-3的二重pcr检测方法，然而也存在检出度高(针对pcv-2和pcv-3的检出度分别高达508拷贝/μl和412拷贝/μl)而导致的敏感性较低的问题。

因此，建立检测pcv-2和pcv-3的双重荧光pcr能够快速、准确的鉴别pcv-2和pcv-3的感染，为pcv-2和pcv-3感染的流行病学调查及监测提供切实可行的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前对pcv-2和pcv-3的检测基本都采用单通道荧光pcr方法或者二重pcr所具有的敏感性低、反应时间长等缺陷，而提供一种检测猪圆环病毒2型(pcv-2)和3型(pcv-3)的试剂盒、引物对、探针及方法，在闭管状态下进行扩增产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强；可同时实现pcv-2和pcv-3两种病毒的检测，大大缩短了检测时间，降低了检测成本；pcr后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染。因此，本方法特异性强、敏感性高、快速、安全，对样品中含微量pcv-2和pcv-3基因组的检测效果良好，可用于pcv-2和pcv-3的实验室检测和分子流行病学调查。

双通道中通常含有两对以上的引物以及两个以上不同的探针，而根据本领域常识：同时使用的多个引物其在设计过程中需要兼顾不同引物的tm值以及各个引物的特异性问题，还需要尽量避免多个引物的混合容易出现的引物之间形成二聚体的情况；不同探针的设计以及同时使用也存在类似的问题。而本发明的发明人在付出创造性劳动后，意外得到了特异性高、敏感性好且两对引物和与之同时使用的两个探针。为后续猪圆环病毒检测的发展提供了支点。

本发明提供的技术方案之一是：一种用于检测猪圆环病毒2型(pcv-2)和猪圆环病毒3型(pcv-3)的试剂盒，其包括pcr反应体系，所述pcr反应体系包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括两引物对和两探针，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示，所述探针的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示。其中，序列如seqidno.1和2所示的引物对用于检测pcv-2，序列如seqidno3和4所示的引物对用于检测pcv-3，序列如seqidno.5和6所示的探针分别用于检测pcv-2和pcv-3。

为提高扩增效率，所述pcr反应体系中的引物的浓度较佳地分别为200～400nm，更佳地为200nm；所述探针的浓度较佳地为200～400nm，更佳地为400nm。

较佳地，所述pcr反应体系还包括pcr反应液和taq酶，所述pcr反应液包括mg²⁺、dntp以及pcr反应缓冲液，所述taq酶为热启动taq酶；其中，所述mg²⁺的浓度较佳地为1～2.5mmol/l，更佳地为2.0mmol/l；所述dntp的浓度较佳地为0.1～0.25mmol/l，更佳地为0.2mmol/l；所述pcr缓冲液较佳地为2×pcr缓冲液；所述热启动taq酶的用量较佳地为0.1～0.5u/反应。

在本发明一较佳实施例中，所述的引物探针混合液由所述两引物对和所述两探针组成，其中所述两引物对(包含两个上游引物和两个下游引物：pcv2-f、pcv3-f、pcv2-r和pcv3-r)中各引物的量为0.5μl、浓度为10μm；所述两探针中，各探针的量为0.5μl、浓度为10μm；所述pcr反应液由10μl2×pcr缓冲液、2μl25mm的mgcl2、1μl10mm的dntp以及2μldepc-h2o组成，所述taq酶为1μl5u/μl的taq酶。

更佳地，为了更直观、准确地判定检测结果，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照优选含有pcv-2和pcv-3目的基因序列的重组质粒，较佳地，所述阳性对照的浓度为3.1×10⁶拷贝/μl；所述阴性对照优选去离子水，更优选depc-h2o。

进一步更佳地，所述的试剂盒还包括dna提取试剂。本发明中，所述的dna提取试剂可以是本领域常规的提取动物病毒总dna的试剂，较佳地，所述的dna提取试剂包括样品裂解液、氯仿、depc-乙醇、异丙醇和depc-h2o中的一种或多种；所述的样品裂解液优选trizol，所述的depc-乙醇优选质量百分数为75％的depc-乙醇。

