DNO:1中的氨基酸序列，其序列为：Val-Asn-P ro_Lys-Leu-Leu-Ser-Hi s-Ser-Leu-Leu-Val-Thr-Leu-Arg-Ser-Hi s_Leu〇
[0038] 序列特征：长度为18,类型为氨基酸序列，链型为直链，人工合成。
[0039] 本实施例抗菌肽HJH-3产品是采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相法合成，最 终得到的抗菌肽HJH-3经高效液相色谱分析，其纯度多95%。
[0040] 实施例2:本发明产品抗菌肽HJH-3的应用实施：
[0041] 本发明所得产品抗菌肽HJH-3抗菌活性的检测：
[0042]1、抗菌肽HJH-3对标准菌株抑菌活性测定：
[0043] 实验材料：受试菌株为大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213和白色念 珠菌ATCC90029 (受试菌株均购自南京便诊生物科技有限公司），采用平板扩散法测定人工 合成的抗菌肽HJH-3的抑菌活性。
[0044] 将上述3种测试菌种涂布在已灭菌的含营养物质的下层琼脂培养基【琼脂培养基 是由10mL胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤（购自北京索莱宝科技有限公司）、10g琼脂（sigma A-6013)和1L蒸馏水配制而成，其pH7. 2)】上，用打孔器打孔，孔径约2mm，酒精灯稍加热 使琼脂融化封底，用移液器向每孔中加入5μL、浓度为0. 8μg/mL的本发明合成的抗菌肽 HJH-3 ;阳性对照采用通用的抗生素：多粘霉素B(购自北京索莱宝科技有限公司）针对革 兰阴性菌，尼生素（购自北京索莱宝科技有限公司）针对革兰阳性菌，制霉素（购自北京索 莱宝科技有限公司）针对白色念珠菌；阴性对照采用灭菌蒸馏水。
[0045] 将平板静置lh，以使测试液扩散入琼脂中。然后，再添加一层琼脂培养基（50°C左 右，营养成分同下层培养基），平板在37°C培养过夜，记录孔周边的透明圈的直径，每个菌 种重复测定三次，计算平均值，结果详见表1。
[0046] 表1抗菌肽类似物HJH-3抗菌活性分析结果
[0047]
[0048] 由表1抗菌活性检测结果显示：本发明产品抗菌肽HJH-3对上述三种测试菌种都 具有较强的抗菌活性。因此，本发明产品抗菌肽HJH-3可望在治疗动物细菌性疾病和真菌 性疾病药物方面有着很好的应用前景；根据已知抗菌肽的一般特性，抗菌肽类似物HJH-3 在抗菌药物的应用以及饲料防霉和牛奶保鲜等方面也具有一定的应用潜能。
[0049] 2、抗菌肽HJH-3最小抑菌浓度的测定：
[0050] 测试菌株在TSB液体培养基（购自Solarbio公司即北京索莱宝科技有限公司） 中过夜扩大培养，并在〇D6。。处测定培养菌液的0D值，当菌液的0D值达到0. 6~0. 8时，将 培养的菌液在6000r/min条件下离心lOmin，离心后弃上清，收集菌体沉淀，然后用等体积 0. 01MPBS重悬细菌；再用MH培养基将待测细菌液稀释到2X106CFU/ml。用去离子水稀释 抗菌肽溶液浓度为31. 25μg/ml~2mg/ml。于细胞培养板，各孔分别添加50μ1不同浓度 抗菌肽HJH-3稀释液和50μ1稀释菌液，每个浓度重复实验3个孔，37°C培养16~20h，以 小孔内细菌完全不生长的浓度（肉眼未见孔底部有混浊现象）即为抗菌肽HJH-3最小抑菌 浓度，结果详见表2。
[0051] 表2不同浓度下细菌生长情况
[0052]
[0053] 注表示没有细菌生长；" + "表示有细菌生长
[0054] 由表2可以看出：本发明产品抗菌肽HJH-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念 珠菌的最小抑菌浓度分别〇· 25mg/mL、0. 25mg/mL和0· 5mg/mL。
[0055] 本发明产品抗菌肽HJH-3的溶血活性检测：
[0056] 取新鲜牛血液50mL，在3000rpm下离心20min，弃上清，以等渗PBS缓冲液洗涤红 细胞，反复离心三次，至上清为无色、透明，制备成牛红细胞悬液；取1. 5mL离心管5只，编号 1~5 ;1~3号管分别添加本发明抗菌肽HJH-3干粉2mg、lmg、0. 5mg，各管分别添加0. 01M PBS(pH7. 2)缓冲液800μL。4号管添加800μLPBS缓冲液，为阴性对照组；5号管添加 800μL、浓度为1 %的TritonX-100去离子水稀释液（可使红细胞完全溶血），为阳性对照 组。1~5每管添加200μL红细胞悬液。静置3h后，将1~5管在1500r/min条件下离心 lOmin，分别取上清150μL至微量板进行吸光度测定；其中，对阳性样品进行全波长扫描， 以确定牛血红蛋白最大吸收波长。并以最大吸收波长测定各样品吸收值，计算公式HD=(Α 样-Α阴V(A阳-Α阴）X100%计算溶血度。
[0057] 结果显示：血红蛋白在414nm波长处出现明显的吸收峰。采用红细胞计数法对使 用的红细胞进行计数，结果显示红细胞的浓度为4. 8X1013个/ml，抗菌肽浓度为2mg/mL的 条件下，抗菌肽HJH-3红细胞的溶血率与阴性对照的溶血率相当，说明本发明所得抗菌肽 HJH-3对红细胞的渗透脆性可以忽略不计。
[0058] 本发明产品抗菌肽HJH-3临床分离耐药菌株的抑菌活性测定：
[0059] 采用平板扩散法测定人工合成的抗菌肽HJH-3的抑菌活性（受试菌株为本实验从 临床中分离的抗大肠杆菌耐药菌株（庆大霉素、氟苯尼考高耐菌株）、金黄色葡萄球菌耐药 菌株（甲氧西林高耐菌株））。测试方法同上述抗菌活性检测方法。检测结果详见附图3。