本发明的一较佳实例为：一种用于检测pcv-2和pcv-3的试剂盒，其包括：

(1)dna提取试剂，包括：

样品裂解液管：trizol750μl；氯仿管：氯仿200μl；75％乙醇管：75％depc-乙醇800μl；异丙醇管：异丙醇600μl；depc-h2o管：11μl；以上为适合提取1个样本的总dna的试剂用量；所述的dna提取试剂需要4℃保存；

(2)反应体系，包括：

引物探针混合液管：10μmpcv-2和pcv-3上、下游引物各0.5μl，10μm探针(pcv2-p和pcv3-p)各0.5μl，合计3μl；pcr反应液管：2×pcr缓冲液(无mg²⁺)(pcrbuffer(无mg²⁺))10μl，25mmmgcl22μl，10mmdntp1μl，depc-h2o3μl，合计16μl；taq酶管：5u/μltaq酶1μl，合计1μl；以上为单次反应的试剂用量，所述的反应体系需要-20℃保存；

(3)阳性对照管：浓度为3.1×10⁶拷贝/μl的pcv-2和pcv-3阳性质粒5μl；

(4)阴性对照管：depc-h2o5μl。

上述较佳实例中，所述的2×pcr缓冲液(无mg²⁺)(pcrbuffer(无mg2+))、25mmmgcl2、2.5mmdntp混合物和taq酶也可以使用本领域常规的试剂盒产品，如可以使用荧光rt-pcr试剂盒(realtimepcrkit)替代上述几种试剂，优选takara公司产品荧光pcr试剂盒(primescript^tmpcrkit(perfectrealtime))。

本发明提供的技术方案之二是：检测pcv-2和pcv-3的引物对，所述引物对的一对是序列如seqidno.1和seqidno.2所示的核酸，另一对是序列如seqidno.3和seqidno.4所示的核酸；所述的检测优选通过实时荧光定量pcr进行。

本发明提供的技术方案之三是：检测pcv-2和pcv-3的探针，所述探针的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；所述的检测优选通过实时荧光定量pcr进行。

本发明提供的技术方案之四是：检测pcv-2和pcv-3的组合，所述的组合包括引物对和探针，所述的引物对的一对是序列如seqidno.1和seqidno.2所示的核酸，另一对是序列如seqidno.3和seqidno.4所示的核酸；所述的探针的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；较佳地，所述的检测通过实时荧光定量pcr进行。

本发明提供的技术方案之五是：所述的引物对和/或所述的探针，或者所述的组合在制备检测pcv-2和pcv-3的试剂盒中的应用；较佳地，所述试剂盒为双通道实时荧光定量pcr试剂盒。

本发明提供的技术方案之六是：一种非诊断目的的检测pcv-2和pcv-3的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)使用dna提取试剂提取待检样品中的总dna；

(2)以步骤(1)提取的总dna为模板，利用所述试剂盒中的pcr反应体系进行pcr反应；

(3)分析检测结果。

其中，步骤(1)所述的提取待检样品的总dna的方法为本领域常规，较佳地为采用trizol法提取样品的总dna。步骤(1)中所述dna提取试剂较佳地包括样品裂解液、氯仿、depc-乙醇、异丙醇和depc-h2o中的一种或多种；更佳地，所述样品裂解液为trizol，所述depc-乙醇为质量百分数为75％的depc-乙醇；

较佳地，步骤(2)所述的荧光pcr反应的反应过程为：分别取引物探针混合液2～4μl、pcr反应液15～17μl、taq酶1～2μl配制成18～23μl反应体系，再加入2～7μl步骤(1)所得的dna。将pcv-2和pcv-3阳性质粒作为阳性对照样品，depc-h2o作为阴性对照样品，与待检样品dna同时进行荧光pcr反应。

步骤(2)中所述pcr反应的反应条件优选为：

(1)94～95℃10～15min；(2)94～95℃10～15s；(3)55～60℃35～60s；(2)-(3)循环40～45次(收集荧光信号)。

本发明中，步骤(3)所述的分析检测结果的操作过程可为本领域常规，较佳地，所述的分析检测结果的操作过程如下：反应结束后，阳性对照应用两个检测通道读取数据时，应出现两条相应的典型扩增曲线，且ct值≤30；阴性对照应用两个检测通道读取数据时，均无ct值且无扩增曲线。二者均成立可判定试验成立，否则试验无效。若两个检测通道ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表明pcv-2和pcv-3病毒核酸均为阳性；如仅fam检测通道出现典型的扩增曲线，且ct值≤35，而hex检测通道无ct值且无典型扩增曲线，表明pcv-2核酸阳性；如仅hex检测通道出现典型的扩增曲线，且ct值≤35，而fam检测通道无ct值且无典型扩增曲线，表明pcv-3核酸阳性。若双检测通道均无ct值且无典型扩增曲线，表明样品中无pcv-2和pcv-3病毒核酸。若任一检测通道ct值＞35，且出现典型的扩增曲线的样品建议重复试验，重复试验结果相同为阳性，否则为阴性。

本发明的一较佳实例为：一种非诊断目的的检测pcv-2和pcv-3的方法，其是一种采用荧光定量pcr检测pcv-2和pcv-3的方法，其包括如下步骤：

(1)样品总dna的提取：于750μltrizol裂解液中加入待测样品200μl，混匀，15～25℃静置5min后，再加入200μl氯仿，振荡混匀，于4℃、12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μl于-20℃预冷的异丙醇，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μl75％depc-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于15～25℃干燥后加入11μldepc-h2o溶解，备用。

(2)pcr反应与结果分析：分别取引物探针混合液3μl、pcr反应液16μl、taq酶1μl配制成反应体系。

取阴性对照、标本、阳性对照各5μl，分别加入反应体系中使用市售的荧光定量pcr仪(如viia7)进行pcr扩增。pcr循环条件是：94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。

反应结束后保存检测数据文件。根据pcr扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。如扩增曲线有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的用于检测pcv-2和pcv-3的方法具有特异性好，敏感性高(检测限可低至3.1×10¹拷贝/μl)，操作简单、快速，能够同时检测pcv-2和pcv-3，省时省力等优点；本发明试剂盒具有成本低、检测速度快、不易污染、结果易于判定等优点，适用于pcv-2和pcv-3感染的快速诊断。本发明方法和试剂盒还适合大规模的流行病学调查研究。因此，本发明的检测方法和试剂盒具有很好的应用前景。

附图说明

图1为组合1检测pcv-2和pcv-3的双通道的荧光pcr的扩增曲线结果，用depc-h2o对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μl检测用量中的拷贝数分别为3.1×10⁷、3.1×10⁶、3.1×10⁵、3.1×10⁴、3.1×10³拷贝/μl进行扩增后，以检测pcv-2的fam通道和以检测pcv-3的hex通道均出现典型的s型扩增曲线，指数区较明显。

图2为组合1检测pcv-2和pcv-3的双通道的荧光pcr的标准曲线结果，用depc-h2o对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μl检测用量中的拷贝数分别为3.1×10⁷、3.1×10⁶、3.1×10⁵、3.1×10⁴、3.1×10³拷贝/μl进行扩增，3个重复，fam和hex检测通道的标准品起始模板浓度与ct值均呈现良好的线性关系；fam检测通道：斜率接近-3.407，相关系数r²为0.990；fam检测通道：斜率接近-3.271，相关系数r²为0.994。

图3为组合2检测pcv-2和pcv-3的双通道的荧光pcr的扩增曲线结果，用depc-h2o对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μl检测用量中的拷贝数分别为3.1×10⁷、3.1×10⁶、3.1×10⁵、3.1×10⁴、3.1×10³拷贝/μl进行扩增后，以检测pcv-2的fam通道和以检测pcv-3的hex通道均出现典型的s型扩增曲线，指数区较明显。