[0060] 由图3可知：使用5μ L、1μ g/mL的合成抗菌肽HJH-3能明显抑制上述两种耐药菌 株的生长。
[0061] 本发明产品抗菌肽HJH-3的细菌形态结构影响的观察：
[0062] 抗菌肽HJH-3作用后大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌三种菌悬液的配 制：根据上述抗菌肽HJH-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度分别 为0· 25mg/mL、0. 25mg/mL和0· 5mg/mL，采用ρΗ7· 2、10mM的PBS缓冲液将抗菌肽HJH-3分别 配制对应的3X0. 25mg/mL、3X0. 25mg/mL和3X0. 5mg/mL的三种抗菌肽HJH-3溶液，即针 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌三种菌体，采用PH7. 2、10mM的PBS缓冲液将抗 菌肽HJH-3分别配制成对应的0. 75mg/mL、0. 75mg/mL和1. 5mg/mL三种抗菌肽溶液；然后分 别吸取2mL新鲜培养至对数期的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，将三种菌体分 别在6000r/min条件下离心15min，离心后所得三种菌体用对应等体积0. 75mg/mL、0. 75mg/ mL和1. 5mg/mL的三种抗菌肽溶液进行重新悬浮，悬浮后的三种菌体在37°C条件下孵育 30min，得到三种抗菌肽HJH-3作用后的大肠杆菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和白色念 珠菌菌悬液；
[0063] 以正常生长、不添加抗菌肽的三种细菌（即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念 珠菌）为正常对照；取三种对数生长期的正常培养细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色 念珠菌以及抗菌肽HJH-3作用后的三种菌悬液各3mL，首先在3000r/min条件下离心5min， 弃上清；然后分别采用pH7.2、10mM的PBS缓冲溶液洗涤菌体三次，最后分别采用3mL、5% 的戊二醛溶液重新悬浮，悬浮后所得菌体分别在4°C条件下固定24h;然后分别在3000r/ min条件下离心lOmin，收集菌体沉淀，接着分别采用30%~100%PBS溶液稀释的乙醇进 行梯度脱水（每次脱水时间为20min)，100%的乙醇脱水两次（每次脱水时间为20min)，最 后一次脱水完成后，将所得菌液分别滴加在圆形盖玻片上，然后进行真空冷冻干燥，干燥后 经离子溅射仪溅射金，最后于扫描电镜下观察样品表面结构变化，详见附图4。
[0064] 由附图4可知：与正常的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌形态结构相比， 经过血红蛋白抗菌肽处理的各种细菌发生较大的变化：大肠杆菌形态发生弯曲、变形、细胞 膜出现孔洞结构；金黄色葡萄球菌细胞膜发生明显的破碎，且细菌大小发生不均匀的变化， 细胞膜的完整性受到破坏；白色念珠菌细胞膜表面发生皱缩、脱落，细胞发生裂解。由此可 以表明，本发明产品抗菌肽HJH-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有高效的 抗菌作用。
[0065] 综上所述，本发明多肽产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴 性菌、真菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳 性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。
【主权项】
1. 一种抗菌肽HJH-3,其特征在于：所述抗菌肽HJH-3的氨基酸序列为缬氨酸-天冬酰 胺-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-缬 氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸-亮氨酸（SEQ ID NO :1)。2. 根据权利要求1所述的抗菌肽HJH-3,其特征在于：所述抗菌肽HJH-3为直链多肽， 含有18个氨基酸残基，2077. 52Da，等电点为11. 05。3. -种权利要求1所述的抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或 /和真菌疾病药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌肽HJH-3及其应用。所述抗菌肽HJH-3的氨基酸序列为缬氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸-亮氨酸。该抗菌肽HJH-3为直链多肽，含有18个氨基酸残基，2077.52Da，等电点11.05。本发明产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。
【IPC分类】A61P31/10, A61P31/04, C07K7/08, A61K38/10
【公开号】CN105237626
【申请号】CN201510679292
【发明人】胡建和, 徐彦召, 王青, 杭柏林, 孙亚伟, 张庆华
【申请人】河南科技学院
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月19日