图4为组合2检测pcv-2和pcv-3的双通道的荧光pcr的标准曲线结果，用depc-h2o对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μl检测用量中的拷贝数分别为3.1×10⁷、3.1×10⁶、3.1×10⁵、3.1×10⁴、3.1×10³拷贝/μl进行扩增，3个重复，fam和hex检测通道的标准品起始模板浓度与ct值均呈现较好的线性关系；fam检测通道：斜率接近-3.37，相关系数r²为0.985；fam检测通道：斜率接近-3.09，相关系数r²为0.991。

图5为组合1检测pcv-2和pcv-3的双通道的荧光pcr的特异性试验结果，7份特异性参考品中，仅含pcv-2和pcv-3目的基因的阳性质粒的扩增曲线为s型扩增曲线，其他6份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有ct值，可明确判定为阴性；6份特异性参考品分别为伪狂犬病毒疫苗株(prv)、猪细小病毒(ppv)疫苗株、猪瘟病毒(csfv)疫苗株、蓝耳病病毒(prrsv)疫苗株、乙型脑炎病毒(jev)疫苗株、布鲁氏菌抗原等等其他易造成猪繁殖障碍的病原体。

图6为组合2检测pcv-2和pcv-3的双通道的荧光pcr的特异性试验结果，7份特异性参考品中，含pcv-2和pcv-3目的基因的阳性质粒的扩增曲线为s型扩增曲线，prv疫苗株出现非s型扩增曲线且与基线交叉，有ct值，可判为假阳性。其他5份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有ct值，可明确判定为阴性；6份特异性参考品分别为猪细小病毒(ppv)疫苗株、猪瘟病毒(csfv)疫苗株、蓝耳病病毒(prrsv)疫苗株、乙型脑炎病毒(jev)疫苗株、布鲁氏菌抗原等等其他易造成猪繁殖障碍的病原体。

图7为组合1检测pcv-2和pcv-3的双通道的荧光pcr的敏感性试验结果，7份敏感性参考品中浓度为3.1×10⁰拷贝/μl的样本在fam和hex检测通道中扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有ct值，可明确判定为阴性。其余样本在fam和hex检测通道中均有s型扩增曲线可明确判定为阳性。

图8为组合2检测pcv-2和pcv-3的双通道的荧光pcr的敏感性试验结果，7份敏感性参考品中浓度为3.1×10⁰拷贝/μl的样本在fam和hex检测通道中扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有ct值，可明确判定为阴性。浓度为3.1×10¹拷贝/μl的样本在fam和hex检测通道中有扩增曲线且ct值大于35，可判断为阴性，其余样本在fam和hex检测通道中均有s型扩增曲线可明确判定为阳性。

图9为某猪场检测pcv-2和pcv-3的荧光pcr的检测图，其中，p1、p2分别为pcv-3、pcv-2阳性对照；n1、n2分别为pcv-3、pcv-2阴性对照；s1～s3为3份猪流产胎儿样品。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中所用引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

部分试剂和仪器来源如下：

2×pcr缓冲液(pcrbuffer)(无mg²⁺)、25mmmgcl2、10mmdntp混合物、5u/μltaq酶以及荧光pcr试剂盒[primescript^tmpcrkit(perfectrealtime)]均购自宝生物工程(大连)有限公司；

viia7为赛默菲产品；

伪狂犬病毒(prv)疫苗株、猪细小病毒(ppv)疫苗株、乙型脑炎病毒(jev)疫苗株、均为武汉科前动物生物制品有限责任公司产品；

猪瘟病毒(csfv)疫苗株、蓝耳病病毒(prrsv)疫苗株均为上海海利生物技术股份有限公司产品；

布鲁氏菌抗原为青岛立见诊断技术发展中心产品。

实施例1特异性引物和探针的设计

根据pcv2orf2基因的保守序列设计引物和探针，再根据pcv3orf1基因的保守序列设计引物和探针，如下表1所示，按照以下序列，合成特异性荧光rt-pcr引物和探针。以depc-h2o稀释引物至10μm，-20℃保存备用。

表1引物和探针组合

其中pcv2-f1的核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示，pcv2-r1的核苷酸序列如序列表中seqidno.2所示，pcv3-f1的核苷酸序列如序列表中seqidno.3所示，pcv3-r1的核苷酸序列如序列表中seqidno.4所示，pcv2-p1的核苷酸序列如序列表中seqidno.5所示，pcv3-p1的核苷酸序列如序列表中seqidno.6所示。

实施例2反应体系的建立和优化

1、样品的准备：合成目的扩增区域pcv-2orf2(ncbigeneid:2943185；porcinecircovirustype2strainsd,completegenome，genbank:ay181947.1)和pcv-3orf1(porcinecircovirus3strainhenan-zz-2016,completegenome；genbank:mg860486.1)，连接到puc57载体，转化到dh5α受体菌，挑选阳性克隆，构建成含有pcv-2和pcv-3目的扩增区域的阳性质粒作为pcv-2和pcv-3检测的阳性对照；以伪狂犬病毒(prv)疫苗株、猪细小病毒(ppv)疫苗株、猪瘟病毒(csfv)疫苗株、蓝耳病病毒(prrsv)疫苗株、乙型脑炎病毒(jev)疫苗株、布鲁氏菌抗原作为特异性参考品；以去离子水作为阴性对照，分别用trizol提取上述阳性对照与特异性参考品的rna，阴性对照待用。

2、引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从100nm/反应至400nm/反应梯度的引物和探针进行pcr反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在200～400nm/反应之间均可，其中最佳的引物浓度为200nm/反应、探针浓度为400nm/反应。

3、镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mmol/l至2.5mmol/l浓度梯度的镁离子进行pcr反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2.0mmol/l。

4、dntp浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/l至0.25mmol/l浓度梯度的dntps进行pcr反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dntp浓度为0.2mmol/l。

5、热启动taq酶用量的优化：在25μl反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1u(酶单位)至8u浓度梯度的酶用量/反应进行pcr反应，经多次重复试验，最终确定最佳的热启动taq酶用量为0.1～0.5u/反应。

6、反应温度的优化：根据酶的活性和靶核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：94℃15min，1个循环；95℃15s，55～60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。

实施例3标准曲线的建立

将pcv-2和pcv-3阳性质粒dna用分光光度计测定浓度后，用depc-h2o对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μl检测用量中的拷贝数分别为3.1×10⁷、3.1×10⁶、3.1×10⁵、3.1×10⁴、3.1×10³拷贝/μl，设置3个重复，进行扩增，反应结束后，利用vii荧光定量pcr分析软件自动得到标准曲线。结果显示以引物(pcv2-f1和pcv2-r1)和探针pcv2-p1建立的检测pcv-2的fam检测通道，出现典型的s型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与ct值呈现具有良好的线性范围，斜率接近-3.407，相关系数r²为0.990(见图1、2)。以引物(pcv3-f1和pcv3-r1)和探针pcv3-p1建立的检测pcv-3的hex检测通道，出现典型的s型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与ct值呈现具有良好的线性范围，斜率接近-3.271，相关系数r²为0.994(见图1、2)。根据ct值和标准曲线即可对样品进行准确定量。

实施例4特异性和敏感性试验

采用实施例3中所述优化的体系及扩增条件，取6份特异性参考品分别为伪狂犬病毒(prv)疫苗株、猪细小病毒(ppv)疫苗株、猪瘟病毒(csfv)疫苗株、蓝耳病病毒(prrsv)疫苗株、乙型脑炎病毒(jev)疫苗株、布鲁氏菌抗原等6个样本，提取核酸，采用荧光pcr进行试剂盒的特异性试验。其中，(1)样品dna的提取：于750μltrizol裂解液中加入待测样品200μl，混匀，15～25℃静置5min后，再加入200μl氯仿，振荡混匀，于4℃、12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μl于-20℃预冷的异丙醇，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μl75％depc-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于15～25℃干燥后加入11μldepc-h2o溶解，备用。(2)pcr反应：分别取引物探针混合液3μl、pcr反应液16μl、taq酶1μl配制成反应体系。荧光pcr的条件如下：1个循环；94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。

建立的双通道荧光pcr结果表明含pcv-2和pcv-3目的基因的阳性质粒在fam和hex通道均出现s型扩增曲线。而伪狂犬病毒(prv)疫苗株、猪细小病毒(ppv)疫苗株、猪瘟病毒(csfv)疫苗株、蓝耳病病毒(prrsv)疫苗株、乙型脑炎病毒(jev)疫苗株、布鲁氏菌抗原均没有出现特异性扩增曲线(见图5)，说明所建立的双通道荧光pcr的特异性好。

将含pcv-2和pcv-3目的基因的阳性质粒dna用分光光度计测定浓度后，用depc-h2o对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μl检测用量中的拷贝数分别为3.1×10⁶、3.1×10⁵、3.1×10⁴、3.1×10³、3.1×10²、3.1×10¹、3.1×10⁰拷贝/μl进行荧光pcr扩增，结果表明以引物(pcv2-f1和pcv2-r1)和探针pcv2-p1建立的检测pcv-2的荧光pcr方法的最低检测限约为3.1×10¹拷贝/μl(见图7)，以引物(pcv3-f1和pcv3-r1)和探针pcv3-p1建立的检测pcv-3的荧光pcr方法的最低检测限约为3.1×10¹拷贝/μl(见图4)。而郭慧娟等(郭慧娟,李秀丽,张国伟等.猪圆环病毒2型taqman荧光定量pcr检测方法的建立[j].中国畜牧兽医,2014,41(5):39-45.)建立的单通道检测pcv2的荧光定量pcr，最低可检测到4.53×10²拷贝/μl，组合1的敏感性是现有技术(可检出量为4.53×10²拷贝/μl)的15倍。而张志等(张志,郝占武,张美晶,等.猪圆环病毒3型实时荧光定量pcr方法的建立和应用[j].中国兽医科学,2018,48(065):686-691.)建立的单通道检测pcv3的荧光定量pcr，最低可检测到50拷贝/μl，组合1的敏感性是现有技术(可检出量为50拷贝/μl)的1.6倍。由此可见，本发明的敏感性高于现有单通道荧光定量pcr的敏感性。

实施例5试剂盒的组装

按照总dna提取和荧光pcr两个部分完成试剂盒组分的配制，以下提供的数据及试剂组成为单次荧光pcr检测所需试剂：

(1)总dna提取(4℃保存)

样品裂解液管：trizol750μl；

氯仿管：氯仿200μl；

75％乙醇管：75％depc-乙醇800μl；

异丙醇管：异丙醇600μl；

depc-h2o管：11μl；

(2)荧光pcr(-20℃保存)

引物探针混合液管：10μmpcv-2和pcv-3上、下游引物各0.5μl，10μm探针(pcv2-p和pcv3-p)各0.5μl，合计3μl；

pcr反应液管：2×pcr缓冲液(无mg²⁺)(pcrbuffer(无mg²⁺))10μl，25mmmgcl22μl，10mmdntp1μl，depc-h2o3μl，合计16μl；

taq酶管：5u/μltaq酶1μl；

阳性对照管：浓度为3.1×10⁶拷贝/μl的含pcv-2和pcv-3目的基因的阳性质粒5μl；

阴性对照管：depc-h2o5μl。

按照48份检测剂量为一个包装，将上述配制好的试剂分别装入10个无rnase酶的瓶或管中，并按照相应的储存温度保存运送。

实施例6试剂盒的应用

采用本发明的双通道检测pcv-2和pcv-3荧光定量pcr检测试剂盒对上海某猪场送检的3份流产胎儿样品进行检测。

(1)样品的预处理

用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加1mlpbs混匀，然后将组织悬液转入1.5ml无菌离心管中，3000r/min离心10min，取上清转入另一无菌离心管中，编号备用。

(2)dna的提取

于750μltrizol裂解液中加入待测样品200μl，混匀，室温静置5min后，再加入200μl氯仿，振荡混匀，于4℃12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μl异丙醇(-20℃预冷)，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μl75％depc-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于室温干燥后加入11μldepc-h2o溶解，备用。

(3)荧光pcr反应与结果分析

分别取引物探针混合液3μl、pcr反应液16μl、taq酶1μl配制成反应体系。

取阴性对照(n)、标本(s1、s2、s3)、含pcv-2、pcv-3目的基因的阳性对照(p)各5μl，分别加入反应体系中使用市售的荧光定量pcr仪(如vii7)进行pcr扩增。pcr循环条件是：94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。

整个反应共需58min，反应结束后保存检测数据文件。根据pcr扩增结果所得到的曲线，分析实验结果，结果如图9所示。检测结果表明，设定的对照全部成立；fam检测通道，s1、s2、s3份样品的ct值分别为25.82、31.84、none，s1、s2样品的ct值均小于35，且出现典型的s型扩增曲线，表明s1、s2样品中均有pcv-2核酸阳性。hex检测通道，s1、s2、s3份样品的ct值分别为24.16、none、39.63，只有s1样品的ct值小于35，且出现典型的s型扩增曲线，表明s1样品中有pcv-3核酸阳性。

对比例

(1)特异性引物和探针的设计

针对genbank中pcv2的保守基因orf1和pcv3的保守基因orf1的保守序列分别设计不同于上述实施例的特异性引物和探针，如下表2所示，按照以下序列，合成特异性荧光rt-pcr引物和探针。以depc-h2o稀释引物至10μm，-20℃保存备用。

表2引物和探针组合

上述pcv2-f2～pcv3-p2的核苷酸序列分别如序列表中seqidno:7～12所示。

(2)标准曲线的建立

使用实施例2建立和优化的体系进行标准曲线的建立，建立方法同实施例3。结果显示：

以组合2建立的双通道荧光rt-pcr方法，出现典型的s型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与ct值呈现具有较好的线性范围，斜率接近-2.95，相关系数r²为0.983(见图3、4)。

根据ct值和标准曲线即可对样品进行准确定量。

(3)特异性和敏感性试验

①特异性试验

具体操作步骤同实施例4，结果显示：

组合2的荧光rt-pcrpcv2和pcv3目的基因的阳性质粒在fam和hex通道均出现s型扩增曲线。伪狂犬病毒(prv)疫苗株也有扩增曲线，出现非特异性扩增；而猪细小病毒(ppv)疫苗株、猪瘟病毒(csfv)疫苗株、蓝耳病病毒(prrsv)疫苗株、乙型脑炎病毒(jev)疫苗株、布鲁氏菌抗原没有出现特异性扩增曲线(见图6)，说明所建立的双通道荧光pcr的特异性不好。

由此可见，组合2的荧光rt-pcr特异性差于组合1的荧光rt-pcr特异性。

②敏感性试验

具体操作步骤同实施例4，结果显示：

组合2的荧光rt-pcr方法，以引物(pcv2-f2和pcv2-r2)和探针pcv2-p2建立的检测pcv-2的荧光pcr方法的最低检测限约为3.1×10²拷贝/μl(见图8)，以引物(pcv3-f2和pcv3-r2)和探针pcv3-p2建立的检测pcv-3的荧光pcr方法的最低检测限约为3.1×10²拷贝/μl(见图8)。由此可见，组合2的荧光rt-pcr方法的检测限远高于组合1。

sequencelisting

<110>上海市动物疫病预防控制中心

<120>一种用于检测猪圆环病毒2型和3型的试剂盒、引物对、探针及方法

<130>p180115278c

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